苦苣苔科植物超低溫保存方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供苦苣苔科植物超低溫保存方法，利用葉圓片法誘導(dǎo)不定芽后通過(guò)微滴玻璃化法進(jìn)行超低溫保存。將圓葉唇柱苣苔(Chirita dielsii)、美麗唇柱苣苔(Chirita speciosa)、吊石苣苔(Lysionotus pauciflorus vac.Pauciflorus)、齒葉吊石苣苔(Lysionotus serratus var.serratus)和保山吊石苣苔(Lysionotus sulphureoides)的葉圓片誘導(dǎo)不定芽后進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)、裝載處理、植物玻璃化溶液處理。超低溫保存的葉圓片在經(jīng)過(guò)恢復(fù)培養(yǎng)后可以再生完整植株。本發(fā)明提供的圓葉唇柱苣苔、美麗唇柱苣苔、吊石苣苔、齒葉吊石苣苔和保山吊石苣苔超低溫保存方法簡(jiǎn)便易行、穩(wěn)定可靠，超低溫保存葉圓片再生的后植株生長(zhǎng)狀態(tài)良好。
【專(zhuān)利說(shuō)明】苦苣苔科植物超低溫保存方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明屬于植物種質(zhì)資源的超低溫保存【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及苦苣苔科植物超低溫保存方法以及再培養(yǎng)方法。

【背景技術(shù)】
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[0002]苦苣苔科在全球有大約133屬3000種。廣泛分布在非洲、中南美洲、東亞、南亞、南歐和大洋洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)。中國(guó)苦苣苔科植物有56屬和約442種，其中25屬和354種為中國(guó)特有。
[0003]中國(guó)苦苣苔科分布的狹域性，生境的隱蔽性和花期的不一致性，多數(shù)種采集難度較大(中國(guó)苦苣苔科植物)?？嘬奶浦参锓N子微小，一些種類(lèi)結(jié)實(shí)困難(文和群)。一些瀕危種的數(shù)量非常少，其種子的收集和保存更加困難?？嘬奶浦参锊糠址N類(lèi)對(duì)環(huán)境條件要求高，適生的溫度范圍、濕度范圍和土壤酸堿度范圍比較小。在北方地區(qū)引種栽培過(guò)程中，一些種類(lèi)存活比較困難。由于分布的狹域性、生境的隱蔽性和花期的不一致性，多數(shù)種采集難度較大。在中國(guó)苦苣苔科植物中，約有25%的屬和30%的種知道20世紀(jì)50年代以后才陸續(xù)被采集和命名。例如，報(bào)春苣苔屬在2010年以后被描述的種就至少包括:Primulina mabaensis、Primulina chizhouensis、Primulina debaoensis、Primulinaguangxiensis、Primulina bullata、Primulina huaijiensis>Primulina qingyuanensis、Primulina beiliuensis、Primulina purpurea、Primulina yangshuoensis、Primulinafengshanensis、Primulina lutvittata、Primulina sinovietnamica 和 Primulinacardaminifolia。而唇柱苣苔屬在2010年以后被描述的新種至少包括了:Chiritagrandibracteata、Chirita lutea、Chirita Iuochengensis 和 Chirita luzhaiensis。上述最近被發(fā)現(xiàn)和描述的物種無(wú)論其分類(lèi)學(xué)地位是否成立都代表了某些特殊的性狀，這對(duì)于不斷追求新奇感的園藝產(chǎn)業(yè)來(lái)說(shuō)都是重要的育種資源。
[0004]苦苣苔科植物的超低溫保存研究比較有限。Moges等在2004年以離體莖尖為外植體，通過(guò)包埋脫水、玻璃化和包埋玻璃化途徑建立了非洲紫羅蘭(Saintpaulia 1nanthaWendl)的超低溫保存體系。在包埋脫水中，以0.3M蔗糖預(yù)培養(yǎng)2天后進(jìn)行空氣脫水(airdehydrat1n)或娃膠干燥脫水,分別可以得到75%和30%的再生率。在玻璃化程序中不同的滲透保護(hù)會(huì)對(duì)再生率產(chǎn)生影響，而以經(jīng)典的滲透保護(hù)溶液效果最佳，可獲得55%的再生率。在包埋脫水方法中存活率和再生率可以分別達(dá)到80%。李佳以煙葉唇柱苣苔(Chiritaheterotricha Merr.)和藥用唇柱苣苔(Chirita medica D.Fang ex ff.T.Wang)葉片外植體為材料，經(jīng)過(guò)自然干燥、裝載液處理、玻璃化溶液處理、液氮冷凍保存，成功實(shí)現(xiàn)了玻璃化超低溫冷凍保存，經(jīng)過(guò)液氮冷凍保存后的材料可以繼續(xù)分化、生長(zhǎng)。存活率分別達(dá)到50.0%和27.8%。湯正輝以離體葉圓片為外植體，建立了煙葉唇柱苣苔、菱葉唇柱苣苔、半蒴苣苔玻璃化法超低溫保存方案。繼代培養(yǎng)20天的外植體在室溫下干燥處理3天以誘導(dǎo)其脫水耐受性，隨后以一個(gè)經(jīng)典的玻璃化超低溫保存程序進(jìn)行超低溫保存。在優(yōu)化的條件下，外植體的凍存后的存活率可以分別達(dá)到50.0%、38.9%和28.9%，但存活的外植體僅有1_2個(gè)芽可以繼續(xù)分化和生長(zhǎng)。同時(shí)指出，葉片外植體在不定芽形成以后再加入玻璃化程序，其凍存后再生率很低。但實(shí)驗(yàn)中的液氮凍存時(shí)間為6小時(shí)，凍存8小時(shí)后的外植體解凍后沒(méi)有繼續(xù)存活。


【發(fā)明內(nèi)容】

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[0005]本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足之處，提供利用葉圓片的苦苣苔科植物的高效超低溫保存方法。該方法簡(jiǎn)便易行，穩(wěn)定可靠，保存后苦苣苔科植物恢復(fù)生長(zhǎng)狀況良好，植株再生率大幅提高。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案:
[0007]苦苣苔科植物超低溫保存方法，該方法包括如下步驟:
[0008](I)在無(wú)菌條件下取苦苣苔科植物葉圓片，將葉圓片轉(zhuǎn)入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基完成不定芽誘導(dǎo)；
[0009](2)對(duì)完成不定芽誘導(dǎo)的葉圓片進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)；
[0010](3)取完成步驟(2)的葉圓片，轉(zhuǎn)入裝有裝載液的冷凍管中，在25°C下裝載處理20分鐘；
[0011](4)步驟(3)中的葉圓片置于植物玻璃化溶液中，冷凍處理；
[0012](5)步驟(4)處理完后的葉圓片投入液氮中保存。
[0013]根據(jù)所述的保存方法，其中所述步驟(I)的苦苣苔科植物為苦苣苔科植物唇柱苣苔、美麗唇柱苣苔、吊石苣苔、齒葉吊石苣苔、保山吊石苣苔，取上述植物的組培苗葉片，用打孔器打成3mm的葉圓片，進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。
[0014]根據(jù)所述的保存方法，其中所述步驟(2)的預(yù)培養(yǎng)是將所述不定芽在含有0.3M的蔗糖的MS液體培養(yǎng)基中，在25°C下暗培養(yǎng)24小時(shí)。
[0015]根據(jù)所述的保存方法，其中所述步驟(3)中所述的裝載液為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加2M甘油和0.4M蔗糖。
[0016]根據(jù)所述的保存方法，其中所述步驟(4)中的植物玻璃化溶液為PVS3溶液，由MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加50% (w/v)甘油和50% (w/v)蔗糖。
[0017]根據(jù)所述的保存方法，其中所述步驟(4)中的植物玻璃化溶液處理時(shí)間為:圓葉唇柱苣苔、美麗唇柱苣苔、吊石苣苔、齒葉吊石苣苔、保山吊石苣苔分別經(jīng)PVS3處理40、40、60、80、80 分鐘。
[0018]根據(jù)所述的保存方法，其中所述步驟(3)為:將所述葉圓片轉(zhuǎn)移到25°C下裝有植物玻璃化溶液冷凍管中，每管裝有10個(gè)葉圓片。
[0019]根據(jù)所述的保存方法，其中所述步驟(4)冷凍處理是先將所述的葉圓片轉(zhuǎn)移至放無(wú)菌鋁箔條上，然后將所述鋁箔條直接插入液氮。
[0020]根據(jù)所述的保存方法，將經(jīng)過(guò)步驟(5)保存后的苦苣苔科植物進(jìn)行再培養(yǎng)，將超低溫保存的苦苣苔科植物的葉圓片進(jìn)行解凍，再經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)，所述的解凍為將鋁箔條從液氮中取出，并快速插入培養(yǎng)皿中裝有1ml MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加1.2M蔗糖的卸載溶液里，在25°C下處理20分鐘。
[0021]根據(jù)所述的保存方法，其中所述的恢復(fù)培養(yǎng)是將解凍后的葉圓片轉(zhuǎn)入MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加0.09M蔗糖、0.5mg F1BA和2.Sgr1Phytagel的恢復(fù)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，首先在25°C下暗培養(yǎng)7天，然后在25°C，光周期光照/黑暗14/10小時(shí)，光強(qiáng)40μ mol JiT2iT1下培養(yǎng)。
[0022]本發(fā)明提供的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)了五種苦苣苔科植物的超低溫保存，該方法簡(jiǎn)便易行，穩(wěn)定可靠，保存后這五種苦苣苔科植物恢復(fù)生長(zhǎng)狀況良好，植株再生率大幅提高。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1.圓葉唇柱苣苔超低溫保存莖尖和葉圓片的再生情況。(al)超低溫保存莖尖再生單個(gè)植株(標(biāo)尺為Imm)。(a2)超低溫保存莖尖再生一簇植株(標(biāo)尺為Imm)。(bl)超低溫保存葉圓片再生單個(gè)植株(標(biāo)尺為Imm)。(b2)超低溫保存葉圓片再生一簇植株(標(biāo)尺為Imm)。(Cl)移栽3周的圓葉唇柱苣苔超低溫再生植株(標(biāo)尺為Icm)。(c2)超低溫再生植株在移栽后月的植株開(kāi)花(標(biāo)尺為Icm)。
[0024]圖2.美麗唇柱苣苔超低溫保存葉圓片的再生情況。(a，b)超低溫保存葉圓片解凍后恢復(fù)培養(yǎng)6周再生情況(標(biāo)尺為Imm)。(c)以超低溫保存葉圓片重新建立起來(lái)的美麗唇柱苣苔組培系(標(biāo)尺為Icm)。(d)超低溫保存葉圓片再生植株移栽溫室(標(biāo)尺為2cm)。
[0025]圖3.吊石苣苔超低溫保存后再生植株。(a)以超低溫保存葉圓片重新建立起來(lái)的組織培養(yǎng)體系(標(biāo)尺為Icm)。(b)超低溫保存再生植株移栽后3個(gè)月(標(biāo)尺為2cm)。(c)超低溫保存再生植株移栽后7個(gè)月(標(biāo)尺為2cm)。
[0026]圖4.齒葉吊石苣苔超低溫保存葉圓片的再生情況。(a)經(jīng)過(guò)超低溫保存處理但沒(méi)有再生的葉圓片(標(biāo)尺為1_)。(b)超低溫保存葉圓片在恢復(fù)培養(yǎng)8周后再生植株(標(biāo)尺為2_)。(c)以超低溫保存葉圓片重新建立起來(lái)的保山吊石苣苔組培系(標(biāo)尺為lcm)。(d)超低溫保存葉圓片再生植株移栽溫室(標(biāo)尺為lcm)。
[0027]圖5.保山吊石苣苔超低溫保存葉圓片的再生情況。(a，b)超低溫保存葉圓片在恢復(fù)培養(yǎng)8周后再生植株(標(biāo)尺為2_)。(C)以超低溫保存葉圓片重新建立起來(lái)的保山吊石苣苔組培系(標(biāo)尺為lcm)。(d)超低溫保存葉圓片再生植株移栽溫室(標(biāo)尺為2cm)。
[0028]圖6.PVS2處理時(shí)間對(duì)圓葉唇柱苣苔莖尖超低溫保存再生率的影響。莖尖經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)和滲透保護(hù)后以PVS2在0°C下處理一定時(shí)間。PVS2處理結(jié)束后按照微滴玻璃化程序進(jìn)行冷凍和解凍。
[0029]圖7.PVS3處理時(shí)間對(duì)圓葉唇柱苣苔莖尖超低溫保存再生率的影響。莖尖經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)和滲透保護(hù)后以PVS3在25°C下處理一定時(shí)間。PVS3處理結(jié)束后按照微滴玻璃化程序進(jìn)行冷凍和解凍。
[0030]圖8.PVS3處理時(shí)間對(duì)圓葉唇柱超低溫保存葉圓片再生率的影響。葉圓片經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)和滲透保護(hù)后以PVS3在25°C下處理一定時(shí)間。PVS3處理結(jié)束后按照微滴玻璃化程序進(jìn)行冷凍和解凍。
[0031]圖9.PVS3處理時(shí)間對(duì)美麗唇柱超低溫保存葉圓片再生率的影響。葉圓片經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)和滲透保護(hù)后以PVS3在25°C下處理一定時(shí)間。PVS3處理結(jié)束后按照微滴玻璃化程序進(jìn)行冷凍和解凍。
[0032]圖10.PVS3處理時(shí)間對(duì)吊石苣苔超低溫保存葉圓片再生率的影響。葉圓片經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)和滲透保護(hù)后以PVS3在25°C下處理一定時(shí)間。PVS3處理結(jié)束后按照微滴玻璃化程序進(jìn)行冷凍和解凍。
[0033]圖11.PVS3處理時(shí)間對(duì)齒葉吊石苣苔超低溫保存葉圓片再生率的影響。葉圓片經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)和滲透保護(hù)后以PVS3在25°C下處理一定時(shí)間。PVS3處理結(jié)束后按照微滴玻璃化程序進(jìn)行冷凍和解凍。
[0034]圖12.PVS3處理時(shí)間對(duì)保山吊石苣苔超低溫保存葉圓片再生率的影響。葉圓片經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)和滲透保護(hù)后以PVS3在25°C下處理一定時(shí)間。PVS3處理結(jié)束后按照微滴玻璃化程序進(jìn)行冷凍和解凍。

【具體實(shí)施方式】
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[0035]以下結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明的方法、步驟或條件所做的修改或替換，均應(yīng)屬于本發(fā)明的范圍。
[0036]若未特別指明，下述實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0037]本發(fā)明的技術(shù)方案總體包括如下步驟:
[0038](I)利用打孔器在無(wú)菌條件下獲取直徑為3mm的圓葉唇柱苣苔、美麗唇柱苣苔、吊石苣苔、齒葉吊石苣苔、保山吊石苣苔葉圓片。將葉圓片轉(zhuǎn)入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基完成不定芽誘導(dǎo)。
[0039](2)對(duì)完成不定芽誘導(dǎo)的葉圓片進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。
[0040](3)取完成步驟(2)的葉圓片，轉(zhuǎn)入裝有裝載液的冷凍管中，在25°C下裝載處理20分鐘。
[0041](4)步驟(3)中的葉圓片置于裝有植物玻璃化溶液溶液的冷凍管中，在冰上處理一定時(shí)間。
[0042](5)步驟(4)中處理完后的葉圓片轉(zhuǎn)入無(wú)菌鋁箔片后直接投入液氮中，待降溫過(guò)程完成后轉(zhuǎn)入凍存管進(jìn)行超低溫保存。
[0043]上述方法中，所述步驟(I)為將五種苦苣苔科植物的組培苗葉片用打孔器打成3mm的葉圓片并進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。所述步驟(2)為對(duì)完成不定芽誘導(dǎo)的葉圓片進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。所述預(yù)培養(yǎng)處理可以減少細(xì)胞水分含量，提高細(xì)胞可溶性糖含量，提高脫水耐受性，從而提高莖尖抗凍力，減少或避免冷凍傷害，達(dá)到提高存活率的目的。預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基主要是添加蔗糖的培養(yǎng)基。步驟(2)所述的預(yù)培養(yǎng)方法是將所述不定芽在含有0.3M的蔗糖的MS液體培養(yǎng)基中，在25°C下暗培養(yǎng)24小時(shí)。由于植物玻璃化溶液濃度較高，將不定芽轉(zhuǎn)入植物玻璃化溶液中時(shí)會(huì)使細(xì)胞快速脫水，容易對(duì)莖尖造成傷害，因而，所述不定芽在玻璃化保護(hù)職權(quán)需要進(jìn)行裝載。步驟(3)中所述的預(yù)處理方法是將經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后的不定芽用轉(zhuǎn)載溶液(loading solut1n)中處理20分鐘。轉(zhuǎn)載溶液的組成為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加2M甘油和0.4M蔗糖。步驟(4)所述的植物玻璃化溶液為PVS3溶液的組成是MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加50%(w/v)甘油和50% (w/v)蔗糖。步驟(4)所述的植物玻璃化溶液處理時(shí)間，圓葉唇柱苣苔和美麗唇柱苣苔經(jīng)PVS3處理40分鐘，吊石苣苔、齒葉吊石苣苔和保山吊石苣苔經(jīng)PVS3處理80分鐘。所述步驟(4)為:將所述不定芽轉(zhuǎn)移到室溫放置的裝有植物玻璃化溶液冷凍管中，每管裝有10個(gè)莖尖。所述步驟(5)為:先將所述的5個(gè)葉圓片轉(zhuǎn)入無(wú)菌鋁箔條上，然后將所述鋁箔條直接投入放置在液氮中的凍存管中，待降溫過(guò)程完成后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐進(jìn)行超低溫保存。本發(fā)明還提供了一種超低溫保存后的苦苣苔科植物的再培養(yǎng)方法，采用上述方法進(jìn)行超低溫保存，現(xiàn)將超低溫保存的五種苦苣苔科植物的葉圓片進(jìn)行解凍，再經(jīng)過(guò)培養(yǎng)即可得到這五種苦苣苔科植物的植株。所述的解凍過(guò)程為將鋁箔條從液氮中取出，并快速插入6cm直徑培養(yǎng)皿中的1ml卸載溶液(unloading solut1n)里,并在25°C下處理20分鐘。卸載溶液的組成是MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加1.2M蔗糖。在卸載溶液處理結(jié)束后，將葉圓片轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基?；謴?fù)培養(yǎng)基的組成是MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加0.09M蔗糖、0.5mg F1BA和2.Sgr1PhytageK解凍的不定芽首先在25°C下暗培養(yǎng)7天，至不定芽返綠并有萌動(dòng)跡象時(shí)轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基中，在25°C，光周期14/10小時(shí)(光照/黑暗)，光強(qiáng)40 μ mol IrT2iT1下培養(yǎng)。
[0044]實(shí)施例1:
[0045]五種苦苣苔的超低溫保存:
[0046]實(shí)驗(yàn)材料:五種苦苣苔科植物圓葉唇柱苣苔、美麗唇柱苣苔、吊石苣苔、齒葉吊石苣苔和保山吊石苣苔。
[0047]預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基:添加0.3M蔗糖MS的液體培養(yǎng)基；
[0048]裝載溶液:MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加2M甘油和0.4M蔗糖；
[0049]植物玻璃化溶液PVS3:MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加50% (w/v)甘油和50% (w/v)蔗糖；
[0050]恢復(fù)培養(yǎng)基:MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加0.09M蔗糖、0.5mg F1BA和2.Sgr1Phytagel (植物凝膠)。
[0051]方法:
[0052]選取完成不定芽誘導(dǎo)的圓葉唇柱苣苔葉圓片，在蔗糖濃度為0.3M的MS培養(yǎng)基暗環(huán)境下預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)，將莖尖在裝載溶液中25°C處理20分鐘，再轉(zhuǎn)移至植物玻璃化溶液PVS3中25°C下處理40分鐘。然后將葉圓片轉(zhuǎn)移到無(wú)菌鋁箔條上，用一把細(xì)鑷子將鋁箔條直接插入液氮，待不再有氣泡產(chǎn)生時(shí)，將鋁箔條轉(zhuǎn)入放置在液氮中的凍存管，投入液氮中保存即可。
[0053]選取完成不定芽誘導(dǎo)的美麗唇柱苣苔葉圓片，在蔗糖濃度為0.3M的MS培養(yǎng)基暗環(huán)境下預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)，將葉圓片在裝載溶液中25°C處理20分鐘，再轉(zhuǎn)移至植物玻璃化溶液PVS3中在25°C下處理80分鐘。然后將葉圓片轉(zhuǎn)移到無(wú)菌鋁箔條上，用一把細(xì)鑷子將鋁箔條直接插入液氮，待不再有氣泡產(chǎn)生時(shí)，將鋁箔條轉(zhuǎn)入放置在液氮中的凍存管，投入液氮中保存即可。
[0054]選取完成不定芽誘導(dǎo)的吊石苣苔葉圓片，在蔗糖濃度為0.3M的MS培養(yǎng)基暗環(huán)境下預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)，將莖尖在裝載溶液中25°C下處理20分鐘，再轉(zhuǎn)移至植物玻璃化溶液PVS3中25°C 60分鐘。然后將葉圓片轉(zhuǎn)移到無(wú)菌鋁箔條上，用一把細(xì)鑷子將鋁箔條直接插入液氮，待不再有氣泡產(chǎn)生時(shí)，將鋁箔條轉(zhuǎn)入放置在液氮中的凍存管，投入液氮中保存即可。
[0055]選取完成不定芽誘導(dǎo)的齒葉吊石苣苔葉圓片，在蔗糖濃度為0.3M的MS培養(yǎng)基暗環(huán)境下預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)，將葉圓片在裝載溶液中25 °C下處理處理20分鐘，再轉(zhuǎn)移至植物玻璃化溶液PVS3中在25°C下處理40分鐘。然后將葉圓片轉(zhuǎn)移到無(wú)菌鋁箔條上，用一把細(xì)鑷子將鋁箔條直接插入液氮，待不再有氣泡產(chǎn)生時(shí)，將鋁箔條轉(zhuǎn)入放置在液氮中的凍存管，每管5個(gè)不定芽，投入液氮中保存即可。
[0056]選取完成不定芽誘導(dǎo)的保山吊石苣苔葉圓片，在蔗糖濃度為0.3M的MS培養(yǎng)基暗環(huán)境下預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)，將葉圓片在裝載溶液中25 °C下處理20分鐘，再轉(zhuǎn)移至植物玻璃化溶液PVS3中在25°C處理80分鐘。然后將葉圓片轉(zhuǎn)移到無(wú)菌鋁箔條上，用一把細(xì)鑷子將鋁箔條直接插入液氮，待不再有氣泡產(chǎn)生時(shí)，將鋁箔條轉(zhuǎn)入放置在液氮中的凍存管，投入液氮中保存即可。
[0057]再培養(yǎng)及存活率統(tǒng)計(jì):
[0058]解凍時(shí)，將鋁箔條從液氮中取出，并快速插入6cm直徑培養(yǎng)皿中的1ml卸載溶液里，并在25°C下處理20分鐘。在卸載溶液處理結(jié)束后，將葉圓片轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基。解凍的不定芽首先在25°C下暗培養(yǎng)7天，至不定芽返綠并有萌動(dòng)跡象時(shí)轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基中，在25°C,光周期14/10小時(shí)(光照/黑暗)，光強(qiáng)40 μ mol IrTiV1下培養(yǎng)。
[0059]恢復(fù)培養(yǎng)結(jié)果表明:不定芽超低溫保存后再培養(yǎng)后五種苦苣苔科植株恢復(fù)生長(zhǎng)狀況良好(圖1-5)。圓葉唇柱苣苔、美I?唇柱苣苔、吊石苣苔、齒葉吊石苣苔和保山吊石苣苔這五種苦苣苔科植株再生率分別為53.3%,86.7%,70.0%,53.3%,43.3% (圖8-12)。
[0060]實(shí)施例2:
[0061]圓葉唇柱苣苔的超低溫保存一不同植物玻璃化溶液對(duì)保存效果的影響:
[0062]實(shí)驗(yàn)材料:圓葉唇柱苣苔離體莖尖
[0063]預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基:0.3M蔗糖MS的液體培養(yǎng)基；
[0064]裝載溶液:MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加2M甘油和0.4M蔗糖；
[0065]植物玻璃化溶液PVS3:MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加50% (w/v)甘油和50% (w/v)蔗糖；PVS2:MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加15% (w/v)甘油、15%乙二醇、15%二甲基亞砜和0.4M蔗糖。
[0066]恢復(fù)培養(yǎng)基:MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加0.09M蔗糖、0.5mg F1BA和2.Sgr1Phytagel。
[0067]方法:
[0068]選取圓葉唇柱苣苔莖尖，在蔗糖濃度為0.3M蔗糖的MS培養(yǎng)基暗環(huán)境下預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)，用裝載溶液處理在25°C處理20分鐘，再分別經(jīng)過(guò)PVS2和PVS3在25°C下處理20、40和60分鐘。然后將莖尖轉(zhuǎn)移到無(wú)菌鋁箔條上，用一把細(xì)鑷子將鋁箔條直接插入液氮，待不再有氣泡產(chǎn)生時(shí)，將鋁箔條轉(zhuǎn)入放置在液氮中的凍存管，并保持在液氮保存。
[0069]再培養(yǎng)及存活率統(tǒng)計(jì):
[0070]解凍時(shí)，將鋁箔條從液氮中取出，并快速插入6cm直徑培養(yǎng)皿中的1ml卸載溶液里，并在25°C下處理20分鐘。在卸載溶液處理結(jié)束后，將莖尖轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基。解凍的莖尖首先在25°C下暗培養(yǎng)7天，至不定芽返綠并有萌動(dòng)跡象時(shí)轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基中，在25°C，光周期14/10小時(shí)(光照/黑暗)，光強(qiáng)40 μ mol m—Y1下培養(yǎng)。
[0071]恢復(fù)培養(yǎng)結(jié)果表明:圓葉唇柱苣苔超低溫保存莖尖在20-60分鐘PVS2處理下的再生率均不超過(guò)10%，且實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性比較差(圖6)。在PVS3處理20分鐘時(shí)，圓葉唇柱苣苔莖尖的再生率為13% ;當(dāng)PVS3處理時(shí)間延長(zhǎng)到40分鐘時(shí)，圓葉唇柱苣苔莖尖的再生率上升到20% ;當(dāng)PVS3處理60分鐘時(shí)，其莖尖的再生率出現(xiàn)到10% (圖7)。所以在苦苣苔科植物的超低溫保存中PVS3是更為理想的植物玻璃化溶液。
[0072]實(shí)施例3:
[0073]圓葉唇柱苣苔的超低溫保存一外植體不同對(duì)超低溫保存效果的影響:
[0074]實(shí)驗(yàn)材料:圓葉唇柱苣苔。切取葉片繁殖試管苗，獲得莖尖和葉圓片誘導(dǎo)的不定芽。
[0075]預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基:0.3M蔗糖MS的液體培養(yǎng)基；
[0076]裝載溶液:MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加2M甘油和0.4M蔗糖；
[0077]植物玻璃化溶液PVS3:MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加50% (w/v)甘油和50% (w/v)蔗糖；
[0078]恢復(fù)培養(yǎng)基:MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加0.09M蔗糖、0.5mg F1BA和2.Sgr1Phytagel (植物凝膠)。
[0079]方法:
[0080]選取圓葉唇柱苣苔葉圓片上誘導(dǎo)出的不定芽或者莖尖為外植體，在蔗糖濃度為
0.3M蔗糖的MS培養(yǎng)基暗環(huán)境下預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)，用裝載溶液處理在25°C處理20分鐘，再經(jīng)過(guò)PVS3在25°C分別處理20、40和60分鐘。然后將不定芽轉(zhuǎn)移到無(wú)菌鋁箔條上，用一把細(xì)鑷子將鋁箔條直接插入液氮，待不再有氣泡產(chǎn)生時(shí)，將鋁箔條轉(zhuǎn)入放置在液氮中的凍存管，并保持在液氣保存。
[0081]再培養(yǎng)及存活率統(tǒng)計(jì):
[0082]解凍時(shí)，將鋁箔條從液氮中取出，并快速插入6cm直徑培養(yǎng)皿中的1ml卸載溶液里，并在25°C下處理20分鐘。在卸載溶液處理結(jié)束后，將葉圓片轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基。解凍的不定芽首先在25°C下暗培養(yǎng)7天，暗培養(yǎng)棘手后轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基中，在25°C，光周期14/10小時(shí)(光照/黑暗)，光強(qiáng)40 μ mol IrTiV1下培養(yǎng)。
[0083]恢復(fù)培養(yǎng)結(jié)果表明:
[0084]在PVS3處理20分鐘時(shí)，圓葉唇柱苣苔莖尖的再生率為13% ;當(dāng)PVS3處理時(shí)間延長(zhǎng)到40分鐘時(shí)，其莖尖的再生率上升到20% ;當(dāng)PVS3處理時(shí)間進(jìn)一步上升時(shí)，其莖尖的再生率出現(xiàn)了下降，為10% (圖7)。以葉圓片誘導(dǎo)的不定芽為外植體時(shí)，在PVS3處理20分鐘時(shí)，圓葉唇柱苣苔葉圓片的再生率達(dá)到了 43.3% ;當(dāng)PVS3處理延長(zhǎng)到40分鐘時(shí)，其葉圓片的再生率上升到了 53.3% ;在？￥33處理進(jìn)一步延長(zhǎng)到60分鐘時(shí)，其葉圓片的再生率下降為36.7% (圖8)。
[0085]實(shí)施例4:
[0086]圓葉唇柱苣苔的超低溫保存一玻璃化處理時(shí)間對(duì)保存效果的影響:
[0087]植物玻璃化溶液可以是植物細(xì)胞脫水并進(jìn)入細(xì)胞使得細(xì)胞在降溫過(guò)程中玻璃化，有效地保存細(xì)胞結(jié)構(gòu)。但由于植物玻璃化溶液濃度過(guò)高，且低溫保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞有毒害作用，需要嚴(yán)格控制植物玻璃化溶液的處理時(shí)間。在保證有足夠高的成活率的前提下，盡量縮短處理時(shí)間。
[0088]實(shí)驗(yàn)材料:圓葉唇柱苣苔
[0089]預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基:0.3M蔗糖MS的液體培養(yǎng)基；裝載溶液:MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加2M甘油和0.4M蔗糖；
[0090]植物玻璃化溶液PVS3:MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加50% (w/v)甘油和50% (w/v)蔗糖；
[0091]恢復(fù)培養(yǎng)基:MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加0.09M蔗糖、0.5mg F1BA和2.Sgr1Phytagel。
[0092]方法:
[0093]選取完成不定芽誘導(dǎo)的圓葉唇柱苣苔葉圓片，在蔗糖濃度為0.3M蔗糖的MS培養(yǎng)基暗環(huán)境下預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)，用裝載溶液處理在25°C處理20分鐘，再經(jīng)過(guò)PVS3在25°C分別處理20、40和60分鐘。然后將葉圓片轉(zhuǎn)移到無(wú)菌鋁箔條上，用一把細(xì)鑷子將鋁箔條直接插入液氮，待不再有氣泡產(chǎn)生時(shí)，將鋁箔條轉(zhuǎn)入放置在液氮中的凍存管，并保持在液氮保存。
[0094]再培養(yǎng)及存活率統(tǒng)計(jì):
[0095]解凍時(shí)，將鋁箔條從液氮中取出，并快速插入6cm直徑培養(yǎng)皿中的1ml卸載溶液里，并在25°C下處理20分鐘。在卸載溶液處理結(jié)束后，將葉圓片轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基。解凍的不定芽首先在25°C下暗培養(yǎng)7天，暗培養(yǎng)結(jié)束時(shí)轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基中，在25°C，光周期14/10小時(shí)(光照/黑暗)，光強(qiáng)40 μ mol IrTiV1下培養(yǎng)。
[0096]恢復(fù)培養(yǎng)結(jié)果表明:
[0097]在PVS3處理20分鐘時(shí)，圓葉唇柱苣苔葉圓片的再生率達(dá)到了 43.3% ;當(dāng)PVS3處理延長(zhǎng)到40分鐘時(shí)，其葉圓片的再生率上升到了 53.3% ;在PVS3處理進(jìn)一步延長(zhǎng)到60分鐘時(shí)，其葉圓片的再生率下降為36.7% (圖8)。
[0098]實(shí)施例5:
[0099]美麗唇柱苣苔的超低溫保存一玻璃化處理時(shí)間對(duì)保存效果的影響:
[0100]實(shí)驗(yàn)材料:美麗唇柱苣苔
[0101]預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基:0.3M蔗糖MS的液體培養(yǎng)基；
[0102]裝載溶液:MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加2M甘油和0.4M蔗糖；
[0103]植物玻璃化溶液PVS3:MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加50% (w/v)甘油和50% (w/v)蔗糖；
[0104]恢復(fù)培養(yǎng)基:MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加0.09M蔗糖、0.5mg F1BA和2.Sgr1Phytagel。
[0105]方法:
[0106]選取完成不定芽誘導(dǎo)的美麗唇柱苣苔葉圓片，在蔗糖濃度為0.3M蔗糖的MS培養(yǎng)基暗環(huán)境下預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)，用裝載溶液處理在25°C處理20分鐘，再經(jīng)過(guò)PVS3在25°C分別處理20、40和60分鐘。然后將不定芽轉(zhuǎn)移到無(wú)菌鋁箔條上，用一把細(xì)鑷子將鋁箔條直接插入液氮，待不再有氣泡產(chǎn)生時(shí)，將鋁箔條轉(zhuǎn)入放置在液氮中的凍存管，并保持在液氮保存。
[0107]再培養(yǎng)及存活率統(tǒng)計(jì):
[0108]解凍時(shí)，將鋁箔條從液氮中取出，并快速插入6cm直徑培養(yǎng)皿中的1ml卸載溶液里，并在25°C下處理20分鐘。在卸載溶液處理結(jié)束后，將葉圓片轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基。解凍的不定芽首先在25°C下暗培養(yǎng)7天，暗培養(yǎng)結(jié)束時(shí)轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基中，在25°C，光周期14/10小時(shí)(光照/黑暗)，光強(qiáng)40 μ mol IrTiV1下培養(yǎng)。
[0109]恢復(fù)培養(yǎng)結(jié)果表明:
[0110]在PVS3處理為20分鐘時(shí)，超低溫保存葉圓片的再生率為93.3% ;在PVS3處理為40分鐘時(shí)，超低溫保存葉圓片的再生率為86.7% ;而當(dāng)PVS3處理為60分鐘時(shí)，再生率為100% (圖9)。盡管20、40和60分鐘PVS3處理的超低溫保存再生率之間存在差異，但都非常接近和達(dá)到100%，顯示這個(gè)方案對(duì)美麗唇柱苣苔非常高效。在對(duì)美麗唇柱苣苔進(jìn)行以長(zhǎng)期儲(chǔ)存為目標(biāo)的超低溫保存實(shí)驗(yàn)中，PVS3的處理時(shí)間可以選擇20-40分鐘之間的任何時(shí)間點(diǎn)，方便了操作。
[0111]實(shí)施例6:
[0112]吊石唇柱苣苔的超低溫保存一玻璃化處理時(shí)間對(duì)保存效果的影響:
[0113]實(shí)驗(yàn)材料:吊石唇柱苣苔
[0114]預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基:0.3M蔗糖MS的液體培養(yǎng)基；
[0115]裝載溶液:MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加2M甘油和0.4M蔗糖；
[0116]植物玻璃化溶液PVS3:MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加50% (w/v)甘油和50% (w/v)蔗糖；
[0117]恢復(fù)培養(yǎng)基:MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加0.09M蔗糖、0.5mg F1BA和2.Sgr1Phytagel。
[0118]方法:
[0119]選取完成不定芽誘導(dǎo)的吊石苣苔葉圓片，在蔗糖濃度為0.3M蔗糖的MS培養(yǎng)基暗環(huán)境下預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)，用裝載溶液處理在25°C處理20分鐘，再經(jīng)過(guò)PVS3在25°C分別處理40、60和80分鐘。然后將不定芽轉(zhuǎn)移到無(wú)菌鋁箔條上，用一把細(xì)鑷子將鋁箔條直接插入液氮，待不再有氣泡產(chǎn)生時(shí)，將鋁箔條轉(zhuǎn)入放置在液氮中的凍存管，并保持在液氮保存。
[0120]再培養(yǎng)及存活率統(tǒng)計(jì):
[0121]解凍時(shí)，將鋁箔條從液氮中取出，并快速插入6cm直徑培養(yǎng)皿中的1ml卸載溶液里，并在25°C下處理20分鐘。在卸載溶液處理結(jié)束后，將葉圓片轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基。解凍的不定芽首先在25°C下暗培養(yǎng)7天，暗培養(yǎng)結(jié)束時(shí)轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基中，在25°C，光周期14/10小時(shí)(光照/黑暗)，光強(qiáng)40 μ mol IrTiV1下培養(yǎng)。
[0122]恢復(fù)培養(yǎng)結(jié)果表明:
[0123]在PVS3處理為40分鐘時(shí)，超低溫保存葉圓片的再生率為33.3% ;在PVS3處理延長(zhǎng)為60分鐘時(shí)，超低溫保存葉圓片的再生率顯著性的增長(zhǎng)為70.0%;當(dāng)PVS3處理進(jìn)一步延長(zhǎng)到80分鐘時(shí)，再生率有下降達(dá)到15.0% (圖10)。以上結(jié)果表明吊石苣苔葉圓片對(duì)PVS3處理時(shí)間較為敏感。
[0124]實(shí)施例7:
[0125]齒葉吊石唇柱苣苔的超低溫保存一玻璃化處理時(shí)間對(duì)保存效果的影響:
[0126]實(shí)驗(yàn)材料:齒葉吊石唇柱苣苔
[0127]預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基:0.3M蔗糖MS的液體培養(yǎng)基；
[0128]裝載溶液:MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加2M甘油和0.4M蔗糖；
[0129]植物玻璃化溶液PVS3:MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加50% (w/v)甘油和50% (w/v)蔗糖；
[0130]恢復(fù)培養(yǎng)基:MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加0.09M蔗糖、0.5mg F1BA和2.Sgr1Phytagel。
[0131]方法:
[0132]選取完成不定芽誘導(dǎo)的齒葉吊石苣苔葉圓片，在蔗糖濃度為0.3M蔗糖的MS培養(yǎng)基暗環(huán)境下預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)，用裝載溶液處理在25°C處理20分鐘，再經(jīng)過(guò)PVS3在25°C分別處理60、80和100分鐘。然后將不定芽轉(zhuǎn)移到無(wú)菌鋁箔條上，用一把細(xì)鑷子將鋁箔條直接插入液氮，待不再有氣泡產(chǎn)生時(shí)，將鋁箔條轉(zhuǎn)入放置在液氮中的凍存管，并保持在液氮保存。
[0133]再培養(yǎng)及存活率統(tǒng)計(jì):
[0134]解凍時(shí)，將鋁箔條從液氮中取出，并快速插入6cm直徑培養(yǎng)皿中的1ml卸載溶液里，并在25°C下處理20分鐘。在卸載溶液處理結(jié)束后，將葉圓片轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基。解凍的不定芽首先在25°C下暗培養(yǎng)7天，暗培養(yǎng)結(jié)束時(shí)轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基中，在25°C，光周期14/10小時(shí)(光照/黑暗)，光強(qiáng)40 μ mol IrTiV1下培養(yǎng)。
[0135]恢復(fù)培養(yǎng)結(jié)果表明:
[0136]在PVS3處理為60分鐘時(shí)，超低溫保存葉圓片的再生率為33.3% ;在PVS3處理延長(zhǎng)為80分鐘時(shí)，超低溫保存葉圓片的再生率為53.3% ;當(dāng)PVS3處理進(jìn)一步延長(zhǎng)到100分鐘時(shí)，再生率有所下降，達(dá)到36.7% (圖11)。
[0137]實(shí)施例8:
[0138]保山吊石唇柱苣苔的超低溫保存一玻璃化處理時(shí)間對(duì)保存效果的影響:
[0139]實(shí)驗(yàn)材料:保山吊石唇柱苣苔
[0140]預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基:0.3M蔗糖MS的液體培養(yǎng)基；
[0141]裝載溶液:MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加2M甘油和0.4M蔗糖；
[0142]植物玻璃化溶液PVS3:MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加50% (w/v)甘油和50% (w/v)蔗糖；
[0143]恢復(fù)培養(yǎng)基:MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加0.09M蔗糖、0.5mg F1BA和2.Sgr1Phytagel。
[0144]方法:
[0145]選取完成不定芽誘導(dǎo)的保山吊石苣苔葉圓片，在蔗糖濃度為0.3M蔗糖的MS培養(yǎng)基暗環(huán)境下預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)，用裝載溶液處理在25°C處理20分鐘，再經(jīng)過(guò)PVS3在25°C分別處理60、80和100分鐘。然后將不定芽轉(zhuǎn)移到無(wú)菌鋁箔條上，用一把細(xì)鑷子將鋁箔條直接插入液氮，待不再有氣泡產(chǎn)生時(shí)，將鋁箔條轉(zhuǎn)入放置在液氮中的凍存管，并保持在液氮保存。
[0146]再培養(yǎng)及存活率統(tǒng)計(jì):
[0147]解凍時(shí)，將鋁箔條從液氮中取出，并快速插入6cm直徑培養(yǎng)皿中的1ml卸載溶液里，并在25°C下處理20分鐘。在卸載溶液處理結(jié)束后，將葉圓片轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基。解凍的不定芽首先在25°C下暗培養(yǎng)7天，暗培養(yǎng)結(jié)束時(shí)轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基中，在25°C，光周期14/10小時(shí)(光照/黑暗)，光強(qiáng)40 μ mol IrTiV1下培養(yǎng)。
[0148]恢復(fù)培養(yǎng)結(jié)果表明:
[0149]在PVS3處理為60分鐘時(shí)，超低溫保存葉圓片的再生率為26.7% ;在PVS3處理延長(zhǎng)為80分鐘時(shí)，超低溫保存葉圓片的再生率為43.3% ;當(dāng)PVS3處理進(jìn)一步延長(zhǎng)到100分鐘時(shí)，再生率為43.3% (圖12)。
【權(quán)利要求】
1.苦苣苔科植物超低溫保存方法，其特征在于該方法包括如下步驟: (1)無(wú)菌條件下取苦苣苔科植物葉圓片，將葉圓片轉(zhuǎn)入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中完成不定芽誘導(dǎo)； (2)對(duì)完成不定芽誘導(dǎo)的葉圓片進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)； (3)取步驟(2)的葉圓片，轉(zhuǎn)入裝有裝載液的冷凍管中，在25°C下裝載處理20分鐘； (4)步驟(3)中的葉圓片置于植物玻璃化溶液中，冷凍處理； (5)步驟(4)處理完后的葉圓片投入液氮中保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的保存方法，其特征在于，所述步驟(I)的苦苣苔科植物為苦苣苔科植物唇柱苣苔、美麗唇柱苣苔、吊石苣苔、齒葉吊石苣苔、保山吊石苣苔，所述不定芽誘導(dǎo)是取上述植物的組培苗葉片用打孔器打成3_的葉圓片，進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的保存方法，其特征在于，所述步驟(2)的預(yù)培養(yǎng)是將完成不定芽誘導(dǎo)的葉圓片在含有0.3M的蔗糖的MS液體培養(yǎng)基中，25°C下暗培養(yǎng)24小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的保存方法，其特征在于，所述步驟(3)中所述的裝載液為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加2M甘油和0.4M蔗糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的保存方法，其特征在于，所述步驟(4)中的植物玻璃化溶液為PVS3溶液，由MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加50% (w/v)甘油和50% (w/v)蔗糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的保存方法，其特征在于，所述步驟(4)中的植物玻璃化溶液處理時(shí)間為:圓葉唇柱苣苔、美麗唇柱苣苔、吊石苣苔、齒葉吊石苣苔、保山吊石苣苔分別經(jīng)PVS3 處理 40、40、60、80、80 分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的保存方法，其特征在于，所述步驟(3)是將葉圓片轉(zhuǎn)移到25°C下裝有植物玻璃化溶液冷凍管中，每管裝10個(gè)葉圓片。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的保存方法，其特征在于，所述步驟(4)冷凍處理是先將葉圓片轉(zhuǎn)移至無(wú)菌鋁箔條上，然后將所述鋁箔條直接插入液氮。
9.根據(jù)權(quán)利要求1- 8任一項(xiàng)所述的保存方法，其特征在于，將經(jīng)過(guò)步驟(5)保存后的苦苣苔科植物進(jìn)行再培養(yǎng)，將超低溫保存的苦苣苔科植物的葉圓片進(jìn)行解凍，再經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)，所述的解凍為將鋁箔條從液氮中取出，快速插入1ml MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加1.2M蔗糖的卸載溶液里，25°C下處理20分鐘。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的保存方法，其特征在于，所述的恢復(fù)培養(yǎng)是將解凍后的葉圓片轉(zhuǎn)入MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加0.09M蔗糖、0.5mg 1_1BA和2.Sgr1Phytagel的恢復(fù)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，先在25 °C下暗培養(yǎng)7天，后在25°C，光周期光照/黑暗14/10小時(shí)，光強(qiáng)40 μ mo I nT2s_1下培養(yǎng)。
【文檔編號(hào)】A01N3/00GK104430306SQ201410627634
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月10日
【發(fā)明者】李唯奇, 林亮, 袁彬, 王丹丹, 覃香世 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所