變棲克雷伯菌(Klebsiella variicola)SH-1菌株的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及變棲克雷伯菌(Klebsiella variicola)SH-1菌株的應(yīng)用，屬中藥材【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明的生產(chǎn)菌株變棲克雷伯菌(Klebsiella variicola)SH-1，已于2013年8月8日保藏在武漢中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC M 2013367。本發(fā)明的變棲克雷伯菌(Klebsiella variicola)SH-1菌株，用利福平標(biāo)記方法確定能在石斛上定殖，能夠作為制備用于促進(jìn)石斛生長(zhǎng)的制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于具有對(duì)人、畜、農(nóng)作物安全和環(huán)境友好的特點(diǎn)；對(duì)石斛有顯著促生長(zhǎng)效果。CCTCC NO：M 20133672013.08.08
【專利說明】變棲克雷伯菌（Klebsiellavariicola)SH-1菌株的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及變棲克雷伯菌（Klebsiellavariicola)SH-l菌株的應(yīng)用，屬中藥材技 術(shù)領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】：
[0002] 石斛為蘭科石斛屬植物，是一種名貴中草藥，有一定解熱鎮(zhèn)痛作用，能促進(jìn)胃液分 泌，助消化。有增強(qiáng)新陳代謝、抗衰老等作用。屬于多年生附生草本，高30?50厘米。莖叢 生，多節(jié)，節(jié)間長(zhǎng)2.5?3.5厘米。野生石斛多附生于高山巖石或森林中的樹干上。喜溫暖 濕潤(rùn)氣候和半陰半陽的環(huán)境，不耐寒。分布四川、貴州、云南、湖北、廣西、臺(tái)灣等地有栽培。 全年均可采挖，但以秋后采挖者質(zhì)量好。采回后如保存鮮用時(shí)，在春、秋季則應(yīng)及時(shí)栽培于 細(xì)砂石中，放置陰濕處，經(jīng)常澆水使根部保持濕潤(rùn)。在冬天應(yīng)平放于竹筐內(nèi)，上蓋蒲包，但應(yīng) 注意空氣流通。
[0003] 關(guān)于栽培技術(shù)。由于石斛主要栽培于溫室或大棚，其溫度和濕度相對(duì)而言較易控 制，所以用無性繁殖或試管苗快速繁殖技術(shù)已經(jīng)很成熟，在選附主、繁殖、田間管理、防治病 蟲等方面的配套措施也很完善。然而在相同肥水管理?xiàng)l件下，通過使用微生物菌劑促進(jìn)石 斛生長(zhǎng)健壯、根系發(fā)達(dá)、萌蘗多，對(duì)石斛安全生產(chǎn)及可持續(xù)性發(fā)展具有極大的應(yīng)用前景，是 有前途的方法。本發(fā)明涉及施用微生物菌劑促進(jìn)石斛生長(zhǎng)的應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0004] 本發(fā)明的在于提供一種變棲克雷伯菌（Klebsiellavariicola)SH-I菌株的
[0005]應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的生產(chǎn)菌株變棲克雷伯菌（Klebsiellavariicola)SH_l，已于2013年8月 8日保藏在武漢中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為：CCTCCM2013367。保藏單位地址：武 漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。
[0007] 本發(fā)明的變棲克雷伯菌（Klebsiellavariicola)SH_l菌株，用利福平標(biāo)記方法 確定能在石斛上定殖，能夠作為制備用于促進(jìn)石斛生長(zhǎng)的制劑中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：具有對(duì)人、畜、農(nóng)作物安全和環(huán)境友好的特點(diǎn)；對(duì)石斛有顯著 促生長(zhǎng)效果。

【具體實(shí)施方式】：
[0009] 一、菌株的獲得
[0010] 本發(fā)明菌株的獲得方法為常規(guī)方法，具體如下：
[0011] 新鮮鐵皮石斛莖桿采自德宏，滅菌水洗凈晾干后切成小段（1cm)，用70%乙醇表 面消毒5min，然后滅菌水漂洗3次，采用無菌操作技術(shù)縱向剖開莖桿，將剖開的莖桿置于馬 鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)7天，取培養(yǎng)所得的菌液lmL，加到盛有9mL無菌水的試 管中，30°C搖床振蕩培養(yǎng)20min，制成樣品懸浮液。取ImL懸浮液加入盛有9mL無菌水的試 管中進(jìn)行10倍系列稀釋，選擇10-5-10-7的稀釋液分別取0.lmL，在PDA平板上采用稀釋涂 布法分離純化，30°C培養(yǎng)12-24h，挑取菌落形態(tài)不同的單菌落于PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)并 保存?zhèn)溆谩?br> [0012] 篩選：將病原接種在PDA培養(yǎng)基平板中心，用已分離純化出的細(xì)菌做成菌懸液，取 IOOuL菌懸液置于中心四周，28°C培養(yǎng)觀察對(duì)峙培養(yǎng)抑菌情況。將抑制效果明顯的細(xì)菌進(jìn)行 形態(tài)、生理生化鑒定和16SrDNA分析。
[0013] 形態(tài)鑒定：LB固體培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)細(xì)菌，觀察菌落形態(tài)、菌體形態(tài)。
[0014] 生理生化鑒定：參照常用細(xì)菌鑒定手冊(cè)，采用吲哚試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、H2S試驗(yàn)等對(duì)分 離出的細(xì)菌進(jìn)行生理生化檢測(cè)。
[0015] 16SrDNA序列測(cè)定：采用CTAB/NaCl法提取SH-I基因組DNA。用于擴(kuò)增 的引物為 16SrDNA擴(kuò)增通用引物，27F:5 ' -AGAGTITTATCNTGGCTCAG-3 '和 1492R: 5 ' -GGYTACCTTGTTACGACTT-3 '。擴(kuò)增所得PCR產(chǎn)物有上海生工測(cè)序，測(cè)得的序列與 Genbank中已有的16SrDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)。
[0016] 表I.SH-I菌株鑒定的形態(tài)及生理生化特征

【權(quán)利要求】
1.變棲克雷伯菌（Klebsiella variicola)SH-l菌株在制備石斛生長(zhǎng)制劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01P21/00GK104351255SQ201410627779
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年11月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月10日
【發(fā)明者】趙明富, 文國(guó)松, 徐紹忠, 李夢(mèng)嬌 申請(qǐng)人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)