一種離體條件下柴達木枸杞不定苗誘導(dǎo)的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種離體條件下柴達木枸杞不定苗誘導(dǎo)的方法，該方法包括以下步驟：⑴每年5~7月份取柴達木枸杞優(yōu)株上的當(dāng)年生嫩枝，并將葉片去除，用流水沖洗干凈后，將枝條剪段后漂洗、消毒即得無菌莖段；⑵將無菌莖段作為外植體接種在預(yù)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即得預(yù)培養(yǎng)的莖段外植體；⑶預(yù)培養(yǎng)的莖段外植體轉(zhuǎn)接入側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即得新形成的側(cè)芽；⑷將新形成的側(cè)芽剪下轉(zhuǎn)接入不定苗分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，3~4周后即得不定苗；⑸將生長至1~2cm的不定苗轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)4周即可。本發(fā)明操作簡單并能保持母本性狀。
【專利說明】一種離體條件下柴達木枸杞不定苗誘導(dǎo)的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種離體條件下柴達木枸杞不定苗誘導(dǎo)的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]枸豐己、[又。1鹽1)31-1)31-0111 1111.)為前科枸豐己屬多年生落葉灌木，果實稱枸杞子，根皮稱地骨皮，均可入藥，嫩莖、葉可做蔬菜。枸杞子具有明目潤肺、免疫調(diào)節(jié)、抗脂肪肝、降血糖血脂、抗衰老及改善老年人器官衰退等老化疾病的功效。柴達木盆地枸杞資源豐富，是枸杞的新興產(chǎn)區(qū)，所產(chǎn)的柴達木枸杞是青海著名的道地地產(chǎn)藥材的原植物之一，“柴杞”也是國內(nèi)最優(yōu)質(zhì)的枸杞之一。在柴達木盆地種植枸杞不僅可以調(diào)節(jié)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，還可以提高柴達木盆地的植被覆蓋率，改善區(qū)域小氣候，防治土地沙化，對生態(tài)保護和退化生態(tài)環(huán)境的恢復(fù)具有重要作用。
[0003]在生產(chǎn)上枸杞主要靠無性扦插繁育，占地面積大、繁殖效率低，不利于優(yōu)良品種的快速擴大。同時，枸紀(jì)病毒分布廣泛、危害大，主要枸紀(jì)病毒(仏七迎^丨!"!^)、馬鈴薯X病毒(戶乂乂)、馬鈴薯V病毒(^”)、黃瓜花葉病毒(0^)等。病株全株發(fā)育不良，葉片變小、畸形皺縮。長期的無性扦插繁殖使病毒在植株母體中積累，通過扦插會感染種苗，不利于優(yōu)質(zhì)種苗繁育，后期的種植中病毒病蔓延和爆發(fā)影響枸杞的產(chǎn)量和品質(zhì)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡單并能保持母本性狀的離體條件下柴達木枸杞不定苗誘導(dǎo)的方法。
[0005]為解決上述問題，本發(fā)明所述的一種離體條件下柴達木枸杞不定苗誘導(dǎo)的方法，包括以下步驟:
⑴每年5~7月份取柴達木枸杞優(yōu)株上的當(dāng)年生嫩枝，并將葉片去除，用流水沖洗干凈后，將枝條剪為長度為3-4(^1的小段，然后在超凈工作臺上用體積濃度為70%~75%的酒精漂洗，10-308后再用質(zhì)量濃度為0.19^0-0.2%的升汞消毒最后用無菌水沖洗4~6遍，即得無菌莖段；
⑵將所述無菌莖段作為外植體按5段/瓶的接種量接種在預(yù)培養(yǎng)基中，在溫度為20~251且光照條件下培養(yǎng)1~2周，即得預(yù)培養(yǎng)的莖段外植體；
⑶所述預(yù)培養(yǎng)的莖段外植體按5段/瓶的接種量轉(zhuǎn)接入側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度為20~251且光照條件下培養(yǎng)3~4周，側(cè)芽形成并生長至1挪，即得新形成的側(cè)芽；
⑷將所述新形成的側(cè)芽剪下，按5個/瓶的接種量轉(zhuǎn)接入不定苗分化培養(yǎng)基中，在溫度為20~251且光照條件下進行分化培養(yǎng)，3-4周后即得不定苗；
⑶將生長至1~2挪的所述不定苗按5株/瓶的接種量轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基，在溫度為20~251且光照條件下培養(yǎng)4周即可。
[0006]所述步驟⑵中的預(yù)培養(yǎng)基是指每升13基本培養(yǎng)基中添加0.0^2.008生長素、20.0-60.08蔗糖、3~8 8瓊脂粉，且邱值為5-6.5的培養(yǎng)基。
[0007]所述步驟⑶中的側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是指每升13基本培養(yǎng)基中添加有0.05-3.008細胞分裂素、0.05-1.0呢生長素、200~400呢水解酪蛋白、100~300呢肌醇、1~3呢7。、2~6呢檸檬酸鈉、20.0-60.08蔗糖、3~如瓊脂粉，且邱值為5~6丨5的培養(yǎng)基。
[0008]所述步驟⑷中的不定苗分化培養(yǎng)基是指每升13基本培養(yǎng)基中添加有1.0-3.0呢細胞分裂素、0.01-0.5呢生長素、200~400呢水解酪蛋白、100~300呢肌醇、1~3呢7。、2~6呢檸檬酸鈉、20.0-60.08蔗糖、3~如瓊脂粉，且邱值為5~6丨5的培養(yǎng)基。
[0009]所述步驟⑶中的增殖培養(yǎng)基是指每升13基本培養(yǎng)基中添加有1.0-2.01^細胞分裂素、0.05-0.2呢生長素、200~400呢水解酪蛋白、100~300呢肌醇、20.0-60.08蔗糖、3~88瓊脂粉，且邱值為5~6丨5的培養(yǎng)基。
[0010]所述步驟⑵、所述步驟⑶、所述步驟⑷、所述步驟(5)中的光照條件均是指光照強度為3000~10000匕^，光照時間為12~16“天。
[0011]所述生長素為2，4-0、嫩八、中的一種。
[0012]所述細胞分裂素為6-8八、0、2丁中的一種。
[0013]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點:
1、本發(fā)明以優(yōu)良性狀的柴達木枸杞植株的當(dāng)年生嫩莖為外植體，通過莖段滅菌、莖段預(yù)培養(yǎng)、側(cè)芽誘導(dǎo)、不定苗分化等各階段建立離體條件下不定苗分化體系，為下一步柴達木枸杞優(yōu)質(zhì)品種的快繁體系的建立提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
[0014]2、由于本發(fā)明中采用不同培養(yǎng)基對無菌莖段先進行預(yù)培養(yǎng)和側(cè)芽誘導(dǎo)(參見圖1-4),因此，能夠快速誘導(dǎo)柴達木枸杞不定苗的分化和增殖，使得在短時間內(nèi)能夠獲得大量不定苗。
[0015]3、由于本發(fā)明由枸杞莖段上的側(cè)芽直接誘導(dǎo)形成不定苗，因此，步驟簡化、操作簡單，并能最大程度的保持母本優(yōu)良性狀。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明。
[0017]圖1為本發(fā)明中枸杞莖段外植體側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)照片；經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的莖段在側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上快速形成側(cè)芽。
[0018]圖2為本發(fā)明中枸杞莖段上側(cè)芽剪下轉(zhuǎn)入不定苗分化培養(yǎng)照片；在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周后側(cè)芽基部或葉腋處不定芽開始形成。
[0019]圖3為本發(fā)明中枸杞側(cè)芽在離體條件下培養(yǎng)3~4周后不定苗形成并生長至1~2挪高的照片；每側(cè)芽外植體上可分化不定苗3~8株。
[0020]圖4為本發(fā)明中枸杞不定苗的增殖培養(yǎng)照片；不定苗轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中不定苗不斷分化，其增殖頻率可以達到1:3~10。

【具體實施方式】
[0021]實施例1 一種離體條件下柴達木枸杞不定苗誘導(dǎo)的方法，包括以下步驟: ⑴每年5月份取柴達木枸杞優(yōu)株上的當(dāng)年生嫩枝，并將葉片去除，用流水沖洗干凈后，
將枝條剪為長度為的小段，然后在超凈工作臺上用體積濃度為70%的酒精漂洗，308后再用質(zhì)量濃度為0.1%的升汞消毒10-??！，最后用無菌水沖洗4遍，即得無菌莖段。
[0022]⑵將無菌莖段作為外植體按5段/瓶的接種量接種在預(yù)培養(yǎng)基中，在溫度為201且在光照強度為30001狀、光照時間為16“天的光照條件下培養(yǎng)1周，即得預(yù)培養(yǎng)的莖段外植體。
[0023]其中:預(yù)培養(yǎng)基是指每升13基本培養(yǎng)基中添加有0.01呢2，4-0,20.08蔗糖、如瓊脂粉，且邱值為5的培養(yǎng)基。
[0024]⑶預(yù)培養(yǎng)的莖段外植體按5段/瓶的接種量轉(zhuǎn)接入側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度為201且在光照強度為30001狀、光照時間為16“天的光照條件下培養(yǎng)3周，側(cè)芽形成并生長至1。！??！，即得新形成的側(cè)芽。
[0025]其中:側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是指每升13基本培養(yǎng)基中添加有3.0呢6-8八、1.0呢2，4-0、200呢水解酪蛋白、100^肌醇、1呢％、2呢檸檬酸鈉、20.蔗糖、8 8瓊脂粉，且邱值為5的培養(yǎng)基。
[0026]⑷將新形成的側(cè)芽剪下，按5個/瓶的接種量轉(zhuǎn)接入不定苗分化培養(yǎng)基中，在溫度為201:且在光照強度為30001狀、光照時間為16“天的光照條件下進行分化培養(yǎng)，3周后即得不定苗。其形成頻率為每外植體上3~8株。
[0027]其中:不定苗分化培養(yǎng)基是指每升13基本培養(yǎng)基中添加有1.0呢6-810.5呢2，4-0、200呢水解酪蛋白、100^肌醇、20.蔗糖、8 8瓊脂粉，且邱值為5的培養(yǎng)基。
[0028](5)將生長至的不定苗按5株丨瓶的接種量轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基，在溫度為201且在光照強度為3000匕^、光照時間為16“天的光照條件下培養(yǎng)4周即可。其增殖頻率最尚可以達到1:10。
[0029]其中:增殖培養(yǎng)基是指每升13基本培養(yǎng)基中添加有1.0呢6-8八、0.05呢2，4-0、

8瓊脂粉，且邱值為5的培養(yǎng)基。
[0030]實施例2 —種離體條件下柴達木枸杞不定苗誘導(dǎo)的方法，包括以下步驟: ⑴每年7月份取柴達木枸杞優(yōu)株上的當(dāng)年生嫩枝，并將葉片去除，用流水沖洗干凈后，
將枝條剪為長度為3~40111的小段，然后在超凈工作臺上用體積濃度為75%的酒精漂洗，108后再用質(zhì)量濃度為0.2%的升汞消毒8-1最后用無菌水沖洗6遍，即得無菌莖段。
[0031]⑵將無菌莖段作為外植體按5段/瓶的接種量接種在預(yù)培養(yǎng)基中，在溫度為251且在光照強度為10000匕^、光照時間為12“天的光照條件下培養(yǎng)2周，即得預(yù)培養(yǎng)的莖段外植體。
[0032]其中:預(yù)培養(yǎng)基是指每升13基本培養(yǎng)基中添加有2.0呢購^60.08蔗糖、3 8瓊脂粉，且邱值為6.5的培養(yǎng)基。
[0033]⑶預(yù)培養(yǎng)的莖段外植體按5段/瓶的接種量轉(zhuǎn)接入側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度為251且在光照強度為100001狀、光照時間為12“天的光照條件下培養(yǎng)4周，側(cè)芽形成并生長至1。?。?！，即得新形成的側(cè)芽。
[0034]其中:側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是指每升13基本培養(yǎng)基中添加有0.05呢0,0.05呢嫩八、4001118水解酪蛋白、3001118肌醇、31118 、611?梓檬酸鈉、60.0?鹿糖、38瓊脂粉，且邱值為6.5
的培養(yǎng)基。
[0035]⑷將新形成的側(cè)芽剪下，按5個/瓶的接種量轉(zhuǎn)接入不定苗分化培養(yǎng)基中，在溫度為251:且在光照強度為100001狀、光照時間為12“天的光照條件下進行分化培養(yǎng)，4周后即得不定苗。其形成頻率為每外植體上2~8株。
[0036]其中:不定苗分化培養(yǎng)基是指每升13基本培養(yǎng)基中添加有3.0呢0,0.01^嫩八、400呢水解酪蛋白、300呢肌醇、60.08蔗糖、瓊脂粉，且邱值為6.5的培養(yǎng)基。
[0037](5)將生長至的不定苗按5株/瓶的接種量轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基，在溫度為251且在光照強度為10000匕^、光照時間為12“天的光照條件下培養(yǎng)4周，其增殖頻率最高為1
[0038]其中:增殖培養(yǎng)基是指每升13基本培養(yǎng)基中添加有2.0呢0,0.2購\、400呢水解酪蛋白、300呢肌醇、60.蔗糖、瓊脂粉，且邱值為6.5的培養(yǎng)基。
[0039]實施例3 —種離體條件下柴達木枸杞不定苗誘導(dǎo)的方法，包括以下步驟: ⑴每年6月份取柴達木枸杞優(yōu)株上的當(dāng)年生嫩枝，并將葉片去除，用流水沖洗干凈后，
將枝條剪為長度為3^4(3111的小段，然后在超凈工作臺上用體積濃度為73%的酒精漂洗，208后再用質(zhì)量濃度為0.15%的升汞消毒9-1最后用無菌水沖洗5遍，即得無菌莖段。
[0040]⑵將無菌莖段作為外植體按5段/瓶的接種量接種在預(yù)培養(yǎng)基中，在溫度為221且在光照強度為6000匕^、光照時間為14“天的光照條件下培養(yǎng)1.5周，即得預(yù)培養(yǎng)的莖段外植體。
[0041]其中:預(yù)培養(yǎng)基是指每升13基本培養(yǎng)基中添加有1.0呢1^,40.蔗糖、4.瓊脂粉，且邱值為6.0的培養(yǎng)基。
[0042]⑶預(yù)培養(yǎng)的莖段外植體按5段/瓶的接種量轉(zhuǎn)接入側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度為22。〇且在光照強度為60001^^、光照時間為1411/天的光照條件下培養(yǎng)3.5周，側(cè)芽形成并生長至1。?。?！，即得新形成的側(cè)芽。
[0043]其中:側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是指每升13基本培養(yǎng)基中添加有1.5呢21,0.5^ I八八、3001118水解酪蛋白、2001118肌醇、21118 %、4呢梓檬酸鈉、40.0?鹿糖、4.5 8瓊脂粉，且邱值為6.0的培養(yǎng)基。
[0044]⑷將新形成的側(cè)芽剪下，按5個/瓶的接種量轉(zhuǎn)接入不定苗分化培養(yǎng)基中，在溫度為221:且在光照強度為6000匕^、光照時間為14“天的光照條件下進行分化培養(yǎng)，3.5周后即得不定苗。其形成頻率為每外植體上1~6株。
[0045]其中:不定苗分化培養(yǎng)基是指每升13基本培養(yǎng)基中添加有2.0呢21,0.25^I八八、300呢水解酪蛋白、200呢肌醇、40.蔗糖、4.5 8瓊脂粉，且邱值為6.0的培養(yǎng)基。
[0046](5)將生長至的不定苗按5株丨瓶的接種量轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基，在溫度為221且在光照強度為6000匕^、光照時間為1411/天的光照條件下培養(yǎng)4周。其增殖頻率為1:6。
[0047]其中:增殖培養(yǎng)基是指每升13基本培養(yǎng)基中添加有1.5呢21、0.1呢1—、300呢水解酪蛋白、200呢肌醇、40.蔗糖、4.5 8瓊脂粉，且邱值為6.0的培養(yǎng)基。
【權(quán)利要求】
1.一種離體條件下柴達木枸杞不定苗誘導(dǎo)的方法，包括以下步驟: ⑴每年5~7月份取柴達木枸杞優(yōu)株上的當(dāng)年生嫩枝，并將葉片去除，用流水沖洗干凈后，將枝條剪為長度為3~4cm的小段，然后在超凈工作臺上用體積濃度為70%~75%的酒精漂洗，10~30s后再用質(zhì)量濃度為0.1%~0.2%的升汞消毒8~10min，最后用無菌水沖洗4~6遍，即得無菌莖段； ⑵將所述無菌莖段作為外植體按5段/瓶的接種量接種在預(yù)培養(yǎng)基中，在溫度為20~25°C且光照條件下培養(yǎng)1~2周，即得預(yù)培養(yǎng)的莖段外植體； ⑶所述預(yù)培養(yǎng)的莖段外植體按5段/瓶的接種量轉(zhuǎn)接入側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度為20~25°C且光照條件下培養(yǎng)3~4周，側(cè)芽形成并生長至1cm，即得新形成的側(cè)芽； ⑷將所述新形成的側(cè)芽剪下，按5個/瓶的接種量轉(zhuǎn)接入不定苗分化培養(yǎng)基中，在溫度為20~25°C且光照條件下進行分化培養(yǎng)，3-4周后即得不定苗； (5)將生長至l~2cm的所述不定苗按5株/瓶的接種量轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基，在溫度為20~25°C且光照條件下培養(yǎng)4周即可。
2.如權(quán)利要求1所述的一種離體條件下柴達木枸杞不定苗誘導(dǎo)的方法，其特征在于:所述步驟⑵中的預(yù)培養(yǎng)基是指每升MS基本培養(yǎng)基中添加0.01-2.0mg生長素、20.0-60.0g蔗糖、3~8 g瓊脂粉，且pH值為5~6.5的培養(yǎng)基。
3.如權(quán)利要求1所述的一種離體條件下柴達木枸杞不定苗誘導(dǎo)的方法，其特征在于:所述步驟⑶中的側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是指每升MS基本培養(yǎng)基中添加有0.05-3.0mg細胞分裂素、0.05-1.0mg 生長素、200~400mg 水解酪蛋白、100~300mg 肌醇、l~3mg Vc、2~6mg 梓檬酸鈉、20.0-60.0g蔗糖、3~8g瓊脂粉，且pH值為5~6.5的培養(yǎng)基。
4.如權(quán)利要求1所述的一種離體條件下柴達木枸杞不定苗誘導(dǎo)的方法，其特征在于:所述步驟⑷中的不定苗分化培養(yǎng)基是指每升MS基本培養(yǎng)基中添加有1.0-3.0mg細胞分裂素、0.01-0.5mg 生長素、200~400mg 水解酪蛋白、100~300mg 肌醇、l~3mg Vc、2~6mg 梓檬酸鈉、20.0-60.0g蔗糖、3~8g瓊脂粉，且pH值為5~6.5的培養(yǎng)基。
5.如權(quán)利要求1所述的一種離體條件下柴達木枸杞不定苗誘導(dǎo)的方法，其特征在于:所述步驟(5)中的增殖培養(yǎng)基是指每升MS基本培養(yǎng)基中添加有1.0~2.0mg細胞分裂素、0.05-0.2mg 生長素、200~400mg 水解酪蛋白、100~300mg 肌醇、20.0-60.0g 蔗糖、3~8g 瓊脂粉，且pH值為5~6.5的培養(yǎng)基。
6.如權(quán)利要求1所述的一種離體條件下柴達木枸杞不定苗誘導(dǎo)的方法，其特征在于:所述步驟⑵、所述步驟⑶、所述步驟⑷、所述步驟(5)中的光照條件均是指光照強度為3000~10000Lux，光照時間為 12~16h/ 天。
7.如權(quán)利要求2、3、4或5所述的一種離體條件下柴達木枸杞不定苗誘導(dǎo)的方法，其特征在于:所述生長素為2，4-D、NAA、IAA中的一種。
8.如權(quán)利要求3、4或5所述的一種離體條件下柴達木枸杞不定苗誘導(dǎo)的方法，其特征在于:所述細胞分裂素為6-BA、KT、ZT中的一種。
【文檔編號】A01H4/00GK104472351SQ201410641546
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月14日
【發(fā)明者】王莉, 李毅, 胡延萍, 石琳, 王溪, 王建科, 馮承彬, 唐楠 申請人:中國科學(xué)院西北高原生物研究所