一種利用香蕉莖尖薄片提高香蕉植株枯萎病抗性的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用香蕉莖尖薄片提高香蕉植株枯萎病抗性的方法。巴西蕉莖尖薄片的EMS誘變及枯萎病菌粗毒素連續(xù)篩選育種技術(shù)，利用香蕉莖尖薄片為外植體，先對(duì)其進(jìn)行化學(xué)誘變處理，獲得再生植株；再生植株再以香蕉莖尖薄片在枯萎病粗毒素為選擇壓力進(jìn)行抗性誘導(dǎo)和篩選，香蕉薄片誘導(dǎo)組合為以4mg/L的6-BA和0.2mg/L的IAA激素配合，EMS處理以200mMol/L濃度和處理30min；得到存活香蕉苗繼續(xù)以莖尖薄片在香蕉枯萎病粗毒素為選擇壓力進(jìn)行連續(xù)枯萎病抗性篩選，進(jìn)而顯著提高香蕉植株枯萎病抗性，平均提高25%-30%，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明培育枯萎病抗性香蕉植株所需時(shí)間較短、效率較高，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種利用香蕉莖尖薄片提高香蕉植株枯萎病抗性的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體說(shuō)，本發(fā)明具體涉及一種利用香蕉莖尖薄片提高香蕉植株枯萎病抗性的【技術(shù)領(lǐng)域】，進(jìn)一步講本發(fā)明涉及一種利用香蕉莖尖薄片提高香蕉植株枯萎病抗性的方法育種【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]香蕉(Musa spp.)是世界上最重要的水果之一，據(jù)FAO統(tǒng)計(jì)，2011年全球種植香蕉面積達(dá)到515.8萬(wàn)hm2 (FA0.FA0STAT) [I]。香蕉也是海南重要的經(jīng)濟(jì)作物，種植面積居全國(guó)第3位，產(chǎn)量居全國(guó)第2位[2]。目前香蕉枯萎病對(duì)我國(guó)和世界的香蕉生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅[3-5]，尤其是香蕉枯萎病F0C-TR4嚴(yán)重危害香蕉卡文迪許(Carendish)栽培種[3，4]。現(xiàn)已明確由4號(hào)生理小種引發(fā)的香蕉枯萎病主要分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)[6-8]?，F(xiàn)已蔓延至我國(guó)大部分香蕉種植產(chǎn)區(qū)[5，9]。
[0003]防治香蕉枯萎病的方法主要有生物防治、化學(xué)防治、抗病品種選育、輪作以及土壤消毒等。病原菌容易對(duì)化學(xué)藥劑產(chǎn)生抗藥性，藥劑殘留也會(huì)導(dǎo)致環(huán)境污染和食品安全等問(wèn)題；常規(guī)抗病品種選育周期不但長(zhǎng)，且抗病性與農(nóng)藝性狀很難兼顧；輪作和土壤消毒在實(shí)際生產(chǎn)中并未取得有效防治效果[10-12]。在亞洲許多育種家利用卡文迪許栽培種進(jìn)行組培，利用隨機(jī)其產(chǎn)生的誘變中選擇到對(duì)F0C-TR4有部分抗性的的香蕉品種，在病區(qū)進(jìn)行輪作等措施，產(chǎn)生了一定的效果[13-15]。Matsmoto[16]等將香蕉枯萎病菌的主要成分純鐮刀菌酸添加到組織培養(yǎng)基中來(lái)篩選耐病菌毒素的香蕉突變體，并進(jìn)一步用病菌與香蕉組織共培養(yǎng)方法獲得了病菌毒素，最終以病菌毒素為選擇壓篩選得到了抗香蕉枯萎病菌I號(hào)小種的突變體。已有研究大都利用香蕉組培苗一代誘變和一代篩選，或者直接利用多芽體為材料篩選，這都需要進(jìn)行海量的篩選才有可能選到目標(biāo)材料，費(fèi)用高、效率很低，而且海量的篩選也是很多實(shí)驗(yàn)室難以承受的。利用巴西蕉莖尖薄片的EMS誘變是香蕉體細(xì)胞誘變，能與誘變劑充分接觸，誘變后再分化形成莖尖，保證了誘變效率。誘變后的香蕉莖尖薄片的枯萎病菌粗毒素連續(xù)篩選可節(jié)約薄片長(zhǎng)到莖尖時(shí)所需要的時(shí)間，目前未見(jiàn)有關(guān)報(bào)道。因此一種利用香蕉莖尖薄片提高香蕉植株枯萎病抗性的方法目前未見(jiàn)報(bào)道。
[0004]參考文獻(xiàn):
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0020]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中未見(jiàn)有關(guān)利用巴西蕉莖尖薄片的EMS誘變及枯萎病菌粗毒素連續(xù)篩選育種技術(shù)提高香蕉植株枯萎病抗性的方法的技術(shù)現(xiàn)狀。本發(fā)明旨在提供一種利用香蕉莖尖薄片提高香蕉植株枯萎病抗性的方法，通過(guò)巴西蕉莖尖薄片的EMS誘變及枯萎病菌粗毒素連續(xù)篩選育種技術(shù)，進(jìn)而顯著提高香蕉植株枯萎病抗性，獲得改良的香蕉枯萎病抗性植株。本發(fā)明培育枯萎病抗性香蕉植株效率較高、所需時(shí)間較短，具有重要應(yīng)用價(jià)值。
[0021]本發(fā)明采用的主要技術(shù)方案:
本發(fā)明巴西蕉莖尖薄片的EMS誘變及枯萎病菌粗毒素連續(xù)篩選育種技術(shù)，利用香蕉莖尖薄片為外植體，先對(duì)其進(jìn)行化學(xué)誘變處理，獲得再生植株；再生植株再以香蕉莖尖薄片在枯萎病粗毒素為選擇壓力進(jìn)行抗性誘導(dǎo)和篩選；得到的存活香蕉苗繼續(xù)以莖尖薄片在香蕉枯萎病粗毒素為選擇壓力進(jìn)行連續(xù)枯萎病抗性篩選，進(jìn)而顯著提高香蕉植株枯萎病抗性，抗病性平均提高25%-30%，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明培育枯萎病抗性香蕉植株所需時(shí)間較短、效率較高，獲得顯著的技術(shù)效果，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
[0022]本發(fā)明具體提供一種利用香蕉莖尖薄片提高香蕉植株枯萎病抗性的方法，采用的方法步驟具體如下:
(I)巴西蕉莖尖薄片的EMS誘變:將直接購(gòu)買(mǎi)的巴西蕉(Musa AAA Cavendish subgroupCV.Brazil)吸芽在無(wú)菌條件下將切好的巴西蕉莖尖2_3mm左右薄片，其中根部薄片棄之，直接泡在含EMS 200mMol/L濃度的誘變劑中處理30min ;EMS 200mMol/L濃度配置采用將EMS原液先用無(wú)菌水稀釋?zhuān)儆?.lmol/L, Ph=5.6的磷酸緩沖液稀釋。
[0023](2)香蕉莖尖薄片的枯萎病粗毒素多輪連續(xù)篩選:經(jīng)EMS突變處理后的巴西蕉莖尖薄片植入到設(shè)置的培養(yǎng)基中，在27°C，光照周期12 (光照)/12 (黑暗)條件下培養(yǎng)30天，誘導(dǎo)出再生植株；將存活的再生植株繼續(xù)切成薄片加有含40μ8/πι1鐮刀菌酸濃度的香蕉枯萎病粗毒素的上述設(shè)置的培養(yǎng)基為選擇壓力誘導(dǎo)再生植株，同樣條件培養(yǎng)，誘導(dǎo)出再生植株再切成薄片以同樣條件連續(xù)篩選誘導(dǎo)至7輪，PH至5.8。
[0024]所述的設(shè)置培養(yǎng)基含MS基本鹽十30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂粉+改良的維生素/氨基酸溶液+4mg/L的6-BA和0.2mg/L的IAA。
[0025]所述改良的維生素/氨基酸溶液配方:1.19Mmol / L的維生素BI，0.97Mmol /L的維生素Β6，0.13Mmol / L的D-泛酸鈣，1.62Mmol / L的煙酸，0.0lMmol / L的葉酸,26.64Mmol / L的甘氨酸，113.57Mmol / L的抗壞血酸,0.07Mmol / L的氨基苯酸，56.82Mmol / L 的 L-半胱氨酸,0.0llMmol / L 的核黃素,555.06Mmol / L 的肌醇，370.94Mmol / L的硫酸腺喋呤，551.88Mmol / L的酪氨酸。
[0026]香蕉枯萎病菌粗毒素液:香蕉枯萎病4號(hào)生理小種(F.0xysporum f sp.cubense4)在查彼氏培養(yǎng)基于(25±2) °C,120r/min的振蕩搖床中培養(yǎng)12d，濾去菌絲后，濾液經(jīng)8000rpm離心20min,取上清液無(wú)菌過(guò)濾,濾液即為粗毒素液，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0027](3)再生苗生根:連續(xù)篩選誘導(dǎo)7輪后的無(wú)菌苗接入生根培養(yǎng)基，40天后長(zhǎng)出完整根系后方可進(jìn)行煉苗，并最終獲得枯萎病抗性得到顯著提高的香蕉苗植株。
[0028]生根培養(yǎng)基配方采用MS基本鹽+0.3mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂+10%椰子水，PH至5.8。
[0029]通過(guò)上述利用香蕉莖尖薄片提高香蕉植株枯萎病抗性的方法技術(shù)步驟可顯著提高香蕉植株枯萎病抗性，效率高、獲得枯萎病抗性香蕉植株時(shí)間短。
[0030]本發(fā)明中，采用的EMS原液、MS基本鹽、6-BA和IAA都是本領(lǐng)域常見(jiàn)的選用對(duì)象，選用的查彼氏培養(yǎng)基也是本領(lǐng)域常見(jiàn)的培養(yǎng)基。
[0031]EMS:甲基磺酸乙酯。
[0032]MS 基本鹽:其中大量元素:NH4N03 1650mg/L, KNO31900 mg/L, CaCl2.2H20 440mg/L, MgSO4.7H20 370 mg/L, KH2PO4 700 mg/L，微量元素:KI 0.83 mg/L, H3BO3 6.2 mg/L,MnS044H20 22.3 mg/L, ZnS047H20 8.6 mg/L, Na2Mn042H20 0.25 mg/L, CuS045 H2O 0.025 mg/L，CoC126 H2O 0.025 mg/L, FeS047H20 (27.8) +Na2-EDTA2 H2O (37.3) mg/L。
[0033]6-BA:6-芐氨基腺嘌呤。
[0034]IAA:卩引哚乙酸。
[0035]查彼氏培養(yǎng)基成分:NaNO33g，KH2PO4 lg，MgSO4.7H20 0.5g，KCI 0.5g，F(xiàn)eSO40.0lg,鹿糖 30g,瓊脂 20g,蒸懼水 1000mL。
[0036]通過(guò)實(shí)施本發(fā)明具體的技術(shù)指標(biāo)，實(shí)現(xiàn)本
【發(fā)明內(nèi)容】
，可以達(dá)到以下有益效果:
(I)采用本發(fā)明提供的2-3mm香蕉莖尖薄片，靠近根部薄片棄之后，直接泡在含EMS誘變劑溶液中，與直接浸泡香蕉莖尖相比有利于誘變劑與薄片植物細(xì)胞充分接觸，提高誘變效果。
[0037](2)再此基礎(chǔ)上，香蕉莖尖薄片直接以枯萎病粗毒素篩選，比利用幼苗進(jìn)行枯萎病粗毒素篩選，抗逆性選擇壓更高，同時(shí)也省去了幼苗篩選步驟，節(jié)約了該階段的篩選時(shí)間；通過(guò)7輪枯萎病抗性連續(xù)篩選，香蕉枯萎病平均發(fā)病率提高了 25-30%，效果顯著。
[0038]

【具體實(shí)施方式】
[0039]下面，舉實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實(shí)施例。
[0040]本發(fā)明中涉及到的主要原輔材料和設(shè)備有:
主要原輔材料:香蕉巴西苗是海南當(dāng)?shù)爻墒焐唐菲贩N，可以通過(guò)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)獲得。育苗袋:10cm*12cm，底部側(cè)部打孔的營(yíng)養(yǎng)袋。
[0041]主要試劑:鹿糖，瓊脂粉，維生素BI，維生素B6，D-泛酸鈣，煙酸，葉酸，甘氨酸，抗壞血酸，氨基苯酸，L-半胱氨酸，核黃素，肌醇，硫酸腺喋呤，酪氨酸；采用的EMS原液、MS基本鹽、6-BA和IAA都是本領(lǐng)域常見(jiàn)的選用對(duì)象，選用的查彼氏培養(yǎng)基也是本領(lǐng)域常見(jiàn)的培養(yǎng)基。
[0042]LRH-150-G型光照培養(yǎng)箱(上海儀器廠)；超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰)醫(yī)用高壓蒸汽滅菌鍋(日本三洋)，可調(diào)移液器(eppendor )、美國(guó)純水系統(tǒng)(Mi I ib )。
[0043]本發(fā)明中選用的所有原輔材料，所選用的所有試劑和儀器都為本領(lǐng)域熟知選用的，但不限制本發(fā)明的實(shí)施，其他本領(lǐng)域熟知的一些試劑和設(shè)備都可適用于本發(fā)明以下實(shí)施方式的實(shí)施。
[0044]實(shí)施例一:利用香蕉莖尖薄片顯著提高香蕉植株枯萎病抗性的方法利用香蕉莖尖薄片提高香蕉植株枯萎病抗性的方法采用的步驟具體如下:
(I)巴西蕉莖尖薄片的EMS誘變:將直接購(gòu)買(mǎi)的巴西蕉(Musa MA Cavendish subgroupCV.Brazil)吸芽在無(wú)菌條件下，將切好的巴西蕉莖尖2_3mm薄片，其中根部薄片棄之，直接泡在含EMS 200mMol/L濃度的誘變劑中處理30min ；EMS 200mMol/L濃度配置采用將EMS原液先用無(wú)菌水稀釋?zhuān)儆?.lmol/L, ph=5.6的磷酸緩沖液稀釋。
[0045](2)香蕉莖尖薄片的誘導(dǎo):經(jīng)EMS突變處理后的巴西蕉莖尖薄片植入到設(shè)置培養(yǎng)基中，PH至5.8，在27°C，光照周期12 (光照)/12 (黑暗)條件下培養(yǎng)30天，誘導(dǎo)出再生植株；巴西蕉莖尖薄片按照1000個(gè)左右薄片，每瓶5個(gè)植入到設(shè)置的培養(yǎng)基中。
[0046]所述的設(shè)置培養(yǎng)基含MS基本鹽十30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂粉+改良的維生素/氨基酸溶液+4mg/L的6-BA和0.2mg/L的IAA。
[0047]所述改良的維生素/氨基酸溶液配方:1.19Mmol / L的維生素BI，0.97Mmol /L的維生素Β6，0.13Mmol / L的D-泛酸鈣，1.62Mmol / L的煙酸，0.0lMmol / L的葉酸,26.64Mmol / L的甘氨酸，113.57Mmol / L的抗壞血酸,0.07Mmol / L的氨基苯酸，56.82Mmol / L 的 L-半胱氨酸,0.0llMmol / L 的核黃素,555.06Mmol / L 的肌醇，370.94Mmol / L的硫酸腺喋呤，551.88Mmol / L的酪氨酸。
[0048](3)莖尖薄片的枯萎病粗毒素多次連續(xù)篩選:上一步存活的再生植株繼續(xù)切成1000個(gè)左右薄片，以上述培養(yǎng)基加有含4(^g/ml鐮刀菌酸濃度的香蕉枯萎病粗毒素為選擇壓力誘導(dǎo)再生植株，同樣條件培養(yǎng)，誘導(dǎo)出再生植株再切成1000個(gè)左右薄片以上述培養(yǎng)基加有香蕉枯萎病粗毒素誘導(dǎo)連續(xù)篩選誘導(dǎo)至7輪。
[0049](4)再生苗生根:連續(xù)篩選誘導(dǎo)7輪后的無(wú)菌苗接入生根培養(yǎng)基，40天后長(zhǎng)出完整根系后方可進(jìn)行煉苗。
[0050]生根培養(yǎng)基配方采用MS基本鹽+0.3mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂+10%椰子水，PH至5.8。
[0051](5)最終獲得枯萎病抗性得到顯著提高的香蕉苗植株:在遮陽(yáng)大棚中打開(kāi)已經(jīng)生根的香蕉苗瓶蓋馴化，3天后將幼苗從培養(yǎng)瓶中輕輕取出，用自來(lái)水洗凈幼苗根部的培養(yǎng)基，將把幼苗植入配置好的營(yíng)養(yǎng)土中(市場(chǎng)上的普通花土:椰糠=1:1)的育苗袋中并壓實(shí)，種植后澆足水，以后每隔2-3天澆一次水；定植后7d內(nèi)棚內(nèi)空氣濕度應(yīng)保持在95%左右，溫度26度左右；7天后通風(fēng)排氣，降低空氣濕度，減少真菌病害發(fā)生的可能；當(dāng)植株長(zhǎng)有10片葉時(shí)，且生長(zhǎng)健壯，根系發(fā)達(dá)，即可進(jìn)行植株的枯萎病抗性鑒定。
[0052]選取較為健壯的300株香蕉苗，同時(shí)以市場(chǎng)買(mǎi)來(lái)同樣時(shí)期的香蕉苗300為對(duì)照，沒(méi)處理100株,三重復(fù),每株接種體用量為5ml,分生孢子懸浮液濃度為4X 16孢子/ml ;將枯萎病菌濾液浸泡受傷根系香蕉苗2小時(shí)，30-50d后開(kāi)始調(diào)查發(fā)病情況。
[0053]上述枯萎病抗性的鑒定表明，處理間差異不顯著，不同處理對(duì)照香蕉苗枯萎病發(fā)病率在97%-99%之間，平均發(fā)病98.4 %，經(jīng)篩選后的其不同處理香蕉苗枯萎病發(fā)病率在70%-73%之間，平均發(fā)病率73.0%，與未經(jīng)篩選的對(duì)照相比枯萎病抗性提高了 25%-30%。以上結(jié)果表明最終獲得的香蕉苗枯萎病抗性提高效果顯著。
[0054]實(shí)施例二:利用香蕉莖尖薄片顯著提高香蕉植株枯萎病抗性的方法，篩選時(shí)間較短。
[0055]按以下具體誘變方法:
(I)巴西蕉莖尖薄片的EMS誘變:將直接購(gòu)買(mǎi)的巴西蕉(Musa MA Cavendish subgroupCV.Brazil)吸芽在無(wú)菌條件下，將切好的巴西蕉莖尖2_3mm薄片2500個(gè)左右，其中靠近根部薄片棄之，分批直接泡在含EMS 200mMol/L濃度的誘變劑中處理30min。完成該過(guò)程需要I天時(shí)間。
[0056](2)香蕉莖尖薄片的誘導(dǎo):經(jīng)EMS突變處理后的巴西蕉莖尖薄片植入到設(shè)置培養(yǎng)基中，PH至5.8，在27°C，光照周期12 (光照)/12 (黑暗)條件下培養(yǎng)30天，誘導(dǎo)出再生植株；巴西蕉莖尖薄片按照1000個(gè)左右薄片，每瓶5個(gè)植入到設(shè)置的培養(yǎng)基中。完成該過(guò)程需要約30天時(shí)間。
[0057](3)莖尖薄片的枯萎病粗毒素多次連續(xù)篩選:上一步存活的再生植株繼續(xù)切成1000個(gè)左右薄片，以上述培養(yǎng)基加有含4(^g/ml鐮刀菌酸濃度的香蕉枯萎病粗毒素為選擇壓力誘導(dǎo)再生植株，需要30多天時(shí)間；誘導(dǎo)出存活的再生植株再切成1000個(gè)左右薄片以上述培養(yǎng)基加有香蕉枯萎病粗毒素誘導(dǎo)連續(xù)篩選誘導(dǎo)至7輪，需要210多天時(shí)間。
[0058](4)再生苗生根:連續(xù)篩選誘導(dǎo)7輪后的1000株左右的無(wú)菌苗接入生根培養(yǎng)基，40天后長(zhǎng)出完整根系后方可進(jìn)行煉苗。完成該過(guò)程需要約50天時(shí)間。
[0059](5)煉苗:最終獲得枯萎病抗性得到顯著提高的香蕉苗植株:在遮陽(yáng)大棚中打開(kāi)已經(jīng)生根的香蕉苗瓶蓋馴化，3天后將幼苗從培養(yǎng)瓶中輕輕取出，用自來(lái)水洗凈幼苗根部的培養(yǎng)基，將把幼苗植入配置好的營(yíng)養(yǎng)土中(市場(chǎng)上的普通花土:椰糠=1:1)的育苗袋中并壓實(shí)，種植后澆足水，以后每隔2-3天澆一次水；定植后7d內(nèi)棚內(nèi)空氣濕度應(yīng)保持在95%左右，溫度26度左右；7天后通風(fēng)排氣，降低空氣濕度，減少真菌病害發(fā)生的可能。完成該過(guò)程需要約20天時(shí)間。
[0060](6)枯萎病抗性鑒定:選取較為健壯的300株香蕉苗，同時(shí)以市場(chǎng)買(mǎi)來(lái)同樣時(shí)期的香蕉苗300為對(duì)照，沒(méi)處理100株，三重復(fù)，每株接種體用量為5ml，分生孢子懸浮液濃度為4X 16孢子/ml ;將枯萎病菌濾液浸泡受傷根系香蕉苗2小時(shí)，30-50d后開(kāi)始調(diào)查發(fā)病情況。該過(guò)程需要約50天。
[0061]統(tǒng)計(jì)以上香蕉薄片枯萎病抗性篩選7輪時(shí)間，不包括第六步枯萎病抗性鑒定，共需要大約為310多天，大約為I年時(shí)間。
[0062]設(shè)置對(duì)照，其具體方法如下:
(O巴西蕉莖尖薄片的EMS誘變:同上。完成該過(guò)程需要I天時(shí)間。
[0063](2)香蕉莖尖薄片的誘導(dǎo):同上。完成該過(guò)程需要約30天時(shí)間。
[0064](3)第一輪枯萎病抗性篩選:上一步存活的再生植株繼續(xù)切成2_3mm個(gè)左右薄片，以上述培養(yǎng)基不加鐮刀菌酸直接誘導(dǎo)再生植株，需要20多天時(shí)間；誘導(dǎo)出的再生植株按如下方法繼續(xù)。
[0065]再生苗生根，同以上步驟4。完成該過(guò)程需要約50天時(shí)間。
[0066]煉苗:同以上步驟5。完成該過(guò)程需要約20天時(shí)間。
[0067]枯萎病抗性篩選:同以上步驟6。該過(guò)程需要約50天。
[0068](4)枯萎病抗性篩選2輪:上一步存活的再生植株滅菌后重復(fù)上述步驟3。該過(guò)程需要天數(shù)同上150天。該輪不同處理對(duì)照香蕉苗枯萎病發(fā)病率在90%-94%之間，平均發(fā)病92%左右。統(tǒng)計(jì)對(duì)照香蕉薄片枯萎病抗性篩選2輪共需要時(shí)間大約為320多天，大約為I年時(shí)間。
[0069]結(jié)論:兩者相比對(duì)照方法枯萎病菌篩選2輪需要320天，最終獲得的香蕉苗枯萎病發(fā)病率在92%左右。而本專(zhuān)利方法枯萎病菌粗毒素篩選7輪需要310天，最終獲得的香蕉苗枯萎病發(fā)病率在73%左右。
【權(quán)利要求】
1.一種利用香蕉莖尖薄片提高香蕉植株枯萎病抗性的方法，其特征在于，采用的方法步驟具體如下: (1)巴西蕉莖尖薄片的EMS誘變:將直接購(gòu)買(mǎi)的巴西蕉(MusaMA Cavendish subgroupCV.Brazil)吸芽在無(wú)菌條件下將切好的巴西蕉莖尖2_3mm左右薄片，其中根部薄片棄之，直接泡在含EMS誘變劑中處理30min ； (2)香蕉莖尖薄片的枯萎病粗毒素多輪連續(xù)篩選:經(jīng)EMS突變處理后的巴西蕉莖尖薄片植入到設(shè)置的培養(yǎng)基中，在27°C，光照周期12 (光照)/12 (黑暗)條件下培養(yǎng)30天，誘導(dǎo)出再生植株；將存活的再生植株繼續(xù)切成薄片加有含40μ8/πι1鐮刀菌酸濃度的香蕉枯萎病粗毒素的上述設(shè)置的培養(yǎng)基為選擇壓力誘導(dǎo)再生植株，同樣條件培養(yǎng)，誘導(dǎo)出再生植株再切成薄片以同樣條件連續(xù)篩選誘導(dǎo)7輪，PH至5.8; 所述的設(shè)置培養(yǎng)基含MS基本鹽十30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂粉+改良的維生素/氨基酸溶液 +4mg/L 的 6-BA 和 0.2mg/L 的 IAA; (3)再生苗生根:連續(xù)篩選誘導(dǎo)7輪后的無(wú)菌苗接入生根培養(yǎng)基，40天后長(zhǎng)出完整根系后方可進(jìn)行煉苗，并最終獲得枯萎病抗性得到顯著提高的香蕉苗植株。
2.如權(quán)利要求1所述的一種利用香蕉莖尖薄片提高香蕉植株枯萎病抗性的方法，其特征在于，巴西蕉莖尖切好為2-3_左右薄片，直接泡在含EMS 200mMol/L濃度的誘變劑中；EMS 200mMol/L濃度配置采用^fEMS原液先用無(wú)菌水稀釋?zhuān)儆?.lmol/L,Ph=5.6的磷酸緩沖液稀釋。
3.如權(quán)利要求1所述的一種利用香蕉莖尖薄片提高香蕉植株枯萎病抗性的方法，其特征在于,所述的改良的維生素/氨基酸溶液配方:1.19Mmol / L的維生素B1，0.97Mmol /L的維生素Β6，0.13Mmol / L的D-泛酸鈣，1.62Mmol / L的煙酸，0.0lMmol / L的葉酸,26.64Mmol / L的甘氨酸，113.57Mmol / L的抗壞血酸,0.07Mmol / L的氨基苯酸，56.82Mmol / L 的 L-半胱氨酸,0.0llMmol / L 的核黃素,555.06Mmol / L 的肌醇，370.94Mmol / L的硫酸腺喋呤，551.88Mmol / L的酪氨酸。
4.如權(quán)利要求1所述的一種利用香蕉莖尖薄片提高香蕉植株枯萎病抗性的方法，其特征在于，所述的香蕉枯萎病菌粗毒素液采用，將香蕉枯萎病4號(hào)生理小種(F.0xysporum fsp.cubense 4)在查彼氏培養(yǎng)基于(25±2) °C, 120r/min的振蕩搖床中培養(yǎng)12d,濾去菌絲后，濾液經(jīng)8000rpm離心20min,取上清液無(wú)菌過(guò)濾,濾液即為粗毒素液，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 5.如權(quán)利要求1所述的一種利用香蕉莖尖薄片提高香蕉植株枯萎病抗性的方法，其特征在于，所述的生根培養(yǎng)基配方采用MS基本鹽+0.3mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂+10%椰子水，PH至5.8。
【文檔編號(hào)】A01H1/06GK104335902SQ201410651909
【公開(kāi)日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月17日
【發(fā)明者】王沛政, 馮慧敏, 陳友, 武耀廷 申請(qǐng)人:瓊州學(xué)院, 王沛政