本發(fā)明涉及疾病動(dòng)物模型制備技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種前列腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌基因工程動(dòng)物模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

前列腺癌是男性中常見(jiàn)的泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤，嚴(yán)重影響男性的身體健康，給患者造成心理上的巨大壓力。前列腺癌發(fā)病率與死亡率占男性惡性腫瘤第一位，近年來(lái)我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)。臨床上對(duì)于前列腺癌患者的主要的治療方法有手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)療法、內(nèi)分泌療法等。手術(shù)治療是目前治療癌癥的首選方法，但是前列腺癌患者的診斷多在晚期，常錯(cuò)過(guò)手術(shù)的最佳時(shí)機(jī)，并且前列腺根治性手術(shù)多損傷較大。放射治療是目前對(duì)于前列腺癌的治療十分有效的方法，主要用于無(wú)法采用手術(shù)治療但尚無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者。放射治療?？梢允骨傲邢倌[瘤減小。化學(xué)療法是作為晚期前列腺癌的輔助治療方法，主要用于手術(shù)治療或者放射治療后局部腫瘤已消除的患者?；熕幬锟梢韵凉撛诘摹⑸袩o(wú)探測(cè)到的微小病灶。但是單獨(dú)使用化學(xué)療法不能治愈原發(fā)病灶，只有對(duì)于采用其他方法治療的患者進(jìn)行化學(xué)療法輔助治療，可以延長(zhǎng)病人的生存時(shí)間。在臨床上內(nèi)分泌療法是治療前列腺癌晚期的重要手段。前列腺癌具有典型的激素依賴(lài)性，當(dāng)體內(nèi)雄激素水平下降時(shí)，癌細(xì)胞出現(xiàn)死亡，可以使前列腺病變和癥狀明顯得到緩解。

臨床上，絕大部分前列腺癌為起源于外分泌細(xì)胞的導(dǎo)管和腺泡腺癌（PCA），5%～10%患者伴有局灶性的神經(jīng)內(nèi)分泌分化(NED)，而0.5～2％患者則出現(xiàn)廣泛的NED，稱(chēng)為前列腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌（NEPC），侵襲性更強(qiáng)。盡管目前對(duì)于前列腺癌的治療方法有很多種，但是一旦患者腫瘤出現(xiàn)NED，則目前尚無(wú)有效的臨床治療手段。NED的發(fā)生與腫瘤的進(jìn)展、雄激素非依賴(lài)轉(zhuǎn)化和不良預(yù)后等有重要關(guān)系。臨床上，NEPC對(duì)目前治療前列腺癌的主要方法-雄激素阻斷療法無(wú)反應(yīng)，且預(yù)后差，患者平均生存時(shí)間5～17.5個(gè)月。

盡管目前有TRAMP等自發(fā)前列腺癌基因工程小鼠用于前列腺癌治療藥物的開(kāi)發(fā)，但是模型小鼠前列腺癌病理進(jìn)程發(fā)展較慢，導(dǎo)致研究周期較長(zhǎng)，這嚴(yán)重制約了抗前列腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌藥物的開(kāi)發(fā)研制。所以，尋找新的、對(duì)于人類(lèi)前列腺癌臨床病理發(fā)展過(guò)程能夠快速模擬的基因工程小鼠模型，將為臨床前列腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌腫瘤治療提出了新的治療途徑和希望，并具有更加廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種前列腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌基因工程動(dòng)物模型的構(gòu)建方法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種前列腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌基因工程動(dòng)物模型在篩選治療前列腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌藥物中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：

一種前列腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌基因工程動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟：將敲除PSGL-1基因后的TRAMP小鼠飼養(yǎng)至24周齡以上即得前列腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌基因工程動(dòng)物模型。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)自發(fā)前列腺癌的TRAMP基因工程小鼠的前列腺腫瘤為腺癌。而在敲除PSGL-1后的TRAMP小鼠(TRAMP;PSGL-1^-/-)飼養(yǎng)至24周齡以上時(shí)，前列腺腫瘤出現(xiàn)顯著的神經(jīng)內(nèi)分泌癌特性。腫瘤組織病理學(xué)表現(xiàn)為由燕麥形的小細(xì)胞組成，細(xì)胞異型性明顯，細(xì)胞小，胞漿少，核仁不明顯，幾乎不表達(dá)分泌前列腺特異性抗原（PSA），但表達(dá)神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞標(biāo)志物，如嗜鉻粒蛋白A（CgA），突觸素（Syn）和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE），且電鏡下可見(jiàn)胞漿內(nèi)含有很多神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒，這些是臨床病理診斷NEPC的依據(jù)，因此，這樣的模型可以作為研究前列腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌發(fā)病機(jī)理及篩選靶向藥物和療效評(píng)估的動(dòng)物模型。

優(yōu)選地，所述前列腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌基因工程動(dòng)物模型的構(gòu)建方法如下：將雄性PSGL-1^-/-小鼠和雌性TRAMP小鼠雜交得F1代，F(xiàn)1代分籠鑒定；將F1代中的TRAMP陽(yáng)性; PSGL-1^+/-雌性小鼠與雄性PSGL-1^-/-小鼠雜交得F2代，F(xiàn)2代分籠鑒定；將F2代中的TRAMP陽(yáng)性; PSGL-1^-/-雌性小鼠與PSGL-1^-/-雄性小鼠雜交獲得F3代，F(xiàn)3代分籠鑒定獲得TRAMP;PSGL-1^-/-小鼠；TRAMP;PSGL-1^-/-小鼠飼養(yǎng)至24周齡以上即得前列腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌基因工程動(dòng)物模型。

作為優(yōu)選實(shí)施方式，將TRAMP;PSGL-1^-/-小鼠飼養(yǎng)至24周齡即得前列腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌基因工程動(dòng)物模型。

如上所述構(gòu)建方法得到的前列腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌基因工程動(dòng)物模型在篩選治療前列腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌藥物中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明提供的前列腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌基因工程動(dòng)物模型可以用來(lái)研究前列腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌發(fā)病機(jī)理及篩選靶向藥物和療效評(píng)估。由于該模型在整體水平更自然地模擬臨床上疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，可有效地將復(fù)雜的生物學(xué)問(wèn)題與藥物的作用結(jié)合起來(lái)考察藥物的治療效果。而且在我們建立的小鼠模型活體動(dòng)物中進(jìn)行研究,能兼顧類(lèi)似于人體內(nèi)的各種背景因素，研究結(jié)論具有很高的可靠性。因此，我們發(fā)現(xiàn)的本實(shí)驗(yàn)小鼠模型是一種很好的用來(lái)篩選抗前列腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌藥物的有效工具，對(duì)尋找有效治療藥物的關(guān)鍵靶點(diǎn)以及神經(jīng)疾病的治療方法具有重要的意義。

附圖說(shuō)明

圖1為T(mén)RAMP;PSGL-1^-/-雜交小鼠的建系流程圖。

圖2為T(mén)RAMP基因的鑒定結(jié)果。

圖3為PSGL-1基因的鑒定結(jié)果。

圖4為 TRAMP小鼠和TRAMP;PSGL-1^-/-小鼠前列腺癌病理發(fā)展進(jìn)程H&E染色結(jié)果。

圖5為 TRAMP小鼠和TRAMP;PSGL-1^-/-小鼠前列腺癌病理發(fā)展進(jìn)程免疫組化結(jié)果。

圖6為 24周齡TRAMP和TRAMP;PSGL-1^-/-小鼠前列腺癌組織透射電鏡觀察結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，所述實(shí)施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。

TRAMP小鼠品系名稱(chēng)為C57BL/6-Tg(TRAMP)8247Ng/J，PSGL-1基因敲除小鼠(PSGL-1 Knock out；PSGL-1^-/-)品系名稱(chēng)為B6.Cg-Selplgtm1Fur/J，TRAMP小鼠和PSGL-1基因敲除小鼠均購(gòu)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室，C57小鼠購(gòu)自廣東省動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于SPF級(jí)的環(huán)境中。

實(shí)施例1

一、TRAMP;PSGL-1^-/-雜交小鼠的建系（構(gòu)建流程見(jiàn)圖1）：將雄性PSGL-1^-/-小鼠和雌性TRAMP小鼠合籠飼養(yǎng)，每籠以雄：雌=1：3的最佳比例配種，得F1代后分籠鑒定；將F1代中的TRAMP陽(yáng)性; PSGL-1^+/-雌性小鼠與雄性PSGL-1^-/-小鼠雜交得F2代小鼠，F(xiàn)2代分籠鑒定；將F2代中的TRAMP陽(yáng)性; PSGL-1^-/-雌性小鼠與PSGL-1^-/-雄性小鼠雜交擴(kuò)群，獲得F3代小鼠，F(xiàn)3代分籠鑒定將獲得的TRAMP;PSGL-1^-/-小鼠用于實(shí)驗(yàn)。

其中TRAMP及PSGL-1^-/-小鼠的鑒定方法如下：

小鼠基因組DNA提?。航M織放入已標(biāo)記好的EP管中；將組織浸沒(méi)于500ul裂解緩沖液A(25mM NaOH 0.5g；0.2mM Na₂EDTA.2H₂O0.037g加H₂O至500ml)中；金屬浴中100℃，1h；加入500ul裂解緩沖液B（40mM Tris Acid 6.3g加H₂O至500ml），旋渦混合，離心，5000rpm，1min，4℃保存；

TRAMP基因片段的擴(kuò)增：TRAMP小鼠PCR反應(yīng)引物序列如下所示。

Mouse β Casein正向引物:5′-GAT GTG CTC CAG GCT AAA GTT-3′；

Mouse β Casein 反向引物:5′-AGA AAC GGA ATG TTG TGG AGT-3′；

Probasin-1 正向引物:5′-CCG GTC GAC CGG AAG CTT CCA CAA GTG CAT TTA-3′；

T-antigen reverse primer:5′-CTC CTT TCA AGA CCT AGA AGG TCC A-3。

配置25ul PCR反應(yīng)體系：四個(gè)引物各1ul，2×PCR Master Mix 12.5ul，DNA模板3ul，加水補(bǔ)足25ul。

TRAMP小鼠PCR反應(yīng)條件：94℃ 1min 預(yù)變性；（94℃ 1min 變性，60℃ 2min 退火，72℃ 3min 延伸）30個(gè)循環(huán)；72℃ 5min 充分延伸；4℃冷卻擴(kuò)增產(chǎn)物；取PCR反應(yīng)產(chǎn)物10ul，加樣于1.2%瓊脂糖凝膠孔，于1×TAE緩沖液中電泳170V，30分鐘。在凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果，如圖2：TRAMP基因陽(yáng)性小鼠有500 bp(野生型)和600 bp (Tag片段)兩條帶，陰性小鼠只有500 bp一條帶。

PSGL-1基因片段的檢測(cè)：檢測(cè)引物如下所示。

Wild type 正向引物：5'-AGC TTC CTT GTG CTG CTG AC-3'；

Common：5'-TCA AAA TCG TCA TCC CCA AC-3'；

Mutant 1：5'-TCA AAA TCG TCA TCC CCA AC-3'；

Mutant 2：5-'CCT TCT ATC GCC TTC TTG ACG-3'。

配置25ul PCR反應(yīng)體系：四個(gè)引物各1ul，2×PCR Master Mix 12.5ul，DNA模板3ul，加水補(bǔ)足25ul。

PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5min 預(yù)變性；（94℃ 30s 變性，65℃ 1min 退火，72℃ 1min 延伸）35個(gè)循環(huán)；72℃ 2min 充分延伸；4℃冷卻擴(kuò)增產(chǎn)物；取PCR反應(yīng)產(chǎn)物10ul，加樣于1.2%瓊脂糖凝膠孔，于1×TAE電泳緩沖液中電泳160V，25min。用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。如圖3：PSGL-1雜合子為500 bp和140 bp；PSGL-1全敲為500 bp；野生型小鼠為140 bp。

二、按照常規(guī)操作飼養(yǎng)TRAMP;PSGL-1^-/-小鼠，定期檢測(cè)不同周齡小鼠的腫瘤組織病理學(xué)特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRAMP;PSGL-1^-/-小鼠飼養(yǎng)至24周齡時(shí)，前列腺腫瘤出現(xiàn)顯著的神經(jīng)內(nèi)分泌癌特性。

TRAMP;PSGL-1^-/-小鼠飼養(yǎng)至24周齡時(shí)的腫瘤組織病理學(xué)特征檢測(cè)方法和結(jié)果如下：

一、H&E染色，取24周，55周TRAMP小鼠前列腺組織和24周TRAMP;PSGL-1^-/-小鼠前列腺組織得到的石蠟切片，厚度為3～4μm。組織石蠟切片脫蠟、蘇木素染色4 分鐘，返藍(lán)，伊紅染色3 秒，37℃過(guò)夜、封片。正置顯微鏡下觀察各個(gè)組織結(jié)構(gòu)變化并拍照，結(jié)果見(jiàn)圖4。

二、免疫組化染色

1、隨機(jī)選取24周，55周TRAMP小鼠前列腺組織和24周TRAMP;PSGL-1^-/-小鼠，每組小鼠各3只。

2、用脫臼法處死小鼠，取沒(méi)有壞死區(qū)域的前列腺組織，將前列腺組織后葉制成石蠟組織切片。

① 固定：4%多聚甲醛固定液中固定24小時(shí)；

② 脫水：固定后的組織經(jīng)過(guò)蒸餾水及70%乙醇清洗后進(jìn)入脫水步驟，脫水過(guò)程使用梯度濃度酒精：70%—80%—90%—95%—無(wú)水乙醇1—無(wú)水乙醇2，其中70%至90%乙醇中放置30分鐘，其余步驟均放置1小時(shí)。

③透明：二甲苯1放置1小時(shí)，二甲苯2放置1小時(shí)。

④浸蠟：準(zhǔn)備兩個(gè)蠟缸分別盛放低熔點(diǎn)石蠟及高熔點(diǎn)石蠟，預(yù)先放入65℃烘箱熔化。透明后的組織分別放入低熔點(diǎn)石蠟1小時(shí)，高熔點(diǎn)石蠟1小時(shí)。

⑤包埋：預(yù)先在自動(dòng)包埋機(jī)熔化高熔點(diǎn)蠟，并保持其熔化狀態(tài)，將浸蠟后的組織調(diào)整到切片需要的狀態(tài)放入包埋盒，倒入高熔點(diǎn)蠟并置于冰上或室溫等待其冷卻凝固。

⑥切片：先將展片池的水溫調(diào)節(jié)為42℃并在冰箱預(yù)冷蠟塊，修片至需要的截面后將切片厚度調(diào)節(jié)為4μm開(kāi)始切片。得到到切片放入展片池以除去皺褶，展片完成后用預(yù)先涂有APES的載玻片撈取組織，放置于60℃烘箱4小時(shí)或者37℃烘箱過(guò)夜烤干后4℃保存。

3、每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)提取三張組織切片進(jìn)行PSA、CgA、Syn和NSE特異性免疫染色：

①組織切片脫蠟及重新水化：將載玻片按次序放置于二甲苯1－二甲苯2－1/2二甲苯：乙醇－100％乙醇－95％乙醇－85％乙醇－75％乙醇中浸泡各10min。最后放置于雙蒸水中振蕩30s。

②將組織切片放入3％H₂O₂-甲醇溶液（提前預(yù)熱30min）中，37℃，30min。

③從3％H₂O₂-甲醇溶液中取出切片，PBS洗三次，每次5min。

④胃蛋白酶修復(fù)：將玻片上的溶液擦干，于組織上加上0.4%胃蛋白酶，37℃，30min。

⑤PBS洗三次，每次5min。將玻片上的溶液擦干，于組織上加上10％BSA，以蓋住組織為準(zhǔn)，放置于封閉盒中，盒中放入適量雙蒸水，37℃，1h。

⑥用微量移液器將10％BSA直接吸掉，分別加上一抗PSA、CgA、Syn和NSE，置于4℃，過(guò)夜。

⑦將組織切片從封閉盒中拿出，PBS 洗三次，每次5min。擦干，于組織上加上二抗goat-anti-mouse IgG（中衫金橋），置于封閉盒中，37℃，40min。

⑧從封閉盒中拿出玻片，PBS洗三次，每次5min。

⑨DAB顯色，蘇木素復(fù)染：擦干，于組織上加上DAB Substrate Kit溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配），室溫靜置約5min，放置于水中停止反應(yīng)。蘇木素染色40s，用流水洗去染色劑，小心不要沖掉組織。

⑩脫水、封片。結(jié)果見(jiàn)圖5。

三、透射電鏡檢測(cè)：小鼠用6%的水合氯醛麻醉，24周TRAMP小鼠和24周TRAMP;PSGL-1^-/-小鼠前列腺組織，每組小鼠各3只，然后用含2%戊二醛和1%蔗糖的0.1 摩爾濃度的二鉀砷酸鹽溶液固定3 小時(shí)。樣品再用0.1 摩爾濃度的二鉀砷酸鹽溶液清洗，然后用含有1%四氧化鋨的0.1 摩爾濃度的二鉀砷酸鹽溶液固定2 小時(shí)，所有的固定條件都是25℃和pH7.0。組織用梯度乙醇溶液脫水后，用包埋劑EPON 包埋，包埋劑EPON 需要在60℃的條件下聚合48小時(shí)。聚合完全后，使用鉆石刀頭超薄切片機(jī)將組織切成80納米的連續(xù)切片，用銅網(wǎng)收集切片。切片用醋酸雙氧鈾反透，再用1%的甲苯氨藍(lán)染色。最后樣品銅網(wǎng)用電子透射顯微鏡（Hitachi 600 TEM）拍照檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖6。

由上述檢測(cè)結(jié)果可以看出：敲除PSGL-1后的TRAMP小鼠(TRAMP;PSGL-1^-/-)飼養(yǎng)至24周齡時(shí)，前列腺腫瘤出現(xiàn)顯著的神經(jīng)內(nèi)分泌癌特性，腫瘤組織病理學(xué)表現(xiàn)為由燕麥形的小細(xì)胞組成，細(xì)胞異型性明顯，細(xì)胞小，胞漿少，核仁不明顯，幾乎不表達(dá)分泌前列腺特異性抗原（PSA），但表達(dá)神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞標(biāo)志物，如嗜鉻粒蛋白A（CgA），突觸素（Syn）和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE），且電鏡下可見(jiàn)胞漿內(nèi)含有很多神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒，這些是臨床病理診斷NEPC的依據(jù)，因此，這樣的模型可以作為研究前列腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌發(fā)病機(jī)理及篩選靶向藥物和療效評(píng)估的動(dòng)物模型。