基于微閥的雙檢測(cè)微流控芯片及糖尿病模型構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明主要涉及微流控芯片和糖尿病研究，基于微閥的雙檢測(cè)微流控芯片及糖尿病模型構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有技術(shù)中，微流控芯片(microfluidic chip)又稱(chēng)芯片實(shí)驗(yàn)室(lab on achip)，指的是把生物和化學(xué)等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等基本操作單元集成或基本集成到一塊幾平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成網(wǎng)絡(luò)，以可控流體貫穿整個(gè)系統(tǒng)，用以取代常規(guī)生物或化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的各種功能的一種技術(shù)。它的基本特征和最大優(yōu)勢(shì)是多種單元技術(shù)在微小平臺(tái)上的靈活組合和規(guī)模集成。發(fā)展至今，微流控芯片技術(shù)已經(jīng)開(kāi)始在生命科學(xué)的不同領(lǐng)域得到應(yīng)用，并已成為系統(tǒng)生物學(xué)研究中的重要技術(shù)平臺(tái)之一。同時(shí)，秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)以其生命周期和壽命短、全身透明、全基因組測(cè)序等特征，成為生物學(xué)研究領(lǐng)域中常用的一種重要模式生物。最近，微流控芯片因其與秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)尺寸匹配、環(huán)境可控、通量高、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、集成化等特征而成為線(xiàn)蟲(chóng)相關(guān)研究的重要平臺(tái)。
[0003]糖尿病作為一種危及人類(lèi)健康的疾病，越來(lái)越受到廣泛關(guān)注，而秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)作為一種模式生物，并且由于胰島素信號(hào)通路基因的保守性，成為了糖尿病研究的熱點(diǎn)，但是現(xiàn)有的技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)對(duì)單線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行相關(guān)的糖尿病研究。人們期待一種單個(gè)線(xiàn)蟲(chóng)長(zhǎng)期培養(yǎng)及觀(guān)察的簡(jiǎn)易平臺(tái)用于研究糖尿病等疾病并對(duì)相關(guān)的藥物進(jìn)行高通量的篩選。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡(jiǎn)單、通量高的微流控芯片平臺(tái)并用于構(gòu)建秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的糖尿病模型，具體說(shuō)是一種基于微閥的運(yùn)動(dòng)成雙像檢測(cè)的用于構(gòu)建秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的糖尿病模型的PDMS(聚二甲基硅氧烷)微流控芯片平臺(tái)。
[0005]本發(fā)明基于微閥的雙檢測(cè)微流控芯片，所述芯片由三層組成，上層為用于線(xiàn)蟲(chóng)培養(yǎng)及固定的液路層，中間層為可形變PDMS膜，下層為氣路控制層；
[0006]所述液路層由20?50個(gè)線(xiàn)蟲(chóng)分析功能單元組成，所有功能單元共用一個(gè)中心廢液池；每個(gè)分析功能單元由蟲(chóng)及藥品入口、進(jìn)樣通道、線(xiàn)蟲(chóng)固定及培養(yǎng)室、廢液通道組成；蟲(chóng)及藥品入口通過(guò)進(jìn)樣通道與線(xiàn)蟲(chóng)固定及培養(yǎng)室連接，然后通過(guò)廢液通道連接到與其它分析功能單元共用的中心廢液池；
[0007]氣路控制層的氣路通道中設(shè)有閥，控制氣路通道，氣路通道在線(xiàn)蟲(chóng)固定及培養(yǎng)室下方，由氣體正壓驅(qū)動(dòng)，用于進(jìn)行線(xiàn)蟲(chóng)固定；
[0008]所述液路層為基于SU8模板所得的PDMS模塊，氣路層是在制作成功的氣路SU8模板上甩一層高于模板20 μπι的PDMS膜，所述液路層的PDMS模板有結(jié)構(gòu)一側(cè)封接到氣路層PDMS膜無(wú)結(jié)構(gòu)一側(cè)，然后將其有氣路閥結(jié)構(gòu)一側(cè)等離子鍵合到潔凈的玻璃或平整的PDMS塊上；
[0009]該芯片可作為施加高濃度葡萄糖條件誘使線(xiàn)蟲(chóng)產(chǎn)生糖尿病相關(guān)特性，并對(duì)該條件下的線(xiàn)蟲(chóng)生命狀態(tài)進(jìn)行研究。
[0010]所述線(xiàn)蟲(chóng)固定及培養(yǎng)室的尺寸為2mmX ImmX 80 μ mD
[0011]所述進(jìn)樣通道為楔形通道，最寬處的寬度為250 μ m，最窄處的寬度為35 μ m，長(zhǎng)度為 1.2mmο
[0012]所述廢液通道與培養(yǎng)室連接處由一系列小通道組成，第一排的通道寬度為25 μπι，共有三個(gè)；第二排的通道寬度為30 μm，共有兩個(gè)；兩排分別交錯(cuò)居中分布。
[0013]所述閥由氣體正壓驅(qū)動(dòng)。
[0014]所述閥寬度為2.1mm0
[0015]所述芯片的材料均為PDMS聚合物，采用PDMS軟刻蝕及PDMS模塊之間的可逆封接和PDMS與玻璃基底之間的不可逆封接技術(shù)構(gòu)建。
[0016]一種基于微閥的雙檢測(cè)微流控芯片的糖尿病模型構(gòu)建方法，采用上述基于微閥的雙檢測(cè)微流控芯片，按照以下步驟進(jìn)行:
[0017]將單個(gè)線(xiàn)蟲(chóng)加入蟲(chóng)及藥品入口處，利用負(fù)壓驅(qū)動(dòng)的方式，將單個(gè)蟲(chóng)引入線(xiàn)蟲(chóng)固定及培養(yǎng)室，培養(yǎng)室的尺寸可使其自由游動(dòng)；
[0018]熒光成像時(shí)利用氣壓使PDMS膜形變，將蟲(chóng)體壓在進(jìn)樣通道側(cè)壁上使其固定并成像；
[0019]每天進(jìn)行三次物質(zhì)交換，為添加新鮮食物并施加葡萄糖或者藥物刺激，排出線(xiàn)蟲(chóng)代謝廢物，方式為負(fù)壓抽取。
[0020]通過(guò)對(duì)培養(yǎng)室中的線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行高濃度葡萄糖刺激，使線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)糖濃度達(dá)到與人類(lèi)糖尿病患者相似的糖濃度，并研究在該條件下線(xiàn)蟲(chóng)的壽命和氧化應(yīng)激變化。
[0021]通過(guò)對(duì)培養(yǎng)室中的線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行加藥刺激，可以對(duì)治療糖尿病的藥物進(jìn)行高通量篩選。
[0022]本發(fā)明基于微閥的秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)長(zhǎng)期培養(yǎng)及雙檢測(cè)微流控芯片，其閥的操控方法如下:成像時(shí)利用正壓將閥控制下的PDMS膜壓下，使蟲(chóng)體被壓在通道側(cè)壁上，實(shí)現(xiàn)蟲(chóng)的固定并進(jìn)行熒光成像，成像后釋放線(xiàn)蟲(chóng)，使其恢復(fù)自由運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。
[0023]本發(fā)明采用通道設(shè)計(jì)，操作簡(jiǎn)單，且易于實(shí)現(xiàn)物質(zhì)交換，有利于線(xiàn)蟲(chóng)的長(zhǎng)期培養(yǎng)；線(xiàn)蟲(chóng)固定方法采用膜形變的方式，對(duì)蟲(chóng)體安全無(wú)害，可對(duì)單個(gè)線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)及運(yùn)動(dòng)、成像雙檢測(cè)。
[0024]本發(fā)明有以下優(yōu)點(diǎn):
[0025](I)采用通道灌流的方式進(jìn)行食物添加及廢液排出，操作簡(jiǎn)單，效率高，有利于線(xiàn)蟲(chóng)的長(zhǎng)期培養(yǎng)。
[0026](2)培養(yǎng)室同樣作為線(xiàn)蟲(chóng)固定成像通道，且蟲(chóng)的固定方式對(duì)蟲(chóng)體無(wú)損傷，方法簡(jiǎn)單，通量高。
[0027](3)單個(gè)培養(yǎng)室中培養(yǎng)單個(gè)線(xiàn)蟲(chóng)的設(shè)計(jì)使得每只蟲(chóng)的壽命、運(yùn)動(dòng)行為及熒光特征得到實(shí)時(shí)及長(zhǎng)期追蹤，可滿(mǎn)足生物研究的需要。
[0028](4)單閥控制，簡(jiǎn)化芯片結(jié)構(gòu)，并使操作更簡(jiǎn)單。
【附圖說(shuō)明】
:
[0029]圖1芯片結(jié)構(gòu)示意圖；(a)為液路層結(jié)構(gòu)，(b)為氣路層結(jié)構(gòu)，
[0030]圖2每個(gè)分析功能單元放大圖，
[0031]其中:1為蟲(chóng)及藥品入口，2為進(jìn)樣通道，3為線(xiàn)蟲(chóng)固定及培養(yǎng)室，4為線(xiàn)蟲(chóng)分選處，5為廢液通道，6為廢液池，7為氣路控制閥，8為氣路通道，9為防塌陷小柱；
[0032]圖3不同糖濃度對(duì)野生型線(xiàn)蟲(chóng)N2壽命的影響圖；(a)圖為糖對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)存活率的影響，(b)圖為糖對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)平均壽命的影響；
[0033]圖4不同糖濃度對(duì)突變型蟲(chóng)株CL2166氧化應(yīng)激表達(dá)的影響圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034]實(shí)施例1
[0035]實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)并制作的微流控芯片:制備基于微閥的雙檢測(cè)微流控芯片的材料為PDMS聚合物，液路和氣路之間的封接采用可逆封接，而氣路與玻璃片之間的封接采用等離子體不可逆封接。
[0036]該芯片由三層組成，上層為液路層，中間層PDMS膜，下層氣路控制層。
[0037]其中液路層由30個(gè)線(xiàn)蟲(chóng)分析功能單元組成，所有功能單元共用一個(gè)中心廢液池6 ;每個(gè)分析功能單元由蟲(chóng)及藥品入口 1、進(jìn)樣通道2、線(xiàn)蟲(chóng)固定及培養(yǎng)室3(尺寸為2mmX ImmX80 μπι)、廢液通道4組成(圖2);蟲(chóng)及藥品入口 I通過(guò)進(jìn)樣通道2與線(xiàn)蟲(chóng)固定及培養(yǎng)室3連接，然后通過(guò)廢液通道4通向與其它分析功能單元共用的中心廢液池6 ;
[0038]氣路控制層的氣路通道8中設(shè)有閥7 (寬度為2_)，控制氣路通道8，氣路通道8在線(xiàn)蟲(chóng)固定及培養(yǎng)室3下方，由氣體正壓驅(qū)動(dòng)，用于進(jìn)行線(xiàn)蟲(chóng)固定。
[0039]所述液路層為基于SU8模板所得的PDMS模塊，氣路層是在制作成功的氣路SU8模板上甩一層高于模板20 μπι的PDMS膜，所述液路層的PDMS模板有結(jié)構(gòu)一側(cè)封接到氣路層PDMS膜無(wú)結(jié)構(gòu)一側(cè)，然后將其有氣路閥結(jié)構(gòu)一側(cè)等離子鍵合到潔凈的玻璃或平整的PDMS塊上；
[0040]該芯片可作為施加高濃度葡萄糖條件誘使線(xiàn)蟲(chóng)產(chǎn)生糖尿病相關(guān)特性，并對(duì)該條件下的線(xiàn)蟲(chóng)生命狀態(tài)進(jìn)行研究。
[0041]所述線(xiàn)蟲(chóng)固定及培養(yǎng)室3的尺寸為2mmX ImmX 80 μ m0
[0042]所述進(jìn)樣通道2為楔形通道，最寬處的寬度為250 μ m，最窄處的寬度為35 μπι，長(zhǎng)度為1.2mm。
[0043]所述廢液通道5與培養(yǎng)室3連接處由一系列小通道組成，第一排的通道寬度為25 μm，共有三個(gè)；第二排的通道寬度為30 μm，共有兩個(gè)；兩排分別交錯(cuò)居中分布。
[0044]所述閥7由氣體正壓驅(qū)動(dòng)。
[0045]所述閥7寬度為2.1mm。
[0046]所述芯片的材料均為PDMS聚合物，采用PDMS軟刻蝕及PDMS模塊之間的可逆封接和PDMS與玻璃基底之間的不可逆封接技術(shù)構(gòu)建。
[0047]使用前事先灌好線(xiàn)蟲(chóng)培養(yǎng)液K Medium。秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)野生型蟲(chóng)株N2及突變型蟲(chóng)株CL2166瓊脂板上培養(yǎng)至大蟲(chóng)后，進(jìn)行bleach操作將大量卵取出，并使其孵化，長(zhǎng)至L4期。將L4期線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)樣到入口，芯片共30個(gè)單元，利用負(fù)壓將蟲(chóng)子進(jìn)樣到培養(yǎng)室中。各個(gè)單元相互獨(dú)立，進(jìn)樣互不干擾，可達(dá)到單個(gè)培養(yǎng)室都只有單條蟲(chóng)。
[0048]利用實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)并制作的微流控芯片系統(tǒng)，將線(xiàn)蟲(chóng)野生型N2擬合至幼蟲(chóng)L4期后引入芯片中進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)，施加不同濃度的葡萄糖，對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的壽命進(jìn)行記錄，如圖3所示，在高糖條件的培養(yǎng)下線(xiàn)蟲(chóng)的壽命縮短5天左右。
[0049]利用實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)并制作的微流控芯片系統(tǒng)，研究不同糖濃度對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)氧化應(yīng)激的表達(dá)強(qiáng)度影響:
[0050]采用帶有氧化應(yīng)激綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)的線(xiàn)蟲(chóng)突變型蟲(chóng)株CL2166進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，當(dāng)外界因素致氧化應(yīng)激產(chǎn)生時(shí)，GFP表達(dá)增強(qiáng)。在本實(shí)驗(yàn)新型中，外界因素為不同濃度的葡萄糖溶液，觀(guān)察在不同糖濃度下線(xiàn)蟲(chóng)的氧化應(yīng)激表達(dá)情況，如圖4所示，在高糖條件下，線(xiàn)蟲(chóng)的GFP熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，說(shuō)明高糖會(huì)增強(qiáng)氧化應(yīng)激。
[0051]本發(fā)明采用了單閥控制，使線(xiàn)蟲(chóng)的操縱更加簡(jiǎn)單；對(duì)進(jìn)樣通道的寬度和長(zhǎng)度進(jìn)行了調(diào)整，使線(xiàn)蟲(chóng)在固定成像時(shí)不會(huì)從入口處進(jìn)入到培養(yǎng)室外；對(duì)閥的寬度進(jìn)行了調(diào)整，避免了由于PDMS形變引起的無(wú)法固定線(xiàn)蟲(chóng)的情況；對(duì)廢液通道與培養(yǎng)室的連接處進(jìn)行了改進(jìn)，足以使剛孵化的幼蟲(chóng)從廢液通道被抽離培養(yǎng)室，保證了培養(yǎng)室的單線(xiàn)蟲(chóng)培養(yǎng)，無(wú)需外界加藥；并針對(duì)該單線(xiàn)蟲(chóng)的培養(yǎng)平臺(tái)進(jìn)行了糖尿病模型的構(gòu)建；設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單并且具有實(shí)用價(jià)值。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種基于微閥的雙檢測(cè)微流控芯片，其特征在于:所述芯片由三層組成，上層為用于線(xiàn)蟲(chóng)培養(yǎng)及固定的液路層，中間層為可形變PDMS膜，下層為氣路控制層， 所述液路層由20?50個(gè)線(xiàn)蟲(chóng)分析功能單元組成，所有功能單元共用一個(gè)中心廢液池；每個(gè)分析功能單元由蟲(chóng)及藥品入口、進(jìn)樣通道、線(xiàn)蟲(chóng)固定及培養(yǎng)室、廢液通道組成；蟲(chóng)及藥品入口通過(guò)進(jìn)樣通道與線(xiàn)蟲(chóng)固定及培養(yǎng)室連接，然后通過(guò)廢液通道連接到與其它分析功能單元共用的中心廢液池； 所述氣路控制層的氣路通道中設(shè)有閥，控制氣路通道，氣路通道在線(xiàn)蟲(chóng)固定及培養(yǎng)室下方，由氣體正壓驅(qū)動(dòng)，用于進(jìn)行線(xiàn)蟲(chóng)固定； 所述液路層為基于SU8模板所得的PDMS模塊，氣路層是在制作成功的氣路SU8模板上甩一層高于模板20 μ m的PDMS膜，所述液路層的PDMS模板有結(jié)構(gòu)一側(cè)封接到氣路層PDMS膜無(wú)結(jié)構(gòu)一側(cè)，有氣路閥結(jié)構(gòu)一側(cè)等離子鍵合到潔凈的玻璃或平整的PDMS塊上； 該芯片可作為施加高濃度葡萄糖條件誘使線(xiàn)蟲(chóng)產(chǎn)生糖尿病相關(guān)特性，并對(duì)該條件下的線(xiàn)蟲(chóng)生命狀態(tài)進(jìn)行研究。2.按照權(quán)利要求1所述的基于微閥的雙檢測(cè)微流控芯片，其特征在于:所述線(xiàn)蟲(chóng)固定及培養(yǎng)室的尺寸為2mmX ImmX 80 μ m。3.按照權(quán)利要求1所述的基于微閥的雙檢測(cè)微流控芯片，其特征在于:進(jìn)樣通道為楔形通道，最寬處的寬度為250 μ m，最窄處的寬度為35 μ m，長(zhǎng)度為1.2mm。4.按照權(quán)利要求1所述的基于微閥的雙檢測(cè)微流控芯片，其特征在于:廢液通道與培養(yǎng)室連接處由一系列小通道組成，第一排的通道寬度為25 μ m，共有三個(gè)；第二排的通道寬度為30 μm，共有兩個(gè)；兩排分別交錯(cuò)居中分布。5.按照權(quán)利要求1所述的基于微閥的雙檢測(cè)微流控芯片，其特征在于:所述閥由氣體壓驅(qū)動(dòng)。6.按照權(quán)利要求1所述的基于微閥的雙檢測(cè)微流控芯片，其特征在于:所述閥寬度為2.1mm07.按照權(quán)利要求1所述的基于微閥的雙檢測(cè)微流控芯片，其特征在于:在氣路層增加了防塌陷小柱結(jié)構(gòu)，防止在封接時(shí)導(dǎo)致氣路層無(wú)法連通。8.按照權(quán)利要求1所述的基于微閥的雙檢測(cè)微流控芯片，其特征在于:所述芯片的材料均為PDMS聚合物，采用PDMS軟刻蝕及PDMS模塊之間的可逆封接和PDMS與玻璃基底之間的不可逆封接技術(shù)構(gòu)建。9.按照權(quán)利要求1所述的基于微閥的雙檢測(cè)微流控芯片的糖尿病模型構(gòu)建方法，采用上述基于微閥的雙檢測(cè)微流控芯片，其特征在于按照以下步驟進(jìn)行: 將單個(gè)線(xiàn)蟲(chóng)加入蟲(chóng)及藥品入口處，利用負(fù)壓驅(qū)動(dòng)的方式，將單個(gè)蟲(chóng)引入線(xiàn)蟲(chóng)固定及培養(yǎng)室，培養(yǎng)室的尺寸可使其自由游動(dòng)； 熒光成像時(shí)利用氣壓使PDMS膜形變，將蟲(chóng)體壓在進(jìn)樣通道側(cè)壁上使其固定并成像； 每天進(jìn)行三次物質(zhì)交換，為添加新鮮食物并施加葡萄糖或者藥物刺激，排出線(xiàn)蟲(chóng)代謝廢物，方式為負(fù)壓抽取。10.按照權(quán)利要求9所述的基于微閥的雙檢測(cè)微流控芯片的糖尿病模型構(gòu)建方法，其特征在于:通過(guò)對(duì)培養(yǎng)室中的線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行高濃度葡萄糖刺激，使線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)糖濃度達(dá)到與人類(lèi)糖尿病患者相似的糖濃度，并研究在該條件下線(xiàn)蟲(chóng)的壽命和氧化應(yīng)激變化； 所述孔板培養(yǎng)中使用糖濃度為100mM-200mM。11.按照權(quán)利要求9所述的基于微閥的雙檢測(cè)微流控芯片的糖尿病模型構(gòu)建方法，其特征在于:通過(guò)對(duì)培養(yǎng)室中的線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行加藥刺激，可以對(duì)治療糖尿病的藥物進(jìn)行高通量篩選。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種基于微閥的雙檢測(cè)微流控芯片及糖尿病模型構(gòu)建方法。該芯片由三層PDMS組成，上層為液路層，下層為氣路控制層，上下兩層中間為PDMS膜，膜在氣壓作用下發(fā)生形變以實(shí)現(xiàn)線(xiàn)蟲(chóng)固定?；谖㈤y的雙檢測(cè)微流控芯片的糖尿病模型構(gòu)建方法,將單個(gè)線(xiàn)蟲(chóng)加入蟲(chóng)及藥品入口處，將單個(gè)蟲(chóng)引入線(xiàn)蟲(chóng)固定及培養(yǎng)室；熒光成像時(shí)利用氣壓使PDMS膜形變，將蟲(chóng)體壓在進(jìn)樣通道側(cè)壁上使其固定并成像；每天進(jìn)行三次物質(zhì)交換，為添加新鮮食物并施加葡萄糖或者藥物刺激，排出線(xiàn)蟲(chóng)代謝廢物。本發(fā)明采用通道設(shè)計(jì)，操作簡(jiǎn)單，且易于實(shí)現(xiàn)物質(zhì)交換，有利于線(xiàn)蟲(chóng)的長(zhǎng)期培養(yǎng)；線(xiàn)蟲(chóng)固定方法采用膜形變的方式，對(duì)蟲(chóng)體安全無(wú)害，可對(duì)單個(gè)線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)及運(yùn)動(dòng)、成像雙檢測(cè)。
【IPC分類(lèi)】A01K67/033
【公開(kāi)號(hào)】CN105707010
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410736591
【發(fā)明人】秦建華, 朱國(guó)麗, 尹方超
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所