棉花腺體形成基因GoPGF的克隆及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了棉花腺體形成基因GoPGF的克隆及利用。棉花腺體形成基因GhPGF_A12在陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1的基因組A亞組序列為：SEQ ID NO.1；GhPGF_D12在陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1的基因組D亞組序列為：SEQ ID NO.2。GbPGF_A12在海1基因組A亞組中核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示GbPGF_D12在海1基因組D亞組中核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。通過病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)，證明GoPGF是一個控制腺體形成的關(guān)鍵性基因。該基因為研究棉花腺體形成、腺體與棉酚的關(guān)系，低酚棉、高酚棉等新種質(zhì)的創(chuàng)制奠定重要的研究基礎(chǔ)。
【專利說明】棉花腺體形成基因GoPGF的克隆及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及棉花腺體形成基因GoPGF的克隆及應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 棉花除了為人類提供天然纖維之外，它還是一種重要的油料作物。軋去纖維后剩 下的棉桿中，種仁占50%左右。棉花種仁中蛋白質(zhì)含量_達40%左右，是小麥面粉蛋白含 量的5倍，是稻米蛋白含量的7倍，可與大豆、花生相媲美，完全能夠滿足人們對蛋白質(zhì)的需 求。種仁中含油量高達35%以上，能與花生和油菜相媲美，且棉子油中的不飽和脂肪酸含量 較高，特別油酸和亞油酸的含量高達71. 7%，是一種優(yōu)質(zhì)的植物油資源。除棉子蛋白和棉子 油外，棉仁中還含有一定量的維生素B和E等營養(yǎng)成分，具有很高的營養(yǎng)價值（劉毓湘等， 1995)。然而，棉花種仁中一般含棉酚及其衍生物，含量為0. 15%?0.20%就會引起人和非 反芻動物產(chǎn)生嚴(yán)重的中毒現(xiàn)象。因此，棉子油需要進行脫毒精煉后才能食用，榨油后的棉仁 餅也只能用作肥料。但是，對棉株本身棉酚卻是重要的抗性物質(zhì)，是防御病蟲危害的重要組 成部分，缺少棉酚會導(dǎo)致棉花病蟲的危害而使產(chǎn)量大幅下降。作為棉酚的主要存儲結(jié)構(gòu)，腺 體的多少與棉酚含量關(guān)系密切。因此，有關(guān)腺體的形成和遺傳機制以及棉酚的代謝研究一 直是科學(xué)家研究的熱點，其目的在于搞清棉花色素腺體的分布規(guī)律、分布模式、形態(tài)建構(gòu)和 遺傳規(guī)律，以及腺體形成與棉酚積累關(guān)系，進而有目的地進行育種，特別是培育植株有腺體 種子無腺體的新型棉花品種（潘家駒等，1998)，從根本上解決棉籽綜合利用的問題。
[0003] (一）腺體與棉酚含量的關(guān)系研究
[0004] 棉酚是一種倍半萜烯類化合物。棉酚主要以兩種形式存在于棉花植株器官：不 能用70%的丙酮溶液抽提出來的結(jié)合棉酚和可用70%的丙酮抽提出來以游離的形式存 在的有生物學(xué)活性游離棉酚。一般認為，棉酚及其衍生物由根部合成，而后向上運輸，主 要存儲在棉屬植物一種特有的結(jié)構(gòu)--腺體中。腺體在棉株中除花粉、種皮和木質(zhì)部外均 有分布。腺體分布數(shù)量和密度在棉株個體間存在差異，常因不同品種、不同植株、不同器 官、不同組織、不同生長環(huán)境和發(fā)育時期而有所不同。國內(nèi)外研究表明，棉屬植物棉酚的有 無及含量與不同的腺體類型密切相關(guān)，通常色素腺體數(shù)目與棉酚含量呈高度正相關(guān)關(guān)系。 Pominski(1951)分析，四個栽培種中色素腺體數(shù)目與棉酚含量呈直線相關(guān)。Singh(1972) 經(jīng)過試驗證明棉仁和棉株葉片花蕾上色素腺體數(shù)量和棉酚含量之間的高度正相關(guān)性。 Wilson等人（1976)也報道了出現(xiàn)在棉籽、葉片以及花蕾等部位的色素腺體的數(shù)目與棉酚 的含量有著正比的關(guān)系。祝水金等（1997)對棉屬栽培種和野生種種子與植株主要器官的 棉酚含量和色素腺體進行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)種仁和花瓣的色素腺體與棉酚含量存在著極 顯著的相關(guān)性。因此，在傳統(tǒng)低酚棉育種中，葉片、棉籽的腺體數(shù)目常常作為判斷棉酚含量 的重要指標(biāo)。
[0005] 然而，伴隨著新棉種的發(fā)現(xiàn)，人們發(fā)現(xiàn)腺體與棉酚含量之間也并非是絕對的正相 關(guān)關(guān)系。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，二倍體的比克氏棉％)、澳洲棉（C 3)、南岱華棉（〇、斯特提氏棉 (CJ、納爾遜氏棉（C9)均是種仁無腺體、無棉酚而植株有腺體且有棉酚的特異種質(zhì)；阿拉伯 棉（EJ和索馬里棉（E2)種仁內(nèi)有腺體，卻難以測到棉酚。說明棉酚和腺體之間聯(lián)系密切又 復(fù)雜。棉酚如何合成和運輸？沒有腺體的棉種種,棉酚又是以何種形式在棉花體內(nèi)？這些 問題都尚腺體的發(fā)生與棉酚的積累關(guān)系值得深入的研究。
[0006] (二）腺體的形成過程研究
[0007] 成熟的色素腺體為1?3層扁平的上皮細胞圍繞一個含有分泌物質(zhì)的腔隙組成。 直徑為100?400微米，子葉或葉片的腺體發(fā)生在柵欄組織下面，新生莖桿的腺體發(fā)生在皮 層的下皮層；老的莖桿和根中的腺體分布遍及皮層的韌皮部。從外表觀察，腺體呈褐色或 黑褐色，但顯微鏡下觀察腺體在葉片中呈桔紅、棕紅或紫紅色，在種仁中呈棕黃色，花瓣上 腺體為淡黃色，常與花瓣色無明顯差異，必須迎著光線才能看出。棉花色素腺體的發(fā)育過 程，即關(guān)于基本的分生組織如何形成空腔，長期以來一直存在爭議。一種觀點認為，色素腺 體腔隙是通過分泌細胞團相互分離的裂生方式發(fā)育而來，分泌物很早就出現(xiàn)在分泌細胞間 (Tschirch，1906)。但是，多數(shù)學(xué)者認為腺體是通過細胞溶解的方式發(fā)育而來，也就是典型 的溶生型發(fā)育。周亞福等（2011)利用細胞化學(xué)、光學(xué)顯微鏡、掃描和透射電子顯微鏡技術(shù) 研究了陸地棉葉色素腺體的發(fā)生，發(fā)現(xiàn)棉花葉片腺體起源于表皮下方一團細胞質(zhì)濃密的基 本分生組織細胞，色素腺體原始細胞分化為中央細胞和鞘細胞后，色素腺體的中央細胞及 部分鞘細胞在發(fā)育過程中降解成熟的色素腺體，由一層扁平的上皮細胞和1?3層鞘細胞 圍繞著中央大的腔隙組成，最外1?2層鞘細胞的細胞壁在發(fā)育后期明顯加厚。同時發(fā)現(xiàn) "溶生型"棉花色素腺體的發(fā)育是一個細胞程序化死亡的過程。
[0008] (三）腺體形成相關(guān)基因的研究
[0009] 到目前為止，已發(fā)現(xiàn)控制棉花腺體有無的基因有六對（gh?gl6) (McMichael等， 1954,1959,1960 ;Miravalle 等，1962 ;Lee 等，1965 ;Murray 等，1965)。在這六個基因位 點中，gl2和gl3起主要作用，其它的基因僅起修飾作用。李祥鳳和徐自平（1993)根據(jù)棉 酚腺體在棉株上的分布及其在不同時期的表達，將棉酚腺體在棉株上的分布與基因型對應(yīng) 起來，有四種表現(xiàn)型：第一種是A型，其下胚軸、子葉、托葉等部位均有腺體，隨機分布，對 應(yīng)的基因型是具有顯性Gl 2或Gl3兩種或兩種以上的基因型，有6種基因型：G12G12G1 3G13、 61261成1通13、61261 261通1341成1261右13、61通1261 3613、61成1261通13;第二種是8型，其腺體分 布在子葉邊緣及沿中脈附近，托葉上有少量腺體，下胚軸上有零星腺體存在，用鏡檢可以發(fā) 現(xiàn)，基因型為Gl 2gl2gl3gl3 ;第三種是C型，僅在子葉邊緣、托葉上有少量腺體分布，用鏡檢同 樣可見下胚軸上有零星腺體，基因型為gl2gl 2Gl3gl3 ;第四種是D型，植株各部分均無腺體， 具有純合隱性gl2gl2gl3gl 3基因型。也就是說當(dāng)gl2和gl3兩對隱性基因純合時，棉花植株 和棉籽均表現(xiàn)為無腺體。
[0010] 控制棉花腺體的基因，除了上述的giggle六個基因外，還相應(yīng)存在它們的各個復(fù) 等位基因。McMichael (1970)在美國亞利桑那州發(fā)現(xiàn)一株莖桿無腺體的陸地棉突變體，進 一步遺傳分析證明該突變性狀是受一個與gll等位的簡單隱性基因控制，確定基因符號為 gl/，從而形成Glpglpgl/三個復(fù)等位基因。Lee(1965)在驗證"等位基因替代"假說的試 驗中，證明了 A組亞洲棉的腺體是由一個與gl2等位的基因所控制的，確定為gl2art，而D組 的腺體是由一個與gl 3相同的位點所控制的，雷蒙德氏棉D(zhuǎn)5具有等位基因gl/ai，瑟伯氏棉 Di具有等位基因gl 3th'戴維遜氏棉D(zhuǎn)3具有等位基因gl3dav，海島棉AD亞組分別具有等位基 因gl 2b和gl3b。Barrow和Davis(1974)用有腺體材料XG-15與無腺體的愛字棉B6532雜 交發(fā)現(xiàn)了一個Gl2的次級等位基因，確定基因符號為G12 S。當(dāng)G12S為純合體時，子葉上有較 少的腺體；而當(dāng)Gl2為純合體時，子葉上有大量腺體。張?zhí)煺娴龋?001)對湘X9628種子低 酚、植株有酚特性的遺傳分析表明：湘X9628植株有腺體、種子低棉酚特性由兩對重疊隱性 基因控制。等位性測驗表明，其中一對基因是gl 2的等位基因，另一對是gl3的復(fù)等位基因， 它對gl3表現(xiàn)為隱性，并定名為gl 3n。祝水金等（2004)育成具有子葉色素腺體延緩形成特 性的陸地棉種質(zhì)系"ABH-0318"，遺傳分析結(jié)果表明，該種質(zhì)的子葉色素腺體延緩形成性狀 受位于Gl 2和Gl3位點的兩對基因互作控制，其中位于Gl2位點的基因來源于比克氏棉，對 已知的陸地棉色素腺體等位基因（61 2和812)為顯性，但對Gl3則表現(xiàn)為隱性上位，暫定其 基因符號為Gl 2b。
[0011] 1965年，埃及一個Bahtim試驗站的Afifi等人在海島棉中發(fā)現(xiàn)了一個無腺體單節(jié) 顯性突變體，它是所發(fā)現(xiàn)的控制棉酚腺體性狀的基因中的第一個無腺體基因。他用P32溶 液處理海島棉品種吉扎45種子，獲得一個顯性無腺體突變體，從而育成無腺體品種巴蒂姆 llO(BahtimllO)。美國學(xué)者Kohel(1984)用BahtimllO為背景材料與標(biāo)準(zhǔn)系TM-1雜交，經(jīng) 過多次回交將BahtimllO的顯性無腺體基因轉(zhuǎn)移到TM-1中，得到無腺體突變體"等位基因 系"，遺傳分析表明，該性狀受到一對顯性主基因（G1/)控制，可以顯性抑制棉酚腺體的表 現(xiàn)，與純合隱性的gl 2gl2gl3gl3基因型效應(yīng)相似，為棉花低酚育種提供揭開了新的篇章。中 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所1986年發(fā)放了海島棉無腺體突變品系海1，靖深蓉等（1991)采用 有腺體陸地棉與海1雜交，再與陸地棉回交和人工選擇的方法，把海島棉中的顯性無腺體 基因轉(zhuǎn)育到陸地棉中，經(jīng)過3次回交和2次自交及人工選擇，選育出具有陸地棉遺傳背景的 顯性無腺體近似等位基因群體，且對陸地棉的主要經(jīng)濟性狀無不良影響。唐燦明等（1994; 1996)對海1的遺傳機制進行了進一步研究，結(jié)果表明其無腺體性狀是由位于Gl 2位點上的 一對不完全顯性基因Gl2e控制。他發(fā)現(xiàn)海1除含顯性無腺體Gl 2e基因外，還含有腺體基因 Gl3和Glp G1/對它們有顯性上位作用。G1/基因為目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個控制腺體有無的 顯性單基因。該基因克服了隱性無腺體基因易于發(fā)生天然雜交、導(dǎo)致食用不安全的問題，并 且在轉(zhuǎn)育到陸地棉品種中后對被轉(zhuǎn)育品種的主要農(nóng)藝性狀無不良影響，使培育抗天然雜交 的無腺體低酚棉品種成為可能。由G1/基因控制的無腺體性狀還可作為一個優(yōu)良的指示性 狀，應(yīng)用于棉花雜種優(yōu)勢的研究（袁有祿等，1997)。因此，許多研究工作集中于克隆G1/基 因。2003年蔡應(yīng)繁采用抑制性消減雜交方法（SSH)克隆了顯性無腺體海島棉與有腺體陸地 棉的衍生后代突變體"湘棉18"的特殊腺體發(fā)育相關(guān)的基因，獲得24個差異表達的cDNA克 隆。2008年謝永芳等選用川2802 (種子、植株都有腺體），湘棉18 (種子無腺體，植株有腺 體，種子萌發(fā)過程中腺體逐漸增多），無腺體棉一顯無N5 (種子、植株都無腺體）為材料，通 過棉花基因芯片，對腺體形成時期的基因進行高通量篩選，篩選表達變化的基因。獲得腺體 形成時期相關(guān)的基因311條。Yu等2000年以陸地棉的標(biāo)準(zhǔn)系"TM-1"以及它的近等基因系 材料ESP作為雜交親本構(gòu)建F 2群體，用了集團分離的方法獲得了一個距G1/基因為1. 9cM 的SSR標(biāo)記。蔣小燕等在2002年，同樣的也采用近等基因系的分析方法篩選到了 380個隨 機引物，通過實驗，最終獲得了一個與Gl2e緊密連鎖RAH)標(biāo)記且已經(jīng)把這個RAH)標(biāo)記轉(zhuǎn)換 成了比較穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記，該標(biāo)記與顯性無腺體基因Gl 2e的遺傳距離為6. 4cM。2007年， 董承光等用"TM-1"和海1為雜交親本，構(gòu)建了一個F2群體，通過SSR的方法對G1/基因進 行了更為精細定位，最終將目標(biāo)基因定位在了 CIR362和NAU2251之間，其遺傳距離分別約 為9. 27cM和0.96cM。2012年黃娟用"中棉所12號（中12)"及其近等基因系材料"中棉 所12號顯性無腺體（中12顯無）"為親本構(gòu)建了包含2, 302個單株的F2群體，定位Gl2e 基因，鎖定在物理距離大概為340kb的范圍內(nèi)。在進一步的實驗中，進一步縮小在物理距離 大約為7. 5kb的范圍內(nèi)，但未能進行功能驗證。但是，控制腺體形成的Gl2e基因到底是什 么，目前尚未見報道。相對于擬南芥135Mb、水稻372Mb、大豆975Mb的基因組大小來說，棉 花2. 5Gb的大小無異是巨人，因棉花為異源四倍體，重復(fù)序列高達70%以上，全基因組測序 較困難，二倍體雷蒙德氏棉的序列也是近期才公布，而作為錦葵科的棉花與其他已測序作 物水稻、大豆、谷子進化關(guān)系較遠，所以借助其他作物基因組序列信息來圖位克隆棉花基因 很難實現(xiàn)，故到目前為止并未有任何一個基因在棉花中圖位克隆成功。
[0012] 概括以上所述腺體遺傳研究的現(xiàn)狀，現(xiàn)將有關(guān)腺體基因的資料做一歸納總結(jié)（見 表1)。
[0013] 表1控制棉花色素腺體形成的基因
[0014]

【權(quán)利要求】
1. 一個棉花腺體形成基因 GhPGF_A12,在陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1的基因組A亞組中核 苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. -個棉花腺體形成基因 GhPGF_D12,在陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1的基因組D亞組中核 苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3. -個棉花腺體形成基因 GbPGF_A12,在海1基因組A亞組中核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
4. 一個棉花腺體形成基因 GbPGF_D12,在海1基因組D亞組中核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
5. 權(quán)利要求1所述的腺體形成基因 GhPGF_A12的VIGS干擾載體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的VIGS干擾載體，其特征在于以陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1的 cDNA作為模板，選擇GhPGF_A12基因3'端作為候選區(qū)段，在該基因904?1428bp處設(shè)計特 異性引物進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物插入VIGS載體pTRV2的BamHI/Xba I位點間得到腺體 形成基因 GhPGF_A12的VIGS干擾載體；其中特異性引物為：正向引物：SEQ ID NO. 5,反向 引物：SEQ ID NO. 6。
7. 含權(quán)利要求1?4中任一項所述的腺體形成基因的植物表達載體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的植物表達載體，其特征在于以陸地棉TM-1或海島棉海1的 cDNA作為模板，在該基因起始位點ATG到終止密碼子之前設(shè)計特異性引物進行PCR擴增， 將擴增產(chǎn)物插入載體PBI121的Xba I/Smal位點間得到腺體形成基因 GoPGF的植物表達載 體；其中特異性引物為：正向引物：SEQ ID NO. 7,反向引物：SEQ ID NO. 8。
9. 權(quán)利要求1?4中任一項所述的腺體形成基因在控制棉花腺體形成，進行低酚棉、高 酚棉創(chuàng)制中的應(yīng)用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于利用腺體形成基因 GoPGF設(shè)計分子標(biāo)記， 篩選低酚性狀，培育符合需要的低酚棉花新品種；或者利用基因工程手段使棉酚腺體基因 在有腺體棉的種子中不表達，在植株其他組織中正常表達或高表達，培育既具有抗性又能 作為蛋白質(zhì)和植物油資源的棉花新品種。
【文檔編號】A01H5/00GK104450733SQ201410637760
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月12日
【發(fā)明者】張?zhí)煺? 胡艷, 馬丹 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)