一種促進人工栽培鐵皮石斛生長的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及鐵皮石斛研究與開發(fā)應(yīng)用的技術(shù)，特別涉及促進人工栽培鐵皮石斛生長的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]石斛屬(Dendrobium)是蘭科(Orchidaceae)植物中的第2大屬，迄今已發(fā)現(xiàn)全球有1500多個種，我國有70多個種[宋經(jīng)元，郭順星.近10年來石斛屬植物的研究進展.中國藥學(xué)雜志，2004，39 (10):25 ?27]。其中，以鐵皮石斛(Dendrobium candidum Wall.ExLindl.)為代表的一些品種是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，在《本草綱目》等古醫(yī)書中被列為上品?，F(xiàn)代科學(xué)研究與臨床實踐證明，石斛藥材除具有如古醫(yī)書記載的滋陰清熱、生津益胃、潤肺止咳、明目強身、鎮(zhèn)痛消炎等功效外，還具有顯著的抗腫瘤、抗衰老、抗輻射、抗血栓、抗血小板凝集及增強機體免疫力等功效。近年來石斛藥材的需求量不斷增加，而石斛屬植物的生境較為獨特，自然繁殖率低，導(dǎo)致天然石斛無序采集，野生資源銳減，部分石斛品種已瀕臨滅絕。近10多年來，石斛人工栽培技術(shù)取得了很大發(fā)展，并已實現(xiàn)大面積推廣與商業(yè)化應(yīng)用。但如鐵皮石斛等一些名貴品種在人工栽培條件下從組培苗到成品采摘仍需2年多的時間。若使用生長激素等化學(xué)物質(zhì)，雖可明顯加快生長、縮短生產(chǎn)周期，但產(chǎn)品的品質(zhì)及食用安全性等卻受到嚴重影響。石斛屬植物與其它附生蘭科植物一樣，其根群不與土壤接觸(即生不入土)，而是附著在樹的枝干或巖石上生長，利用雨露、空氣中的水汽及有限的腐殖質(zhì)(腐爛的枯枝殘葉或動物排泄物等)為生，它們對生態(tài)環(huán)境的要求十分嚴格，高溫高濕的熱帶雨林通常是它們生長、繁殖的最佳環(huán)境[張紹云，馬偉光，尚建華等.思茅地區(qū)石斛屬植物資源的調(diào)查.云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報.2005，28 (I):24?27]。為此，迫切需要通過研究為人工栽培鐵皮石斛建立類似其野生生長環(huán)境的模式，以促進當前人工栽培鐵皮石斛產(chǎn)量和品質(zhì)的提升。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，目的是提供一種促進人工栽培鐵皮石斛生長的新方法。
[0004]為解決技術(shù)問題，本發(fā)明的方案是:
[0005]提供一種促進人工栽培鐵皮石斛生長的新方法，包括以下步驟:
[0006](I)將50g野生或人工栽培鐵皮石斛新鮮莖段剪成約Icm的小段并置于研缽內(nèi)，加入50ml Basal培養(yǎng)液[陳峰，姜悅主編.微藻生物技術(shù).中國輕工業(yè)出版社，1999，P61]并充分研碎，將研碎物轉(zhuǎn)入100ml燒瓶中，加入600ml Basal培養(yǎng)液并用玻璃棒充分攪拌直至塊狀物散開，置于50°C恒溫水浴中保溫4h，期間不時攪拌；
[0007](2)將⑴中的保溫液用100目尼龍篩絹過濾，再用300ml Basal培養(yǎng)液潤洗燒瓶及篩絹上的濾渣，將濾液用Basal培養(yǎng)液定容至1000ml，并加入2ml甘油，即配制成野生鐵皮石斛附生藻培養(yǎng)液，記為DCA-M ;
[0008](3)用浸蘸DCA-M的棉簽輕拭野生新鮮鐵皮石斛莖上的藻斑，爾后將棉球放入盛有5ml DCA-M的50ml燒杯中潤洗，重復(fù)輕拭-潤洗10次，直至燒杯中的藻液呈淡綠色，并用100目的尼龍篩絹過濾；
[0009](4)將濾得的藻液置恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度25°C，光照40 μπιο?.m 2.s /待藻液在分光光度計波長560nm處的光密度OD56。達0.8時，用DCA-M稀釋使OD 56。至0.1，在上述條件下繼續(xù)放大培養(yǎng)，如此反復(fù)，直至OD56。達0.8的藻液達10ml ；
[0010](5)將上述OD56。達0.8的藻液轉(zhuǎn)入高速離心機的離心管中以8000?12000rpm的轉(zhuǎn)速離心10-15min，小心傾去上清液后即得藻泥；
[0011](6)將上述藻泥均勻涂于直徑為7cm的玻璃培養(yǎng)皿中，置于溫度為40°C、相對濕度RH為20%、光照強度40 μπιο?.m2.s 1的人工光照氣候箱中處理12d后，取出并用10ml的DCA-M潤洗后轉(zhuǎn)入250ml的三角瓶中置于溫度25°C、光照40 μ mol.m 2.s 1的恒溫光照培養(yǎng)箱，過1d后發(fā)現(xiàn)變綠，取樣于顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)野生鐵皮石斛附生藻中的部分藻能恢復(fù)生長；
[0012](7)待(6)中的藻液OD56。達0.8時，用DCA-M稀釋使OD 56。至0.1繼續(xù)放大培養(yǎng)，直至OD56。達0.8的藻液達100ml ；
[0013](8)將(7)中OD56。達0.8的藻液用Basal培養(yǎng)液稀釋使OD 56。至0.4后繼續(xù)放大培養(yǎng)，直至獲得需要的量；
[0014](9)用噴霧器將(8)中培養(yǎng)OD56。達0.8的藻液以32L/畝的用量噴施于新栽種的鐵皮石斛苗上，過3周再如上用量噴施I次，約過6周后即可見栽種鐵皮石斛的莖及基質(zhì)松鱗和碎石上有藻長出，這些藻可起到保濕抗旱，并為鐵皮石斛提供部分養(yǎng)分等作用，而能顯著促進人工栽培鐵皮石斛的生長速度。
[0015]作為一種改進，所述在高速離心機上的離心速率為lOOOOrpm，離心時間為lOmin。
[0016]本發(fā)明的有益效果在于:
[0017]本發(fā)明研制野生鐵皮石斛附生藻培養(yǎng)液DCA-M含鐵皮石斛多糖等產(chǎn)物及甘油，其滲透壓和營養(yǎng)價值均高于僅以無機元素配制的Basal培養(yǎng)液，以適應(yīng)野生鐵皮石斛附生藻離體液體培養(yǎng)的需要；以將初步分離的附生藻置于高溫干燥環(huán)境下進行壓力篩選，可獲得保濕耐旱的附生藻；在附生藻后期擴大培養(yǎng)中改用Basal培養(yǎng)液對藻液進行成倍稀釋，是為讓藻液的滲透壓和營養(yǎng)物不要降得太低，以滿足附生藻生長需要且減低培養(yǎng)液的成本。這種方法具有操作簡便、成本低、對操作人員的專業(yè)技術(shù)無特殊要求、應(yīng)用性強等優(yōu)點。
【附圖說明】
[0018]圖1為從野生鐵皮石斛莖上分離的部分附生藻；
[0019]圖2為經(jīng)高溫、干燥處理后恢復(fù)生長的附生藻；
[0020]圖3為人工栽培鐵皮石斛噴施附生藻8個月后的促生長效果，A未噴施附生藻、B噴施附生藻。
【具體實施方式】
[0021]本發(fā)明的技術(shù)方案可以通過以下步驟實現(xiàn)。
[0022]實例1:
[0023]選用樣本材料:野生新鮮鐵皮石斛(Dendrobium candid Wall.Ex Lindl.)采自云南思茅，可到云南思茅采集，也可于每年5-10月份在杭州鳳起花鳥市場、杭州吳山廣場花鳥市場等市場購買。
[0024]試劑和儀器:本發(fā)明中所用的培養(yǎng)液成分均為國產(chǎn)分析純。CH-30光學(xué)顯微鏡為日本OLYMPUS生產(chǎn)；Ultrospec 2000型紫外-可見分光光度計為美國Pharmacia公司生產(chǎn)；TE214S型電子天平為北京賽多利斯生產(chǎn)；TGL-16A高速離心機為長沙平凡儀器儀表公司生產(chǎn)。
[0025]分離促進人工栽培鐵皮石斛生長的附生藻及其噴施方法的主要步驟如下:
[0026](I)將50g采自云南思茅的野生鐵皮石斛新鮮莖段剪成約Icm的小段并置于研缽內(nèi)，加入50ml Basal培養(yǎng)液并充分研碎，將研碎物轉(zhuǎn)入100ml燒瓶中，加入600ml Basal培養(yǎng)液并用玻璃棒充分攪拌直至塊狀物散開，置于50°C恒溫水浴中保溫4h，期間不時攪拌；
[0027](2)將⑴中的保溫液用100目尼龍篩絹過濾，再用300ml Basal培養(yǎng)液潤洗燒瓶及篩絹上的濾渣，將濾液用Basal培養(yǎng)液定容至1000ml，并加入2ml甘油，即配制成野生鐵皮石斛附生藻培養(yǎng)液，記為DCA-M ;
[0028](3)用浸蘸DCA-M的棉簽輕拭云南思茅的野生新鮮鐵皮石斛莖上的藻斑，爾后將棉球放入盛有5ml DCA-M的50ml燒杯中潤洗，重復(fù)輕拭-潤洗10次，直至燒杯中的藻液呈淡綠色，取樣于顯微鏡下觀察野生鐵皮石斛附生藻的種類如附圖1所示，有小球藻、柵藻、硅藻、舟形藻等；
[0029](4)用100目的尼龍篩絹過濾步驟(3)中的藻樣，濾液置恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度25°C，光照40 ymol -1n2-S /待藻液在分光光度計波長560nm處的光密度OD56。達0.8時，用DCA-M稀釋使OD56。至0.1，在上述條件下繼續(xù)放大培養(yǎng)，如此反復(fù)，直至OD 56。達0.8的藻液達10ml ；
[0030](5)將上述OD56。達0.8的藻液轉(zhuǎn)入高速離心機的離心管中以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心lOmin，小心傾去上清液后即得藻泥；
[0031](6)將上述藻泥均勻涂于直徑為7cm的玻璃培養(yǎng)皿中，置于溫度為40°C、相對濕度RH為20%、光照強度40μπιΟ1.πι2.s 1的人工光照氣候箱中處理12d后，取出并用10ml的DCA-M潤洗后轉(zhuǎn)入250ml的三角瓶中置于溫度25°C、光照40 μ mol.m 2.s 1的恒溫光照培養(yǎng)箱，過1d后發(fā)現(xiàn)變綠，取樣于顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)野生鐵皮石斛附生藻中的小球藻和柵藻能恢復(fù)生長，說明它們具有良好的保濕和耐旱能力，詳見附圖2 ;
[0032](7)待(6)中的藻液OD56。達0.8時，用DCA-M稀釋使OD 56。至0.1繼續(xù)放大培養(yǎng)，直至OD56。達0.8的藻液達1000ml ；
[0033](8)將(7)中OD56。達0.8的藻液用Basal培養(yǎng)液稀釋使OD 56。至0.4后繼續(xù)放大培養(yǎng)，直至獲得需要的量；
[0034](9)用噴霧器將⑶中培養(yǎng)OD56。達0.8的藻液以16L/畝的用量噴施于浙江上虞浙東生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司2013年底新栽種的鐵皮石斛苗上，過3周再如上用量噴施一次，約過6周后即可見栽種鐵皮石斛的莖及基質(zhì)松鱗和碎石上有藻長出，附圖3為2014年8月人工栽培鐵皮石斛噴施附生藻與否的比較圖，可見，這些藻可起到保濕抗旱，并為鐵皮石斛提供部分養(yǎng)分等作用，能顯著促進人工栽培鐵皮石斛的生長，產(chǎn)量可提高I倍以上。
[0035]實例2:選取杭州健港生物科技有限公司浙江省建德市基地的人工栽培新鮮鐵皮石斛(Dendrobium candid Wall.Ex Lindl.)為樣本，利用本發(fā)明的方法配制DCA-M，從采自浙江雁蕩山的野生鐵皮石斛莖上也分離到以小球藻和柵藻為優(yōu)勢種的附生藻，并將附生藻藻體培養(yǎng)后用于浙江大學(xué)湖州現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范基地的人工栽培鐵皮石斛，也起到了增產(chǎn)近I倍的效果。
[0036]實例3:選取選取杭州小香生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司浙江省建德市基地的人工栽培新鮮鐵皮石斛(Dendrobium candid Wall.Ex Lindl.)為樣本，利用本發(fā)明的方法配制DCA-M，從采自福建武夷山的野生鐵皮石斛莖上也分離到以小球藻和柵藻為優(yōu)勢種的附生藻，并將附生藻藻體培養(yǎng)后用于浙江海興生物科技有限公司武義基地的人工栽培鐵皮石斛，也起到了增產(chǎn)近I倍的效果。
【主權(quán)項】
1.促進人工栽培鐵皮石斛生長的方法，包括以下步驟: (1)將50g野生或人工栽培鐵皮石斛新鮮莖段剪成約Icm的小段并置于研缽內(nèi)，加入50ml Basal培養(yǎng)液并充分研碎，將研碎物轉(zhuǎn)入100ml燒瓶中，加入600ml Basal培養(yǎng)液并用玻璃棒充分攪拌直至塊狀物散開，置于50°C恒溫水浴中保溫4h，期間不時攪拌； (2)將(I)中的保溫液用100目尼龍篩絹過濾，再用300mlBasal培養(yǎng)液潤洗燒瓶及篩絹上的濾渣，將濾液用Basal培養(yǎng)液定容至1000ml，并加入2ml甘油，即配制成野生鐵皮石斛附生藻培養(yǎng)液，記為DCA-M ； (3)用浸蘸DCA-M的棉簽輕拭野生新鮮鐵皮石斛莖上的藻斑，爾后將棉球放入盛有5mlDCA-M的50ml燒杯中潤洗，重復(fù)輕拭-潤洗10次，直至燒杯中的藻液呈淡綠色，并用100目的尼龍篩絹過濾； (4)將濾得的藻液置恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度25°C，光照40μπιο?.m 2.s /待藻液在分光光度計波長560nm處的光密度OD56。達0.8時，用DCA-M稀釋使OD 56。至0.1，在上述條件下繼續(xù)放大培養(yǎng)，如此反復(fù)，直至OD56。達0.8的藻液達10ml ； (5)將上述OD56。達0.8的藻液轉(zhuǎn)入高速離心機的離心管中以8000?12000rpm的轉(zhuǎn)速離心10-15min，小心傾去上清液后即得藻泥； (6)將上述藻泥均勻涂于直徑為7cm的玻璃培養(yǎng)皿中，置于溫度為40°C、相對濕度RH為20%、光照強度40μπιΟ1.πι2.s 1的人工光照氣候箱中處理12d后，取出并用10ml的DCA-M潤洗后轉(zhuǎn)入250ml的三角瓶中置于溫度25°C、光照40 μπιο?.m 2.s 1的恒溫光照培養(yǎng)箱，過1d后發(fā)現(xiàn)變綠，取樣于顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)野生鐵皮石斛附生藻中的部分藻能恢復(fù)生長; (7)待(6)中的藻液OD56。達0.8時，用DCA-M稀釋使OD 56。至0.1繼續(xù)放大培養(yǎng)，直至OD56。達0.8的藻液達100ml ； (8)將(7)中OD56。達0.8的藻液用Basal培養(yǎng)液稀釋使OD 56。至0.4后繼續(xù)放大培養(yǎng)，直至獲得需要的量； (9)用噴霧器將(8)中培養(yǎng)OD56。達0.8的藻液以32L/畝的用量噴施于新栽種的鐵皮石斛苗上，過3周再如上用量噴施I次，約過6周后即可見栽種鐵皮石斛的莖及基質(zhì)松鱗和碎石上有藻長出，這些藻可起到保濕抗旱，并為鐵皮石斛提供部分養(yǎng)分等作用，而能顯著促進人工栽培鐵皮石斛的生長速度。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述促進人工栽培鐵皮石斛生長的方法，其特征在于，所述在高速離心機上的離心速率為lOOOOrpm，離心時間為lOmin。
【專利摘要】本發(fā)明涉及鐵皮石斛研究與開發(fā)應(yīng)用，旨在提供一種促進人工栽培鐵皮石斛生長的方法。該方法是在Basal培養(yǎng)液中加入鐵皮石斛多糖等產(chǎn)物及甘油，配制成野生鐵皮石斛附生藻的培養(yǎng)液DCA-M；從野生鐵皮石斛莖上分離附生藻，并經(jīng)高溫干燥環(huán)境下進行壓力篩選，獲得保濕耐旱性能好的附生藻；對附生藻進行培養(yǎng)并噴施于人工栽培的鐵皮石斛苗，可起到顯著的促生長作用。本發(fā)明方法與傳統(tǒng)促生長方法相比，具有操作簡便、成本低、效果明顯、對操作人員的專業(yè)技術(shù)無特殊要求、應(yīng)用性強等優(yōu)點，可為人工栽培鐵皮石斛高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)等提供必要的技術(shù)方法。
【IPC分類】A01G33/00, A01G31/00, C05F11/00
【公開號】CN105706868
【申請?zhí)枴緾N201510084355
【發(fā)明人】汪凡越
【申請人】汪凡越