一株殺線蟲(chóng)氨鞘醇桿菌菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株殺線蟲(chóng)氨鞘醇桿菌菌株及其應(yīng)用，屬微生物農(nóng)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。殺線蟲(chóng)氨鞘醇桿菌菌株，該菌株的保藏號(hào)為：CGMCC No.9689。殺線蟲(chóng)氨鞘醇桿菌菌株在制備防治煙草青枯病和三七根腐病菌劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于：1、用M-SX103菌株制備的生防菌劑對(duì)防治煙草青病，三七根腐病的防治效果在67％以上，適用于種子處理，移栽期和成株期。具有產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景的生防菌株，為植物靑枯病和三七根腐病的防治提供了新的微生物資源。2、用殺線蟲(chóng)氨鞘醇桿菌菌株制備的生防菌劑具有成本低、防效高、無(wú)殘留、使用方便,對(duì)人畜安全的特點(diǎn)，是有機(jī)農(nóng)業(yè)種植中防治植物青枯病害的高效生物農(nóng)藥。
CGMCC No 9689
20140918
【專利說(shuō)明】一株殺線蟲(chóng)氨鞘醇桿菌菌株及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
:
[0001]本發(fā)明涉及一株殺線蟲(chóng)氨鞘醇桿菌(Sphingobacterium nematocida)M-SX103菌株及其應(yīng)用，屬微生物農(nóng)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
:
[0002]植物青枯病(Bacterial Wilt)是由青枯勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum)弓丨起的一種世界范圍內(nèi)發(fā)生的毀滅性土傳細(xì)菌性病害，被稱為植物的"癌癥〃，能使植物減產(chǎn)30-100%，可侵染50個(gè)屬的200多種植物，其中危害較重、分布較廣的主要寄主有煙草、番爺、爺子、辣椒等(Hayward, 1991 ;1994)。煙草(Nicotiana tabacum)是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，也是云南省發(fā)展地主經(jīng)濟(jì)的主要支柱產(chǎn)業(yè)之一。煙草青枯病是熱帶、亞熱帶地區(qū)煙草種植區(qū)的重要土傳病害，危害嚴(yán)重，造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大，目前已成為限制煙草種植業(yè)發(fā)展的嚴(yán)重障礙(陳瑞泰等，1997)。三七(Panax notoginseng)是五加科人參屬植物,是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴的道地藥材。三七主產(chǎn)于云南省文山州，是云南獨(dú)具特色的生物資源，也是云南省發(fā)展地方特色經(jīng)濟(jì)的重要支柱產(chǎn)業(yè)之一(Wei et al.，1996)。由青枯病菌引起的三七根腐病(Root-rot disease)是三七種植中的毀滅性病害,其造成的損失占三七全部病害損失的70-85%，已成為制約三七產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的嚴(yán)重障礙(董弗兆等，1998)。植物青枯病和三七根腐病均為土傳病害。至今，對(duì)這兩種病害的防治主要以施用化學(xué)農(nóng)藥為主。由于化學(xué)防治容易造成農(nóng)藥殘留、污染環(huán)境和病原菌產(chǎn)生耐藥性等問(wèn)題，開(kāi)發(fā)生物農(nóng)藥已經(jīng)成為環(huán)保、安全、持效的病害防治的主導(dǎo)措施之一。
[0003]殺線蟲(chóng)氨鞘醇桿菌(Sphingobacteriumnematocida)M_SX103 是 2012 年發(fā)表的新物種，M-SX103菌株為煙草內(nèi)生細(xì)菌，在植物根部有很好的定殖能力。該微生物對(duì)于煙草黑胚病菌(Phytophthora nicotianae)具有拮抗活性,且對(duì)全齒復(fù)活線蟲(chóng)(Panagrellusredivivus)顯示出100%的線蟲(chóng)致死率(Liu et al.，2012)。該微生物對(duì)植物青枯病原菌和三七根腐病的生防特性和防治效果至今未見(jiàn)公開(kāi)報(bào)道。
[0004]參考文獻(xiàn):
[0005]Hayward AC.1991.B1logy and epidem1logy of bacterial wilt caused byRalstonia solanacearum.Annu Rev Phytopathol 29:65—87.
[0006]Hayward AC.1991.The hosts of Pseudomonas solanacearum.1n:BacterialWilt:The Disease and its Causative Agent, Pseudomonas solanacearum.(Eds.HaywardAC and Hartman GL.) CAB Internat1nal, Wallingford, UK.pp.9-24.
[0007]Liu J, Yang LL, Xu CK, Xi JQ, Yang FX, Zhou F, Zhou Y, Mo MH, Li WJ.2012.Sphingobacterium nematocida sp.nov., a nematicidal endophytic bacteriumisolated from tobacc0.1nternat1nal Journal of Systematic and Evolut1naryMicrob1logy 62(8):1809-1813.
[0008]Wei JX, Du YC.1996.Modern Science Research and Applicat1n of Panaxnotoginseng.Yunnan Science and Technology Press, Kunming, China.
[0009]陳瑞泰等.1997.全國(guó)16個(gè)主產(chǎn)煙省(區(qū))煙草侵染性病害調(diào)查報(bào)告.中國(guó)煙草科學(xué)，(4): 1-7.
[0010]董弗兆等.1988.云南三七.云南科技出版社，昆明，pp.103-114.
[0011]繆作清等.2006.三七根腐病病原研究.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，39 (7):1371-1378.
【發(fā)明內(nèi)容】
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[0012]本發(fā)明的目的在于提供一株殺線蟲(chóng)氨鞘醇桿菌(Sphingobacterium nematocida)M-SX103菌株及其應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明的殺線蟲(chóng)氨鞘醇桿菌(Sphingobacterium nematocida)M-SX10菌株,是從煙草內(nèi)生菌中篩選出的具有產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景的生防菌株，為植物靑枯病和三七根腐病的防治提供了新的微生物資源。
[0014]本發(fā)明具體是這樣實(shí)現(xiàn)的:
[0015]殺線蟲(chóng)氨鞘醇桿菌(Sphingobacterium nematocida) M-SX103菌株,分離自云南烤煙品種NC297的健康葉片內(nèi)，該囷株于2014年9月18日保存于中國(guó)微生物囷種保減委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北晨西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào):CGMCC N0.9689。
[0016]殺線蟲(chóng)氨鞘醇桿菌(Sphingobacterium nematocida)M_SX103菌株,在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂20g，補(bǔ)水至l，000mL，pH7.2)上，菌落呈黃色，圓形，邊緣凸起，細(xì)胞為桿狀，直徑0.4-0.8 μ m，長(zhǎng)1.0-1.5 μ m,孢子不游動(dòng)，革蘭氏陰性。該菌株在10-40°C的溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度37°C ;在pH 6.0-9.0的范圍內(nèi)生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)pH為7.0 ;在濃度為0-3%的NaCl (w/v)范圍內(nèi)生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)濃度為0-1%的 NaCl。利用引物 5’ -GGT TAC CTT GTT ACG ACT T_3，，5，-AGA GTT TGA TCM TGGCTC AG-3’經(jīng)PCR擴(kuò)展該菌株的16S rRNA基因，獲得的序列提交到GeneBank公共數(shù)據(jù)庫(kù)，其序列號(hào)為JF731241，此序列是鑒定該菌株的主要特征依據(jù)。M-SX103菌株的主要脂肪酸是異式十五碳飽和脂肪酸(57.7% ),異式十七碳飽和脂肪酸(7.7% )和summed feature3(9.6% )0是鑒別該菌的次要特征依據(jù)。
[0017]本發(fā)明的殺線蟲(chóng)氨鞘醇桿菌(Sphingobacterium nematocida)M-SX103菌株在制備防治煙草青枯病和三七根腐病菌劑中的應(yīng)用。
[0018]本發(fā)明的有益效果在于:
[0019]1、用M-SX103菌株制備的生防菌劑對(duì)防治煙草青病，三七根腐病的防治效果在67%以上，適用于種子處理，移栽期和成株期。具有產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景的生防菌株，為植物靑枯病和三七根腐病的防治提供了新的微生物資源。
[0020]2、用殺線蟲(chóng)氨鞘醇桿菌(Sphingobacterium nematocida)M-SX103菌株制備的生防菌劑具有成本低、防效高、無(wú)殘留、使用方便，對(duì)人畜安全的特點(diǎn)，是有機(jī)農(nóng)業(yè)種植中防治植物青枯病害的高效生物農(nóng)藥。

【具體實(shí)施方式】
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[0021]實(shí)施例所用殺線蟲(chóng)氨鞘醇桿菌(Sphingobacterium nematocida)M-SX103菌株,分離自云南烤煙品種NC297的健康葉片內(nèi)，該菌株于2014年9月18日保存于中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)=CGMCC N0.9689。
[0022]實(shí)施例1:M_SX103菌株的培養(yǎng)及菌劑制備
[0023]M-SX103菌株試管斜面種子的培養(yǎng):將菌株接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的斜面上，于15-37°C條件下培養(yǎng)2-3天后獲得M-SX103菌株斜面種子，適宜的培養(yǎng)條件是32°C下培養(yǎng)2天。
[0024]M-SX103菌株液體種子的液體培養(yǎng):從斜面種子上取一環(huán)M-SX103菌株接種到三角瓶中的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基不添加瓊脂以下簡(jiǎn)稱NB)中，于37°C下，轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)2-3天，制得種子液。
[0025]M-SX103菌株發(fā)酵罐大量培養(yǎng):將所述種子液按3_5 % (V/V)的比例接入含有NB培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，在20-1，000升發(fā)酵罐中的培養(yǎng)條件控制在:溫度32-37°C，攪拌速度150 — 250rpm，發(fā)酵時(shí)間48-72小時(shí)。
[0026]M-SX103可濕性菌劑的制備:經(jīng)發(fā)酵罐培養(yǎng)獲得的微生物菌體及其代謝無(wú)作為原藥與農(nóng)藥常規(guī)吸附載體和助劑按常規(guī)方法制成M-SX103可濕性粉劑生防菌劑。菌劑需保證M-SX103的活菌數(shù)含量在I XlOici個(gè)/克以上。
[0027]實(shí)施例2:M-SX103菌劑對(duì)煙草青枯病的防效試驗(yàn)
[0028]煙草青枯病病原菌(Ralstonia solanacearum)的培養(yǎng):在TTC培養(yǎng)基(蛋白胨10.0g，酪朊水解物1.0g，2，3，5-氯化三苯基四氮哇0.05g，葡萄糖10.0g，瓊脂20.0g,蒸餾水1，OOOmL, pH 6.8-7.2)固體平板上接種煙草青枯病病原菌，32°C下培養(yǎng)3天后挑取單菌落接種于NB液體培養(yǎng)基中，37°C下，200rpm下?lián)u床培養(yǎng)2天，將煙草青枯病菌配成2.0X108cfu/mL濃度的菌懸液備用。
[0029]供試藥劑:a.活菌數(shù)含量為2.5\101(1個(gè)/克的13乂103可濕性菌劑；b.25%青枯凈可濕性粉劑(廣東省農(nóng)科院作物所煙草室研制)。
[0030]防效試驗(yàn)方法:烤煙常規(guī)漂浮育苗時(shí)，將60g的M-SX103可濕性菌劑用400mL水稀釋后與Ikg育基質(zhì)混勻；陽(yáng)性對(duì)照處理為25%青枯凈可濕性粉劑Ig用400mL水稀釋后與Ikg育基質(zhì)混勻；空白對(duì)照為400ml水與Ikg育基質(zhì)混勻。待煙苗長(zhǎng)至5_6片葉子時(shí)，在直徑為20cm的、裝有500g 土壤(質(zhì)量比為:沙土:腐殖土 = 1:1)的每一花缽移栽一株煙苗，在煙根接種煙草青枯病病原菌6ml，每處理三個(gè)重復(fù)，每重復(fù)5盆。肥水管理按常規(guī)方法進(jìn)行，在室溫溫室內(nèi)生長(zhǎng)90天后統(tǒng)計(jì)各處理的煙草青枯病的發(fā)病率，按以下公式計(jì)算發(fā)病率，病情指數(shù)和防病效果:
[0031]病情指數(shù)=[Σ (各級(jí)癥狀代表值相應(yīng)的級(jí)數(shù))]X 100/最高級(jí)癥狀代表值X調(diào)查總株數(shù))X 100
[0032]防病效果)=(空白對(duì)照病指-藥劑處理病指/對(duì)照病指)X 100
[0033]病情分級(jí):0級(jí)為無(wú)癥狀；1級(jí)為1-2片葉萎蔫；2級(jí)為1/3-1/2葉片萎蔫或莖桿基部變黑；3級(jí)為2/3-3/4葉片萎蔫、壞死且莖桿變黑壞死；4級(jí)為整株死亡。
[0034]試驗(yàn)結(jié)果表明:空白對(duì)照的病情指數(shù)為77.4 ;25%青枯凈可濕性菌劑處理的病情指數(shù)為25.4，防效為67.1 % ;M-SX103可濕性菌劑處理的病情指數(shù)為23.7%，防效為69.4%，與化學(xué)農(nóng)藥25%青枯凈可濕性粉劑的防治效果相當(dāng)。
[0035]實(shí)施例3:M-SX103菌劑防治三七根腐病的田間試驗(yàn)
[0036]本試驗(yàn)在云南省文山州三七研究院的大棚試驗(yàn)地進(jìn)行，該試驗(yàn)地已經(jīng)連作三七20年，三七根腐病的發(fā)病率在80%以上。在三七育苗時(shí)，將10g菌體含量為2.5X101(I個(gè)/g的M-SX103可濕性菌劑用IL水溶化，加入Ikg三七種子混勻，使菌劑粘附在種子上，然后按常規(guī)育種方法管理。移栽時(shí)每畝三七苗的用1kg菌劑兌水200kg均勻灌根，移栽一年后用相同劑量的菌劑和方式再施用一次。對(duì)照藥劑為50%的農(nóng)利靈可濕性粉劑(德國(guó)巴斯夫公司)，用量為每畝2kg，施用方法同M-SX103粉劑?？瞻讓?duì)照不施用任何藥劑，每處理三個(gè)重復(fù)，每重復(fù)100株苗。三七移栽后的肥水管理按常規(guī)進(jìn)行，移栽兩年后統(tǒng)計(jì)各處理的發(fā)病率，按以下公式計(jì)算發(fā)病率和防效:
[0037]發(fā)病率)=發(fā)病株數(shù)/調(diào)查株數(shù)X 100
[0038]防治效果)=空白對(duì)照的發(fā)病率-藥劑處理的發(fā)病率
[0039]試驗(yàn)結(jié)果表明:空白對(duì)照的發(fā)病率為100% ;農(nóng)利靈處理的發(fā)病率為30.6%，防效為69.4% ；M-SX103可濕性粉劑處理的發(fā)病率為28.2%，防效為71.8%，與50%的農(nóng)利靈可濕性粉劑防效相當(dāng)。
【權(quán)利要求】
1.殺線蟲(chóng)氨鞘醇桿菌(Sphingobacteriumnematocida)M-SX103菌株，該菌株的保藏號(hào)為:CGMCC N0.9689。
2.權(quán)利要求1所述的殺線蟲(chóng)氨鞘醇桿菌(Sphingobacteriumnematocida)M-SX103菌株在制備防治煙草青枯病和三七根腐病菌劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01N63/00GK104450560SQ201410629500
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月11日
【發(fā)明者】馬莉, 莫明和 申請(qǐng)人:云南大學(xué)