水稻基因Os HRH在促進(jìn)水稻繁殖和分蘗中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種水稻DNA片斷的分離克隆、氨基酸序列優(yōu)化以及功能驗(yàn)證及其應(yīng)用。所述的DNA片斷包含與水稻生長(zhǎng)速度相關(guān)基因OsHRH，它賦予水稻植株的快速生長(zhǎng)的能力。將該DNA片段與外源啟動(dòng)子序列連接后直接轉(zhuǎn)入植物體，轉(zhuǎn)基因植物植株的繁殖能力顯著增加，分蘗能力顯著增強(qiáng)，產(chǎn)量也得到相應(yīng)的提高。
【專利說(shuō)明】水稻基因 Os HRH在促進(jìn)水稻繁殖和分蘗中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物生物【技術(shù)領(lǐng)域】。具體涉及一種水稻DNA片斷的分離克隆、氨基酸 序列優(yōu)化以及功能驗(yàn)證及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 水稻原產(chǎn)亞洲熱帶，在中國(guó)廣為栽種后，逐漸傳播到世界各地。按照不同的方法， 水稻可以分為秈稻和粳稻、早稻和中晚稻、糯稻和非糯稻。我國(guó)科學(xué)家袁隆平對(duì)雜交水稻的 研宄作出了巨大貢獻(xiàn)，被譽(yù)為"雜交水稻之父"。水稻所結(jié)子實(shí)即稻谷，稻谷（粒）去殼后稱 大米、香米、稻米.世界上近一半人口，都以大米為食。大米的食用方法多種多樣，有米飯、 米粥、米餅、米糕、米酒等。水稻除可食用外，還可以釀酒、制糖作工業(yè)原料，稻殼、稻桿，可以 作為飼料。我國(guó)水稻主產(chǎn)區(qū)主要是東北地區(qū)、長(zhǎng)江流域、珠江流域。屬于直接經(jīng)濟(jì)作物。還 是世界上三分之一人類的主食。
[0003] 植物利用光能將二氧化碳和水轉(zhuǎn)變成碳水化合物并釋放氧氣的過(guò)程稱為光合作 用。光合作用是生物界賴以生存的基礎(chǔ)，也是地球碳氧循環(huán)的重要媒介。葉片是高等植物 進(jìn)行光合作用的主要場(chǎng)所，在這個(gè)過(guò)程中，首先由位于葉綠體內(nèi)的葉綠素捕獲光能并傳遞 到光合反應(yīng)中心，從而開始了能量的轉(zhuǎn)化過(guò)程。光合作用被認(rèn)為是地球上最重要的化學(xué)反 應(yīng)，光合作用是作物產(chǎn)量形成的物質(zhì)基礎(chǔ)，90?95%的植物干重來(lái)自光合產(chǎn)物。而光合作 用除了與光有關(guān)之外，植株的葉片的表面積作為光反應(yīng)的主要場(chǎng)所，決定著生物質(zhì)的產(chǎn)量 的多少。因此，提尚植株的整體繁殖能力對(duì)于提尚水稻的廣量具有積極的意義。提尚水稻 的產(chǎn)量一直是科學(xué)家孜孜不倦的追求，而增加植株的繁殖能力以及水稻的分蘗水平對(duì)于提 高水稻的產(chǎn)量具有重要的意義。本發(fā)明克隆并優(yōu)化得到了 Os HRH基因，利用該基因進(jìn)行水 稻遺傳轉(zhuǎn)化并鑒定了轉(zhuǎn)基因植株的繁殖以及分蘗能力。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是從水稻中分離克隆一個(gè)植株生長(zhǎng)以及分蘗相關(guān)的完整編碼區(qū)段 的DNA片段，利用這個(gè)基因促進(jìn)植物的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)和/或提高植物的分蘗能力。這個(gè)基因被 命名為Os HRH。
[0005] 本發(fā)明涉及分離和應(yīng)用一種包含OsHRH基因的DNA片段，該片段賦予水稻植株的 繁殖能力增強(qiáng)的能力和/或提高植物的分蘗能力。為了增強(qiáng)所述基因的效果， 申請(qǐng)人:對(duì)所 述的基因片段進(jìn)行基因的定點(diǎn)突變，從100個(gè)突變體中通過(guò)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)有10個(gè)蛋白具 有較好的實(shí)驗(yàn)效果，因此選擇這10個(gè)具有較好效果的突變體蛋白。所述氨基酸片段如序列 表 SEQ ID NO :1-11 所示。
[0006] 可以采用已經(jīng)克隆的OsHRH基因作探針，從cDNA和基因組文庫(kù)中篩選得到本發(fā)明 的基因或同源基因。同樣，也可以采用PCR(polymerase chain reaction)技術(shù)，從基因組、 mRNA和cDNA中擴(kuò)增得到本發(fā)明的OsHRH基因以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一 段DNA。采用以上技術(shù)，可以分離得到包含OsHRH基因的序列，將這一序列與任何一種可以 引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植株，可獲得植株繁殖能力增強(qiáng)以及分蘗能力 提高的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加 上任何一種強(qiáng)啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，也可使 用增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子和鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編 碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的翻譯。
[0007] 攜帶有本發(fā)明OsHRH基因的表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒，植物病毒載體，直接 DNA轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞（Weissbach，1998,Method for Plant Molecular Biology VIII, Academy Press, New York, pp. 411-463 ；Geiserson and Corey，1998,Plant Molecular Biology(2ndEdition)〇
[0008] 可使用包括本發(fā)明的OsHRH基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主是包括水稻在內(nèi)多種植物， 培育增加植物量植物品種。
[0009] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。

【具體實(shí)施方式】
[0010] 實(shí)施例1 :分離克隆包含有OsHRH基因區(qū)段的DNA片段
[0011] 以水稻品種"珍汕97"作為模板，并設(shè)計(jì)序列特異引物外加接頭BamHI位點(diǎn)和XbaI 位點(diǎn)。將擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物連入pGEM-T載體（購(gòu)自Promega公司），篩選陽(yáng)性克隆并測(cè) 序（ABI3730測(cè)序儀），獲得所需的全長(zhǎng)基因cDNA，并得到了氨基酸序列為SEQ ID NO :1所 示。該克隆被命名為pGEM-OsHRH。
[0012] 實(shí)施例2 OsHRH蛋白定點(diǎn)突變
[0013] 將SEQ ID NO :1的蛋白質(zhì)序列，通過(guò)設(shè)計(jì)引物，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)序列中基因的定點(diǎn)突 變。突變了 100個(gè)突變體，并獲得了相應(yīng)的核苷酸序列并構(gòu)建相應(yīng)的pGEM-OsHRH突變載體。
[0014] 實(shí)施例3, OsHRH基因抑制表達(dá)、超量表達(dá)以及啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化
[0015] 為了能更好地闡明此基因的功能， 申請(qǐng)人:將其在水稻中抑制表達(dá)和超量表達(dá)，從 轉(zhuǎn)基因植株的表型來(lái)驗(yàn)證。
[0016] 抑制表達(dá)（RNAi)載體構(gòu)建方法如下：首先根據(jù)"ymtdgml"祀點(diǎn)通過(guò)常規(guī)的設(shè)計(jì)方 法設(shè)計(jì)了 siRNA，合成所述的siRNA并構(gòu)建RNAi載體。
[0017] 超量表達(dá)載體構(gòu)建方法如下：首先將實(shí)施例1中以及實(shí)施例2得到的陽(yáng)性克隆 pGEM-OsHRH質(zhì)粒用BamHI和XbaI雙酶切，回收外源片段；同時(shí)，用同樣的方法酶切攜帶不 同啟動(dòng)子的遺傳轉(zhuǎn)化載體PC1301S。酶切完畢，用氯仿：異戊醇（按以及比：24 : 1)抽提， 純化酶切產(chǎn)物。用包含OsRRGl基因的酶切片段和酶切后的載體做連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿 菌DH10f3 (菌株購(gòu)自Invitrogen公司）。通過(guò)酶切篩選陽(yáng)性克隆，獲得轉(zhuǎn)化載體。遺傳轉(zhuǎn) 化的載體PC1301S是在國(guó)際上常用的植物遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1301基礎(chǔ)上，在酶切位點(diǎn) EcoRI和SacI處引入廣泛使用的組成型表達(dá)的煙草花葉病毒CaMV 35S啟動(dòng)子而得到的。
[0018] 通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法將其導(dǎo)入到水稻品種"中花11"（中國(guó)水稻 研宄所提供的一個(gè)公開使用的一個(gè)水稻品種）中（其它任意的水稻品種也能夠達(dá)到相同的 效果，再次不一一列舉），經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生 根、練苗移栽，得到轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻（粳稻亞種）遺傳轉(zhuǎn)化方法應(yīng)用Hiei等 人報(bào)道的方法（Hiei 等，Efficient transformation of rice?Oryza sativa L ,mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA? Plant J， 6 :271-282,1994)進(jìn)行。
[0019] 上述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化具體步驟的培養(yǎng)基如下所述：
[0020] 試劑配方：（1)試劑和溶液縮寫：本發(fā)明中培養(yǎng)基所用到的植物激素的縮寫表示 如下：6-BA(6-芐基腺嘌呤）；CN(羧芐青霉素）；KT (激動(dòng)素或稱細(xì)胞分裂素）；NAA(萘乙 酸）；ΙΑΑ(卩引噪乙酸）；2,4-D(2、4-二氯苯氧乙酸）；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮）； CH(水解酪蛋白）；HN(Hygr〇mycin B，潮霉素）；DMS0(二甲基亞砜）；N6max(N6大量成分溶 液）；N6mix(N6微量成分溶液）；MSmax(MS大量成分溶液）；Msmi X(MS微量成分溶液）（2)主 要溶液配方：
[0021] 1)N6培養(yǎng)基大量元素母液[10倍濃縮液（IOX)]的配制：
[0022]

【權(quán)利要求】
1. 〇8服11基因的蛋白質(zhì)序列，如序列表5￡〇10勵(lì)：1-11任一序列所示。
2. 編碼權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的DNA序列。
3. 權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)序列或DNA序列在增加植物繁殖能力中的應(yīng)用。
4. 權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)序列或DNA序列在增加植物分蘗能力中的應(yīng)用。
5. 如權(quán)利要求3-4任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于：所述植物為水稻。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK104479000SQ201410783207
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月5日
【發(fā)明者】紀(jì)清俠 申請(qǐng)人:紀(jì)清俠