植物抗旱、耐鹽相關蛋白EeZFP2及其編碼基因和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地，本發(fā)明涉及一種植物抗旱、耐鹽相關蛋白EeZFP2及其編碼基因和應用。所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明的抗旱、耐鹽相關蛋白及其編碼基因?qū)Ω牧?、增強煙草抗逆性，提高產(chǎn)量、加速抗逆分子育種進程，以及有效節(jié)省水資源具有十分重要的理論和實際意義。
【專利說明】植物抗旱、耐鹽相關蛋白EeZFP2及其編碼基因和應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地，本發(fā)明涉及植物抗旱、耐鹽相關蛋白EeZFP2 及其編碼基因和應用。

【背景技術】
[0002] 小麥作為我國重要的糧食作物之一，在國民經(jīng)濟中占有非常重要的地位。然而，在 我國干旱地區(qū)的耕地面積約為5. 7億畝，鹽堿地約為5. 54億畝，每年因干旱、鹽堿等逆境我 國對小麥造成的減產(chǎn)達700-800億公斤，嚴重影響著小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)，制約著我國小麥 糧食生產(chǎn)的快速發(fā)展。
[0003] 隨著現(xiàn)代分子生物學的發(fā)展，利用基因工程技術從分子水平上深入研宄植物與非 生物逆境之間的關系，揭示植物對逆境脅迫信號傳導及基因表達調(diào)控分子機理，為培育作 物抗逆新種質(zhì)提供了理論基礎。轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor, TF)，又稱反式作用因 子，是指能夠與基因啟動子區(qū)域中順式作用元件（cis-acting element)發(fā)生特異性相互 作用的結(jié)合蛋白，該蛋白通過它們之間以及與其他相關蛋白之間的相互作用激活或抑制 特定基因的轉(zhuǎn)錄，在抗逆基因表達調(diào)控中起著重要作用。近年來，通過轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)與 功能分析來鑒定、闡明各種條件下基因表達調(diào)控的機理得到了廣泛關注（劉強等，2000)。 Yamaguchi-Shinozaki等人的研宄表明：利用rd29A啟動子啟動AtDREBlA基因的表達， 能夠有效提高小麥對干旱、高鹽和低溫的抗性（Yamaguchi-Shinozaki et al.，2002)。 GmDREB3基因的超量表達能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草植株對干旱和低溫脅迫的耐性（Chen et al.，2007)。將棉花GhDREB基因轉(zhuǎn)化小麥品種揚麥10號，轉(zhuǎn)基因小麥的耐旱、耐鹽性得 到明顯提尚(Gao et al. , 2009) 〇
[0004] 研宄表明：鋅指蛋白作為一類轉(zhuǎn)錄因子而廣泛地參與基因表達的調(diào)控。鋅指蛋白 最初于1983年在非洲爪蟾卵母細胞的轉(zhuǎn)錄因子TF III A中被發(fā)現(xiàn)（Miller et al.，1985)， 是迄今在真核生物基因組中分布最廣的一類蛋白。它的得名是由于其結(jié)構(gòu)特征，幾個保守 的氨基酸（一般為Cys和His)與一個或多個鋅離子結(jié)合，形成一個在蛋白質(zhì)中相對獨立 的區(qū)域。鋅指基序無論在結(jié)構(gòu)還是功能上都是多樣的，它不僅可以結(jié)合DNA和RNA，還能與 DNA-RNA雜交雙鏈分子以及其他鋅指蛋白或自身結(jié)合，也可以通過和膜的結(jié)合來起作用。根 據(jù)鋅指的保守基序的特點，可以將鋅指蛋白分成9類：C2H2型、C8型、C6型、RING型、C2HC 型、LIM 型（C2HC5)、C4 型、C3H 型和 C4HC3 型（Berg et al.，1996)。
[0005] RING型鋅指大約在19年前被界定為一種新的鋅指結(jié)構(gòu)域，分離得到的第一 個RING型鋅指蛋白基因為人類Really Interesting New Genes I(RINGl)，它參與多 種信號轉(zhuǎn)導途徑和調(diào)控途徑（Zeba et al.，2009)。RING型鋅指蛋白又分為兩個亞類： RING-HC (C3HC4)和 RING-H2(C3H2C3) (Kam et al.，2007)。RING-HC 本身含有 40-60 個 氨基酸殘基，它的保守序列為 Cys-X2-Cys-X (9 - 39) -Cys-X (I - 3) -His-X (2 - 3) -Cys/ His-X-Cys-X-Cys-X-Cys，其中 X 代表任意氨基酸（Borden et al·，1996)。RING-H2 基序 與RING-HC的不同在于第四個半胱氨酸殘基變?yōu)榻M氨酸殘基（Freemont et al·，2000) 〇 目前，在動物、植物和微生物等各種生物體中已經(jīng)分離得到了許多RING型鋅指蛋白。一些 RING型鋅指蛋白被認為參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的某些過程和蛋白與蛋白的相互作用，之后的研宄顯 示，許多RING型鋅指具有泛素連接酶E3活性，可以和泛素結(jié)合酶E2特異性反應，從而促進 泛素化。為了保護自身的結(jié)構(gòu)不被破壞，細胞內(nèi)的蛋白降解必須具有高度的選擇性，所以現(xiàn) 在普遍認為，RING型鋅指的泛素連接酶E3活性介導的泛素化對于細胞具有至關重要的作 用。
[0006] 不同來源的同一類型鋅指蛋白的功能也具有多樣性，例如C3HC4型鋅指蛋白在病 毒、酵母、動植物具有各種不同功能，如腫瘤形成、信號轉(zhuǎn)導、過氧化物酶的產(chǎn)生、發(fā)育、轉(zhuǎn)錄 調(diào)節(jié)等（Borden et al.，2000)。此外，不同類型的鋅指蛋白的功能具有多樣性，例如C2H2 型、RING型鋅指蛋白可能在逆境脅迫中發(fā)揮重要作用，而C2HC型、C4HC3型鋅指蛋白可能在 發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。
[0007] 本發(fā)明利用RT-PCR的方法，從長穗偃麥草cDNA中克隆到了一個新的C2H2型鋅指 蛋白基因 EeZFP2,并對其進行了亞細胞定位、轉(zhuǎn)錄激活及表達特性分析。通過農(nóng)桿菌介導 法將該基因轉(zhuǎn)入了煙草中，對轉(zhuǎn)基因煙草在培養(yǎng)基上進行了耐旱和耐鹽鑒定。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn) 入EeZFP2基因的表達提高了煙草對干旱和鹽脅迫的耐受性，過量表達EeZFP2轉(zhuǎn)錄因子基 因一定程度上提高了煙草的抗逆能力，轉(zhuǎn)基因植株發(fā)育不產(chǎn)生任何負面作用，這對抗逆分 子育種改良和提高作物的抗逆性及抗旱、節(jié)水農(nóng)業(yè)生產(chǎn)會產(chǎn)生巨大推動作用和經(jīng)濟效益， 具有重要理論和實踐意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種植物抗旱、耐鹽相關蛋白EeZFP2。
[0009] 本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述植物抗旱、耐鹽相關蛋EeZFP2的編碼基因。
[0010] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。
[0011] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的轉(zhuǎn)基因細胞系。
[0012] 本發(fā)明的另一目的提供上述植物抗旱、耐鹽相關蛋白EeZFP2的應用。
[0013] 本發(fā)明所提供的抗旱、耐鹽相關蛋白EeZFP2,來源于長穗偃麥草，其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
[0014] 本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄因子由239個氨基酸殘基組成，是Zinc-finger類轉(zhuǎn)錄因子，長為 720bp的DNA序列，命名為EeZFP2。自SEQ ID NO. 1的氨基末端第85?107位之間和第 147?169位之間各含有一個C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域，每個鋅指基序中都含有一段保守的氨基 酸序列QALGGH，表明EeZFP2基因編碼一個典型的植物C 2H2型雙鋅指蛋白。
[0015] SEQ ID NO. 1 ：
[0016] I MAVEAVLEAA TMVPSPPSKE MEASSSTSEE ASALLGQAEG WSKRKRSRRQ RALDPSEEEY 61 LALCLLMLAH GHRDSSPAAA PEQQHGCSVC GKVFASYQAL GGHKASHRKP TAAPTGAEDQ 121 KPQAAVAAAS SSGSGEAAAG AGGGKVHECN VCRKTFPTGQ ALGGHKRCHY DGTIGSAASG 181 PTQKLAAKAA AASATAASRG FDLNLPALPD 工PERCTVTEE) GSEVLSPVSF KKPRLMIPA
[0017] 為了使蛋白EeZFP2便于純化，可在由SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列組成的蛋白 質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。
[0018] 表1標簽的序列
[0019]

【權利要求】
1. 一種植物抗旱、耐鹽相關蛋白EeZFP2,其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所 不〇
2. -種植物抗旱、耐鹽相關基因，其特征在于，編碼權利要求1所述的植物抗旱、耐鹽 相關蛋白EeZFP2。
3. 如權利要求2所述的植物抗旱、耐鹽相關基因，其特征在于，其堿基序列如SEQ ID NO. 2所示。
4. 包含權利要求2或3所述植物抗旱、耐鹽相關基因的重組表達載體。
5. 包含權利要求2或3所述植物抗旱、耐鹽相關基因的重組表達載體35S-EeZFP2。
6. 包含權利要求2或3所述植物抗旱、耐鹽相關基因的轉(zhuǎn)基因細胞系。
7. 權利要求1所述植物抗旱、耐鹽相關蛋白EeZFP2的應用。
8. 權利要求2或3所述植物抗旱、耐鹽相關基因的應用。
【文檔編號】A01H5/00GK104497113SQ201410718162
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月1日 優(yōu)先權日:2014年12月1日
【發(fā)明者】高世慶, 趙昌平, 唐益苗, 郭麗香 申請人:北京市農(nóng)林科學院