一種煙草疫霉接種煙草的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種煙草疫霉接種煙草的方法，包括以下步驟：（1）煙草子葉苗的準(zhǔn)備；（2）煙草疫霉游動(dòng)孢子懸浮液的制備；（3）灌根接種；（4）統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，評(píng)價(jià)抗病結(jié)果。本發(fā)明的游動(dòng)孢子接種子葉苗根部可以嚴(yán)格定量，避免了接種量過大而導(dǎo)致同一的品種抗感的表現(xiàn)差異，在抗性鑒定時(shí)更準(zhǔn)確、有效；在實(shí)際操作中，可大批量進(jìn)行，具有占用空間小、節(jié)約勞動(dòng)成本、縮短實(shí)驗(yàn)周期的優(yōu)點(diǎn)。因此，本發(fā)明方法適合推廣應(yīng)用。
【專利說明】-種煙草疫霉接種煙草的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物抗病鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種煙草疫霉接種煙草的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 煙草黑腔病是由煙草疫霉(化乃(9如曲?ra nico化wae)引起的一種±傳病害，是 影響煙草產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病害之一。防治該病害最安全有效的措施是利用抗病品種?？?病品種需要通過抗性鑒定驗(yàn)證。在品種抗性鑒定中，大田鑒定經(jīng)常涉及的品種較少，適宜于 規(guī)模抗性鑒定的主要W苗期鑒定為主，應(yīng)用較多的是GB/T 23224描述的菌谷法接種、菌絲 塊創(chuàng)傷法接種（中國發(fā)明專利化200610048658 ;黃成江等，抗黑腔病烤煙品種資源篩選的 研究初報(bào)，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008, 23(4) : 565-570)。菌谷、菌絲塊創(chuàng)傷法接種需要將待測(cè) 定的煙草品種播種培育至成苗、再移栽，時(shí)間長達(dá)7(T80天，每品種至少10株，在盆栽條件 下占用空間較大。因此，開發(fā)一種能縮短時(shí)間、節(jié)省空間的接種方法是非常必要的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種煙草疫霉接種煙草的方法。
[0004] 本發(fā)明的目的是該樣實(shí)現(xiàn)的，包括煙草子葉苗的準(zhǔn)備、煙草疫霉游動(dòng)抱子息浮液 的制備、灌根接種、統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)步驟，具體包括： A、 煙草子葉苗的準(zhǔn)備；將煙草種子表面消毒后播種于發(fā)芽床上，于相對(duì)濕度8(T85%、 光照強(qiáng)度1000?20(K)Lx、溫度25?28°C下培養(yǎng)廣10天后發(fā)芽形成子葉苗備用； B、 煙草疫霉游動(dòng)抱子息浮液的制備；將煙草疫霉接種至0A培養(yǎng)基平板，于25^28C下 黑暗培養(yǎng)廣10天至菌絲長滿整個(gè)平板，取菌絲切成小塊得到菌絲塊，液體培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生游 動(dòng)抱子囊、低溫促進(jìn)游動(dòng)抱子囊釋放游動(dòng)抱子用無菌水調(diào)節(jié)游動(dòng)抱子濃度為1〇 4^6個(gè)/ml得 到煙草疫霉游動(dòng)抱子息浮液； C、 灌根接種；取B步驟獲得的煙草疫霉游動(dòng)抱子息浮液緩慢滴加至發(fā)芽床，讓其滲透 到每株子葉苗的根部； D、 統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，評(píng)價(jià)抗病結(jié)果；接種后的子葉苗在相對(duì)濕度8(T85%、光照強(qiáng)度 1000?20(K)Lx、溫度25?28°C下繼續(xù)培養(yǎng)3?5天，調(diào)查子葉苗的發(fā)病率，按發(fā)病率劃分抗感 性，免疫或高抗發(fā)病率為0,抗病發(fā)病率為0.廣25%，中抗發(fā)病率為25.廣45%，中感發(fā)病率為 45.廣65%，感病發(fā)病率為65.廣80%，高感發(fā)病率為80. 1?100%，其中免疫或高抗、抗病、中抗 的材料即可作為抗源。
[0005] 疫霉疫霉本發(fā)明的游動(dòng)抱子接種子葉苗根部可W嚴(yán)格定量，避免了接種量過大而 導(dǎo)致同一的品種抗感的表現(xiàn)差異，游動(dòng)抱子既可從根部侵入也可從下胚軸侵入，與田間自 然侵入方式相同，在篩選抗源時(shí)更準(zhǔn)確、有效；在實(shí)際操作中，可大批量進(jìn)行，在人工氣候箱 /室進(jìn)行，具有占用空間小、節(jié)約勞動(dòng)成本、縮短實(shí)驗(yàn)周期等優(yōu)點(diǎn)。
[0006]

【專利附圖】

【附圖說明】： 圖1為本發(fā)明方法流程示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0007] 下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不W任何方式對(duì)本發(fā)明加W 限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0008] 本發(fā)明所述的煙草疫霉接種煙草的方法，包括煙草子葉苗的準(zhǔn)備、煙草疫霉游動(dòng) 抱子息浮液的制備、灌根接種、統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)步驟，具體包括： A、 煙草子葉苗的準(zhǔn)備；將煙草種子表面消毒后播種于發(fā)芽床上，于相對(duì)濕度8(T85%、 光照強(qiáng)度1000?20(K)Lx、溫度25?28°C下培養(yǎng)廣10天后發(fā)芽形成子葉苗備用； B、 煙草疫霉游動(dòng)抱子息浮液的制備；將煙草疫霉接種至0A培養(yǎng)基平板，于25^28C下 黑暗培養(yǎng)廣10天至菌絲長滿整個(gè)平板，取菌絲切成小塊得到菌絲塊，液體培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生游 動(dòng)抱子囊、低溫促進(jìn)游動(dòng)抱子囊釋放游動(dòng)抱子用無菌水調(diào)節(jié)游動(dòng)抱子濃度為1〇 4^6個(gè)/ml得 到煙草疫霉游動(dòng)抱子息浮液； C、 灌根接種；取B步驟獲得的煙草疫霉游動(dòng)抱子息浮液緩慢滴加至發(fā)芽床，讓其滲透 到每株子葉苗的根部； D、 統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，評(píng)價(jià)抗病結(jié)果；接種后的子葉苗在相對(duì)濕度8(T85%、光照強(qiáng)度 1000?20(K)Lx、溫度25?28°C下繼續(xù)培養(yǎng)3?5天，調(diào)查子葉苗的發(fā)病率，按發(fā)病率劃分抗感 性，免疫或高抗發(fā)病率為0,抗病發(fā)病率為0.廣25%，中抗發(fā)病率為25.廣45%，中感發(fā)病率為 45.廣65%，感病發(fā)病率為65.廣80%，高感發(fā)病率為80. 1?100%，其中免疫或高抗、抗病、中抗 的材料即可作為抗源。
[0009] A步驟中所述的表面消毒是5(T55°C溫湯浸種擴(kuò)10分鐘，或1%硫酸銅或0. 1%硝 酸銀溶液浸種1(T15分鐘。
[0010] 所述的發(fā)芽床是由海綿和濾紙做成。
[0011] B步驟中所述的0A培養(yǎng)基配方為：燕麥片30克、自來水1000毫升。
[0012] B步驟中所述的10%V8汁液體培養(yǎng)基配方為；用自來水稀釋V8汁至10%(w/w)、再 加0. 1%的碳酸巧（w/w)。
[0013] B步驟中所述的菌絲塊的大小為2mmX 2mm。
[0014] B步驟中所述的液體培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生游動(dòng)抱子囊是將菌絲塊加入到10%V8汁液體培 養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，每皿加菌絲塊2(T40片，繼續(xù)于25^28°C下黑暗培養(yǎng)：T4天，傾去培養(yǎng)液， 用滅菌水沖洗：T5次，每天換加滅菌水廣3次，連續(xù)2^3天誘導(dǎo)游動(dòng)抱子囊的產(chǎn)生，直至每 平方厘米菌絲塊游動(dòng)抱子囊在10000個(gè)W上時(shí)停止誘導(dǎo)。
[0015] B步驟中所述的低溫促進(jìn)游動(dòng)抱子囊釋放游動(dòng)抱子是將產(chǎn)生游動(dòng)抱子的菌絲塊 5?8C低溫處理20?30min，取出置于室溫15?30min誘導(dǎo)游動(dòng)抱子囊釋放游動(dòng)抱子。
[0016] C步驟中所述的煙草疫霉游動(dòng)抱子息浮液滴加量為1(T15毫升。
[0017] 疫霉疫霉實(shí)施例1 ;游動(dòng)抱子接種子葉苗的實(shí)驗(yàn)步驟及接種量 本實(shí)施例用煙草疫霉0號(hào)生理小種（中華人民共和國煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T39-1996)為實(shí) 驗(yàn)菌株，用抗病品種RBST和感病品種紅花大金元作為實(shí)驗(yàn)煙草品種。
[0018] 具體操作如下： (1)煙草子葉苗的準(zhǔn)備；抗病品種RBST和感病品種紅花大金元煙草種子表面消毒 后，10X 10方陣點(diǎn)播于海綿和濾紙做成的培養(yǎng)皿發(fā)芽床上，在相對(duì)濕度8(T85%、光照強(qiáng)度 1000?20(K)Lx、溫度25?28°C的人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)廣10天后發(fā)芽形成子葉苗，備用； (2) 煙草疫霉游動(dòng)抱子息浮液的制備；將煙草疫霉接種在OA培養(yǎng)基平板，25^28C恒溫 黑暗培養(yǎng)廣10天，袋菌絲長滿整個(gè)平板后，將菌絲切成2mmX 2mm的小塊，加入到10%V8汁 培養(yǎng)皿淺盤的液體培養(yǎng)基中，每皿加菌絲塊2(T40片，繼續(xù)培養(yǎng)：T4天，傾去培養(yǎng)液，滅菌水 沖洗：T5次后，每天換加滅菌水廣3次，連續(xù)2^3天誘導(dǎo)游動(dòng)抱子囊的產(chǎn)生，當(dāng)每平方厘米 菌絲塊游動(dòng)抱子囊在10000個(gè)W上時(shí)，5^8°C低溫處理2(T30分鐘，取出置于室溫15^30分 鐘誘導(dǎo)游動(dòng)抱子囊釋放游動(dòng)抱子，用無菌水調(diào)節(jié)游動(dòng)抱子濃度為1〇 4個(gè)/mL、1〇5個(gè)/mL、1〇6 個(gè)/111以共3個(gè)濃度梯度煙草疫霉游動(dòng)抱子息浮液； (3) 灌根接種：將1(T15 mL步驟（2)獲得的游動(dòng)抱子液用移液槍從發(fā)芽床濾紙的四周 緩慢滴加，盡可能讓游動(dòng)抱子息浮液滲到每株子葉苗的根部，每濃度接種1皿為1個(gè)處理， 重復(fù)3次； (4) 接種效果判定：接種后的子葉苗在步驟（1)的條件下繼續(xù)培養(yǎng)：T5天，調(diào)查子葉苗 的發(fā)病率。
[0019] 為驗(yàn)證重復(fù)性，共進(jìn)行了 4個(gè)批次的實(shí)驗(yàn)。
[0020] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，感病品種紅花大金元3天后水浸狀發(fā)病癥狀明顯，3個(gè)濃度梯度發(fā) 病率在85. 1?93. 6%之間，而抗病品種RBST在5天后3個(gè)濃度梯度發(fā)病率在1. 5?4. 8%之間， 4批次在2抗感品種上發(fā)病率穩(wěn)定在各自的范圍內(nèi)，說明方法重復(fù)性符合實(shí)驗(yàn)要求。3個(gè)濃 度可W作為合適的接種量使用，1〇5個(gè)/mL是最適宜的接種量。
[0021] 實(shí)施例2 ;游動(dòng)抱子接種子葉苗篩選抗源 本實(shí)施例用15個(gè)材料，采用0號(hào)生理小種，具體步驟如下： (1) 煙草子葉苗的準(zhǔn)備；煙草種子表面消毒后，10X10方陣點(diǎn)播于海綿和濾紙做成的 培養(yǎng)皿發(fā)芽床上，在相對(duì)濕度8(T85%、光照強(qiáng)度2000LX、溫度28C的人工氣候箱/室內(nèi)培養(yǎng) 10天后發(fā)芽形成子葉苗，備用； (2) 煙草疫霉游動(dòng)抱子息浮液的制備；將煙草疫霉接種在0A培養(yǎng)基平板，28C恒溫黑 暗培養(yǎng)10天，待菌絲長滿整個(gè)平板后，將菌絲切成2mmX2mm的小塊，加入到10%V8汁培養(yǎng) 皿淺盤的液體培養(yǎng)基中，每皿加菌絲塊40片，繼續(xù)培養(yǎng)3天，傾去培養(yǎng)液，滅菌水沖洗：T5 次后，每天換加滅菌水廣3次，連續(xù)2^3天誘導(dǎo)游動(dòng)抱子囊的產(chǎn)生，當(dāng)每平方厘米菌絲塊游 動(dòng)抱子囊在10000個(gè)W上時(shí)，5^8°C低溫處理2(T30分鐘，取出置于室溫15^30分鐘誘導(dǎo)游 動(dòng)抱子囊釋放游動(dòng)抱子，用無菌水調(diào)節(jié)游動(dòng)抱子濃度為1〇5個(gè)/mU即得煙草疫霉游動(dòng)抱子 息浮液； (3) 灌根接種：將1(T15 mL步驟（2)獲得的游動(dòng)抱子液用移液槍從發(fā)芽床濾紙的四周 緩慢滴加，盡可能讓游動(dòng)抱子息浮液滲到每株子葉苗的根部，每品種接種1皿為1個(gè)處理， 重復(fù)3次； (4) 抗性鑒定結(jié)果的判定：接種后的子葉苗在步驟（1)的條件下繼續(xù)培養(yǎng)3-5天， 調(diào)查子葉苗的發(fā)病率，取第3、4、5天調(diào)查的平均值為該品種發(fā)病率，每重復(fù)分別統(tǒng)計(jì)， 按發(fā)病率劃分抗感性，免疫或高抗的發(fā)病率為0,抗病的發(fā)病率為0.廣25%，中抗的發(fā)病 率為25. 1?45%，中感的發(fā)病率為45.廣65%，感病的發(fā)病率為65.廣80%，高感的發(fā)病率為 80.廣100%，其中免疫或高抗、抗病、中抗的材料即可作為抗源。
[0022] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，15個(gè)材料中免疫的有2個(gè)，抗病的有4個(gè)，中抗的 有1個(gè)，中感的有4個(gè)，感病的有1個(gè)，高感的有3個(gè)。該些結(jié)果與菌谷和菌絲塊接種抗性 鑒定結(jié)果完全吻合。
[0023] 表1游動(dòng)抱子接種子葉苗篩選抗源結(jié)果

【權(quán)利要求】
1. 一種煙草疫霉接種煙草的方法，其特征在于包括煙草子葉苗的準(zhǔn)備、疫霉游動(dòng)孢子 懸浮液的制備、灌根接種、統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)步驟，具體包括： A、 煙草子葉苗的準(zhǔn)備：將煙草種子表面消毒后播種于發(fā)芽床上，于相對(duì)濕度8(T85%、 光照強(qiáng)度100(T2000LX、溫度25?28°C下培養(yǎng)疒10天后發(fā)芽形成子葉苗備用； B、 煙草疫霉游動(dòng)孢子懸浮液的制備：將煙草疫霉接種至0A培養(yǎng)基平板，于25~28°C下 黑暗培養(yǎng)疒10天至菌絲長滿整個(gè)平板，取菌絲切成小塊得到菌絲塊，液體培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生游 動(dòng)孢子囊、低溫促進(jìn)游動(dòng)孢子囊釋放游動(dòng)孢子用無菌水調(diào)節(jié)游動(dòng)孢子濃度為1〇4~6個(gè)/ml， 得到煙草疫霉游動(dòng)孢子懸浮液； C、 灌根接種；取B步驟獲得的煙草疫霉游動(dòng)孢子懸浮液緩慢滴加至發(fā)芽床，讓其滲透 到每株子葉苗的根部； D、 統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，評(píng)價(jià)抗病結(jié)果：接種后的子葉苗在相對(duì)濕度8(T85%、光照強(qiáng)度 100(T2000LX、溫度25~28°C下繼續(xù)培養(yǎng):T5天，調(diào)查子葉苗的發(fā)病率，按發(fā)病率劃分抗感 性，免疫或高抗發(fā)病率為〇,抗病發(fā)病率為〇. 1~25%，中抗發(fā)病率為25. 1~45%，中感發(fā)病率為 45. 1飛5%，感病發(fā)病率為65. 1~80%，高感發(fā)病率為80. 1~100%，其中免疫或高抗、抗病、中抗 的材料即可作為抗源。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草疫霉接種煙草的方法，其特征在于A步驟中所述的表面 消毒是5(T55°C溫湯浸種8~10分鐘，或1%硫酸銅或0. 1%硝酸銀溶液浸種1(T15分鐘。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草疫霉接種煙草的方法，其特征在于所述的發(fā)芽床是由海 綿和濾紙做成。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草疫霉接種煙草的方法，其特征在于B步驟中所述的OA培 養(yǎng)基配方為：燕麥片30克、自來水1000毫升。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草疫霉接種煙草的方法，其特征在于B步驟中所述的 10%V8汁液體培養(yǎng)基配方為：用自來水稀釋V8汁至10%、再加0. 1%的碳酸鈣。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草疫霉接種煙草的方法，其特征在于B步驟中所述的菌絲 塊的大小為2mmX2mm。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草疫霉接種煙草的方法，其特征在于B步驟中所述的液體 培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生游動(dòng)孢子囊是將菌絲塊加入到10%V8汁液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，每皿加菌絲 塊2(T40片，繼續(xù)于25?28°C下黑暗培養(yǎng):T4天，傾去培養(yǎng)液，用滅菌水沖洗:T5次，每天換 加滅菌水1~3次，連續(xù)2~3天誘導(dǎo)游動(dòng)孢子囊的產(chǎn)生，直至每平方厘米菌絲塊游動(dòng)孢子囊在 10000個(gè)以上時(shí)停止誘導(dǎo)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草疫霉接種煙草的方法，其特征在于B步驟中所述的低溫 促進(jìn)游動(dòng)孢子囊釋放游動(dòng)孢子是將產(chǎn)生游動(dòng)孢子的菌絲塊5~8°C低溫處理2(T30min，取出 置于室溫15~30min誘導(dǎo)游動(dòng)孢子囊釋放游動(dòng)孢子。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草疫霉接種煙草的方法，其特征在于C步驟中所述的煙草 疫霉游動(dòng)孢子懸浮液滴加量為1(T15毫升。
【文檔編號(hào)】A01G7/06GK104396599SQ201410726158
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月4日
【發(fā)明者】方敦煌, 陳學(xué)軍, 肖炳光, 童治軍, 楊大海, 吳興富 申請(qǐng)人:云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院