一種東亞飛蝗ATP合酶β亞基基因及其dsRNA在害蟲防治中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了蝗蟲的ATP合成酶酶β亞基cDNA的保守序列，并構(gòu)建其RNA、DNA等構(gòu)建體，利用RNAi技術(shù)沉默蝗蟲體內(nèi)ATP合酶β亞基，使體內(nèi)ATP合酶β亞基的表達(dá)明顯受到抑制，導(dǎo)致蝗蟲產(chǎn)生致死效應(yīng)，可應(yīng)用于RNAi技術(shù)對(duì)東亞飛蝗害蟲防治。
【專利說明】-種東亞飛蝗ATP合酶β亞基基因及其dsRNA在害蟲防治 中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種ATP合酶β亞基基因、dsRNA及其在東 亞飛蝗防治中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 害蟲嚴(yán)重危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，由于長期施用有機(jī)氯、有機(jī)磷等化學(xué)殺蟲劑，導(dǎo)致一系列 問題：農(nóng)藥殘留導(dǎo)致環(huán)境污染嚴(yán)重；有毒農(nóng)藥危害人類身體健康；昆蟲出現(xiàn)抗藥性，防治成 本提1?等。目如已有將生物殺蟲劑應(yīng)用于害蟲防治，但殺蟲時(shí)間較長，殺蟲效果不穩(wěn)定，因 此迫切需要新型的害蟲防治方法。
[0003] RNA干擾（RNAi)是一種通常由雙鏈RNA分子引起的特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象， 于2006年獲得諾貝爾獎(jiǎng)。這一發(fā)現(xiàn)不僅為基因的功能研究提供了方法上的突破，同時(shí)也為 人類的疾病治療和害蟲防治開辟了新的途徑。2008年，Price和Gatehouse總結(jié)了眾多實(shí) 驗(yàn)結(jié)果后，提出來基于RNAi的害蟲防治策略?；赗NA干擾技術(shù)的害蟲防治具有如下優(yōu)勢： 1)選擇對(duì)害蟲專一的基因進(jìn)行干擾，對(duì)高等動(dòng)物和人類是安全的；2)對(duì)害蟲具有專一性， 對(duì)非靶標(biāo)生物無殺傷作用；對(duì)環(huán)境無毒無害。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種核酸分子，可以編碼東亞飛蝗ATP合成酶β亞基的基 因，并作為藥物靶點(diǎn)，使蝗蟲致死。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下措施實(shí)現(xiàn)的：
[0006] -種核酸分子，其特征在于：序列為SEQ ID NO. 1及其互補(bǔ)序列。
[0007] 優(yōu)選地，上述核酸分子中，SEQ ID NO. 2序列及其互補(bǔ)序列可以作為有效的藥物靶 點(diǎn)，干擾基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于針對(duì)上述核酸分子，提供有效干擾其轉(zhuǎn)錄表達(dá)的 dsRNA(雙鏈核糖核酸）。
[0009] RNA構(gòu)建體，其包含至少一個(gè)雙鏈RNA區(qū)，其至少一條鏈包含與上述任一核酸分子 互補(bǔ)的核苷酸序列。
[0010] 上述RNA構(gòu)建體，其中所述至少一個(gè)雙鏈RNA區(qū)至少具有17bp。
[0011] 優(yōu)選地，RNA構(gòu)建體，其序列為SEQ ID NO. 3或其互補(bǔ)序列。
[0012] DNA構(gòu)建體，包含了上述核酸分子，或者包含編碼上述RNA構(gòu)建體的區(qū)域。
[0013] 表達(dá)構(gòu)建體，包含了上述DNA構(gòu)建體。
[0014] 宿主細(xì)胞，包含上述RNA構(gòu)建體、DNA構(gòu)建體或表達(dá)構(gòu)建體。
[0015] 殺蟲組合物，包含了上述RNA構(gòu)建體和/或上述DNA構(gòu)建體和/或上述表達(dá)構(gòu)建 體和/或上述宿主細(xì)胞以及適合的載體。
[0016] 上述任一項(xiàng)RNA構(gòu)建體和/或DNA構(gòu)建體和/或表達(dá)構(gòu)建體和/或宿主細(xì)胞以及 適合的載體和/或殺蟲組合物在防治蝗蟲中的應(yīng)用。
[0017] 有益效果
[0018] 1.本發(fā)明獲得了蝗蟲的ATP合成酶酶β亞基CDNA的保守序列，并構(gòu)建其RNA、DNA 等構(gòu)建體沉默了蝗蟲體內(nèi)ATP合酶β亞基，經(jīng)驗(yàn)證體內(nèi)ATP合酶β亞基的表達(dá)明顯受到 抑制，并導(dǎo)致蝗蟲產(chǎn)生致死效應(yīng)，本發(fā)明可應(yīng)用于RNAi技術(shù)對(duì)東亞飛蝗害蟲防治。
[0019] 2.本發(fā)明用于防治蝗蟲尤其是東亞飛蝗，種屬特異性強(qiáng)，不會(huì)對(duì)其它物種造成干 擾，如蜜蜂、人等；本發(fā)明基因特異性強(qiáng)，不會(huì)對(duì)除ATP合酶或β亞基之外的基因產(chǎn)生干擾 影響。
[0020] 3.本發(fā)明防治蝗蟲具有高效性，尤其是東亞飛蝗，劑量?。╠sRNA用量為IOOng)， 起效快（處理2天左右導(dǎo)致蝗蟲致死）。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1五齡飛蝗注射SEQ ID NO : 2合成的dsRNA后的致死情況。
[0022] 圖2五齡飛蝗注射序列為SEQ ID NO :3的dsRNA后ATP合酶β亞基基因 (LmATP5B)的不同時(shí)間點(diǎn)mRNA表達(dá)，RP49做為內(nèi)參基因。12,24,36h為注射dsRNA后的小 時(shí)數(shù)。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。以下實(shí)施例僅限于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0024] 實(shí)施例1 :飛蝗ATP合酶β亞基基因及其dsRNA的獲得
[0025] i、飛蝗ATP合酶β亞基基因的獲得
[0026] 1)飛蝗ATP合酶β亞基基因在飛蝗EST數(shù)據(jù)庫的搜索
[0027] 基于飛蝗的EST數(shù)據(jù)庫，采用生物信息學(xué)方法對(duì)飛蝗ATP合酶β亞基基因進(jìn)行搜 索，經(jīng)過序列拼接及比對(duì)后，共獲得1條飛蝗ATP合酶β亞基基因。
[0028] 2)飛蝗ATP合酶β亞基基因引物的設(shè)計(jì)
[0029] 基于已獲得LmATP5B的堿基序列，設(shè)計(jì)引物。
[0030] 3)飛蝗總RNA獲得
[0031] 選取大小一致雌雄各半飛蝗5齡若蟲，3頭一組，冷凍于液氮中，待提取RNA，具體 操作步驟參照TRIzol (Invitrogen)說明書。
[0032] 4)第一鏈cDNA的合成
[0033] 參照Promega M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶試劑說明書，進(jìn)行第一鏈cDNA的合成。
[0034] 5)飛蝗ATP合酶β亞基基因的獲得
[0035] 根據(jù)Thermo Fusion說明書進(jìn)行PCR，進(jìn)一步克隆獲得飛蝗ATP合酶β亞基基因 cDNA序列。
[0036] 6)飛蝗ATP合酶β亞基基因堿基序列的分析
[0037] 利用Expasy網(wǎng)站中相關(guān)在線軟件和GENED0C、基因探索者等軟件分析所得序列， 之后在NCBI網(wǎng)站中使用BLAST功能進(jìn)行序列同源性比對(duì)。經(jīng)序列驗(yàn)證后，獲得的ATP合酶 β亞基LmATP5B)序列全長1914bp，開放閱讀框1575bp。
[0038] II、飛蝗ATP合酶β亞基基因片段及其dsRNA合成
[0039] 1)飛蝗ATP合酶β亞基基因片段的獲得
[0040] 基于本研究所得到飛蝗ATP合酶β亞基基因的序列SEQ ID NO : 1 ; 1，設(shè)計(jì)dsRNA 引物，引物序列分別為SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5。選取大小一致雌雄各半東亞飛蝗5齡 若蟲，三頭一組，凍存于液氮中，待提取RNA，具體操作步驟參照TRIzol (Invitrogen)說明 書。M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶將所提RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，以此為模板，以SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得ATP合酶β亞基基因片段。
[0041] 2)飛蝗ATP合酶β亞基dsRNA的合成
[0042] 膠回收試劑盒純化基因片段，試劑盒純化后按照MEGAscript high yield transcription kit (Ambion)說明書合成dsRNA，dsRNA濃度采用紫外分光光度計(jì)測定，并 稀釋至終濃度為20ng/y 1。所述的dsRNA片段如SEQ ID NO :3所示。
[0043] 實(shí)施例2 :飛蝗ATP合酶β亞基dsRNA致死五齡飛蝗
[0044] 1、飛蝗ATP合酶β亞基dsRNA注射
[0045] 選取五齡第三天、大小均一、健康狀況一致的若蟲用于注射上述合成的dsRNA(SEQ ID NO :3)，25μ 1規(guī)格微量注射器用于注射，注射時(shí)不可用力過大，順著血液流動(dòng)的方向， 側(cè)腹部第2至3腹節(jié)的連接處作為注射點(diǎn)，避開氣門。注射dsRNA的量為lOOng，并設(shè)置 dsGFP (IOOng)的對(duì)照組，每組20頭蟲，3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共計(jì)60頭。注射完畢后，將試蟲用 朔料籠子飼養(yǎng)（光照：黑暗時(shí)間為14h :10h，溫度30±2°C )，給以新鮮小麥幼苗。
[0046] 2、注射dsRNA后五齡飛蝗表型的觀察
[0047] 五齡幼蟲經(jīng)注射dsRNA后，注射dsGFP對(duì)照組5天后開始蛻皮并全部成功蛻皮至 成蟲，蛻皮至成蟲后形態(tài)活力正常。注射SEQ ID NO :3的dsRNA的處理組幼蟲共60頭，第 2天開始死亡，第4天死亡率超過90 %，生測圖如圖1和表1所示。
[0048] 3、飛蝗ATP合酶β亞基基因 mRNA水平檢測
[0049] 對(duì)5齡飛蝗若蟲dsRNA注射后不同時(shí)間點(diǎn)的沉默效率檢測，選擇注射后12h、24h 和36h的蟲體作為RNA提取對(duì)象，每組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。提取各樣品的總 RNA并反轉(zhuǎn)錄成第一鏈eDNA，用RT-PCR檢測目的基因（LmATP5B)和管家基因（RP49)的表 達(dá)量（圖2)。
[0050] 經(jīng)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，飛蝗體內(nèi)注射ATP合酶β亞基雙鏈RNA后，LT5tl為2. 4±0. 4天； mRNA表達(dá)量在注射后12小時(shí)、24小時(shí)和36小時(shí)依次降低了 91. 7%，93. 6%和95. 7% (見 表2和圖2)。而注射GFP dsRNA的東亞飛蝗體內(nèi)的ATP合酶β亞基的mRNA沒有顯著性的 變化，也不引起致死。
[0051] 按照實(shí)施例2所述方法將dsRNA (SEQ ID NO :3)分別注射入蜜蜂、蜘蛛體內(nèi)，未發(fā) 現(xiàn)致死現(xiàn)象。
[0052] 表1實(shí)施例2中注射dsRNA后體內(nèi)β亞基相對(duì)表達(dá)量
[0053]

【權(quán)利要求】
1. 一種核酸分子，其特征在于：序列為SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2,或SEQ ID NO. 1 或SEQ ID NO. 2的互補(bǔ)序列。
2. -種RNA構(gòu)建體，其包含至少一個(gè)雙鏈RNA區(qū)，其至少一條鏈包含與權(quán)利要求1或 2所述任一核酸分子互補(bǔ)的核苷酸序列。
3. 權(quán)利要求2的RNA構(gòu)建體，其中所述至少一個(gè)雙鏈RNA區(qū)至少為17bp。
4. 權(quán)利要求2的RNA構(gòu)建體，序列為SEQ ID NO. 3或其互補(bǔ)序列。
5. -種DNA構(gòu)建體，包含了權(quán)利要求1或2核酸分子，或者包含編碼權(quán)利要求3或4 所述RNA構(gòu)建體的區(qū)域。
6. 表達(dá)構(gòu)建體，包含了如權(quán)利要求5所述DNA構(gòu)建體。
7. -種宿主細(xì)胞，包含權(quán)利要求3或4所述RNA構(gòu)建體或權(quán)利要求5所述DNA構(gòu)建體 或權(quán)利要求6所述表達(dá)構(gòu)建體。
8. -種殺蟲組合物，包含了權(quán)利要求3或4所述RNA構(gòu)建體和/或權(quán)利要求5所述 DNA構(gòu)建體和/或權(quán)利要求6所述表達(dá)構(gòu)建體和/或權(quán)利要求7所述宿主細(xì)胞以及適合的 載體。
9. 權(quán)利要求3或4所述RNA構(gòu)建體和/或權(quán)利要求5所述DNA構(gòu)建體和/或權(quán)利要 求6所述表達(dá)構(gòu)建體和/或權(quán)利要求7所述宿主細(xì)胞以及適合的載體和/或權(quán)利要求8所 述殺蟲組合物在防治蝗蟲中的應(yīng)用。
10. 如權(quán)利要求9所述的蝗蟲為東亞飛蝗。
【文檔編號(hào)】A01N57/16GK104404042SQ201410647729
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月14日
【發(fā)明者】夏玉先, 胡軍 申請(qǐng)人:重慶大學(xué), 夏玉先