本發(fā)明屬于大蒜脫毒技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速獲得脫毒大蒜的方法。

背景技術(shù)：

大蒜氣味辛溫，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、糖、鈣、鐵和維生素a、b、c等營養(yǎng)物質(zhì)，并具有較高的藥用價值，有“消炎、理胃、溫中、除邪痹毒氣”之功效。大蒜頭還是常用的調(diào)料，在煮瓜、菜、魚、肉時，放入幾瓣，芳香可口。

大蒜是無性繁殖植物，即依靠鱗莖進(jìn)行繁殖，在繁殖過程中病毒會通過蒜種逐年累積并代代相傳，導(dǎo)致品種種性嚴(yán)重退化，蒜頭弱小，嚴(yán)重制約了大蒜的大規(guī)模生產(chǎn)和持續(xù)健康發(fā)展。

但目前沒有對大蒜莖尖誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)、鱗莖培養(yǎng)、馴化植株等方面進(jìn)行一系列的脫毒研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，本發(fā)明提供了一種快速獲得脫毒大蒜的方法，能有效去除大蒜攜帶的病毒，并經(jīng)過脫毒后的大蒜可直接大規(guī)模栽植，成活率高，脫毒效果好。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種快速獲得脫毒大蒜的方法，包括以下步驟：

(1)莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)

選取0.1-0.2mm莖尖置于莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23-26℃，光照強(qiáng)度為1800-2200lx，每天光照10-12h條件下培養(yǎng)30-35天；其中，莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基以ms或b5培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括以下成分：ba1.5-3mg/l、kt0-0.5mg/l和naa0.01-0.1mg/l；

(2)花序軸培養(yǎng)

取剛伸出葉鞘的花苞，消毒后切取花序軸接種于花序軸培養(yǎng)基中誘導(dǎo)，培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為24-26℃，光照強(qiáng)度為2000-2200lx，每天光照10-12h條件下培養(yǎng)25-30天，得組培苗；花序軸培養(yǎng)基為b5+ba1.5-2.0mg/l+naa0.05-0.15mg/l；

(3)誘導(dǎo)試管鱗莖

將繼代培養(yǎng)獲得的組培苗繁殖系置于鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23-27℃，光照強(qiáng)度為1800-2200lx，每天光照10-12h條件下培養(yǎng)65-70天；其中，鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基以ms培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括以下成分：ba1mg/l、kt0-0.5mg/l和naa0.1-1.5mg/l；

(4)用試管鱗莖馴化植株

將試管鱗莖種植于消毒的營養(yǎng)土中，用40目尼龍網(wǎng)罩全覆蓋，后期按常規(guī)方法管理，獲得馴化植株；其中營養(yǎng)土包括以下重量份的組分：草炭3-5份、蛭石1-3份和菜園土4-5份；

(5)病毒檢測

收獲步驟(4)所得植株葉片，進(jìn)行脫毒檢測。

進(jìn)一步地，步驟(1)中莖尖通過以下方法制備得到：將蒜頭于30℃熱處理30天后，剝莖尖，制得。

進(jìn)一步地，步驟(1)中在培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為2000lx，每天光照12h條件下培養(yǎng)30天。

進(jìn)一步地，步驟(2)中花序軸培養(yǎng)基為b5+ba2.0mg/l+naa0.1mg/l。

進(jìn)一步地，步驟(3)中在培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為2000lx，每天光照12h條件下培養(yǎng)65天。

進(jìn)一步地，步驟(4)中營養(yǎng)土包括以下重量份的組分：草炭4份、蛭石2份和菜園土4份。

本發(fā)明提供的快速獲得脫毒大蒜的方法，具有以下有益效果：

(1)ms培養(yǎng)基或b5培養(yǎng)基具有維持離體植物細(xì)胞基本生命所需要的大部分營養(yǎng)成分，本發(fā)明研究大蒜每個生長階段所需的營養(yǎng)物質(zhì)及生長過程，尤其是對每個生長階段所需培養(yǎng)基成分進(jìn)行研究與驗證，篩選出簡單有效的培養(yǎng)基成分，其培養(yǎng)基配方簡單，用量少，但能有效提高大蒜出芽莖尖數(shù)和芽誘導(dǎo)率，增殖倍數(shù)，鱗莖誘導(dǎo)率以及種植于土壤后成活率。

(2)本發(fā)明從莖尖培養(yǎng)和花序軸繼代培養(yǎng)及試管鱗莖誘導(dǎo)相結(jié)合，將獲得的鱗莖種植于田地中獲得馴化植株，每個階段的生長對病毒的降低都起著關(guān)鍵性作用，經(jīng)過科學(xué)合理的處理，再經(jīng)多次驗證，最終快速獲得脫毒大蒜，其脫毒率高，成活率高，并且該大蒜可大規(guī)模種植，提供了其經(jīng)濟(jì)價值。

具體實施方式

實施例1莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)

以云頂早、二水早、彭縣早和溫江紅七星(簡稱溫江蒜)作為研究對象，將其大蒜頭經(jīng)30℃熱處理30天后，剝莖尖，分別選取0.1-0.2mm莖尖置于莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為2000lx，每天光照10-12h條件下培養(yǎng)30-35天。

云頂早莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選過程：

(1)云頂早的莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基以b5+ba2-3.5mg/l+kt0.3-0.6mg/l+naa0.05-0.15mg/l作為篩選基礎(chǔ)，其中，ba含量按0.25mg/l的濃度梯度變化，kt按0.1mg/l的濃度梯度變化，naa按0.025mg/l的濃度梯度變化，進(jìn)行正交試驗，得出多芽誘導(dǎo)率較高的培養(yǎng)基b5+ba3mg/l+kt0.5mg/l+naa0.1mg/l，標(biāo)號為g1，誘導(dǎo)率為50％。

(2)云頂早的莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基以ms+ba1.5-3.5mg/l+naa0.01-0.15mg/l作為篩選基礎(chǔ)，其中，ba含量按0.25mg/l的濃度梯度變化，naa按0.025mg/l的濃度梯度變化，進(jìn)行正交試驗，得出多芽誘導(dǎo)率較高的培養(yǎng)基ms+ba2.5mg/l+naa0.1mg/l，標(biāo)號為g12，誘導(dǎo)率為57.5％。

二水早莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選過程：

二水早的莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基以b5+ba2-3.5mg/l+kt0.3-0.6mg/l+naa0.01-0.15mg/l作為篩選基礎(chǔ)，其中，ba含量按0.25mg/l的濃度梯度變化，kt按0.1mg/l的濃度梯度變化，naa按0.025mg/l的濃度梯度變化，進(jìn)行正交試驗，得出多芽誘導(dǎo)率較高的培養(yǎng)基b5+ba3mg/l+kt0.5mg/l+naa0.1mg/l，標(biāo)號為g1，誘導(dǎo)率為42.8％和b5+ba3mg/l+kt0.1mg/l+naa0.1mg/l，標(biāo)號為g8，誘導(dǎo)率為59.4％。

溫江紅七星莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選過程：

溫江紅七星的莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基以ms+ba1.5-3.5mg/l+naa0.01-0.15mg/l作為篩選基礎(chǔ)，其中，ba含量按0.25mg/l的濃度梯度變化，naa按0.025mg/l的濃度梯度變化，進(jìn)行正交試驗，得出多芽誘導(dǎo)率較高的培養(yǎng)基ms+ba1.5mg/l+naa0.1mg/l，標(biāo)號為g14，和ms+ba2mg/l+naa0.01mg/l，標(biāo)號為g18，其誘導(dǎo)率分別為46.7％和50％。

彭縣早莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選過程：

(1)彭縣早的莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基ms+ba1-3mg/l+naa0.1-0.5mg/l作為篩選基礎(chǔ)，其中，ba含量按0.25mg/l的濃度梯度變化，naa按0.025mg/l的濃度梯度變化，進(jìn)行正交試驗，得出多芽誘導(dǎo)率較高的培養(yǎng)基ms+ba2mg/l+naa0.3mg/l，標(biāo)號為g19，其誘導(dǎo)率分別為56.0％

(2)彭縣早的莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基以ms+kt1-3mg/l+naa0.01-0.5mg/l作為篩選基礎(chǔ)，其中，kt含量按0.25mg/l的濃度梯度變化，naa按0.025mg/l的濃度梯度變化，進(jìn)行正交試驗，得出多芽誘導(dǎo)率較高的培養(yǎng)基ms+kt0.1mg/l+naa0.1mg/l，標(biāo)號為g26，誘導(dǎo)率為42.8％。

采用上述篩選出的培養(yǎng)基誘導(dǎo)莖尖，其結(jié)果見表1：

表1莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)結(jié)果

實施例2繼代培養(yǎng)

1、莖尖繼代培養(yǎng)

將實施例1獲得的莖尖培養(yǎng)物進(jìn)行繼代培養(yǎng)獲得試管苗，培養(yǎng)過程中若培養(yǎng)基成分及含量不同，莖尖培養(yǎng)物繼代可不定向地產(chǎn)生苗、根、愈傷組織，有的僅僅變綠，甚至死亡，因此繼代培養(yǎng)基成分及含量非常重要，該培養(yǎng)基以ms或b5培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括以下成分：ba、kt和naa，變化ba、kt和naa的含量，篩選出如下培養(yǎng)基，并計算其增殖倍數(shù)，具體見表2。

g2(b5+ba3.5mg/l+kt0.5mg/l+naa0.1mg/l)和g21(ms+kt1mg/l+naa0.5mg/l)適宜云頂早的繼代培養(yǎng)；g8(b5+ba3mg/l+kt0.1mg/l+naa0.1mg/l)和g3(b5+ba4mg/l+kt0.5mg/l+naa0.1mg/l)適宜二水早的繼代培養(yǎng)；g18(ms+ba2mg/l+naa0.01mg/l)適宜溫江蒜的繼代培養(yǎng)；g5(b5+ba2mg/l+kt0.5mg/l+naa0.1mg/l)適宜彭縣早的繼代培養(yǎng)。

表2莖尖繼代培養(yǎng)增殖倍數(shù)

2、花序軸培養(yǎng)

按照熊正琴等(2000年)的方法，取剛伸出葉鞘的花苞，消毒后切取花序軸接種于花序軸培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基成分及含量為b5+ba2.0mg/l+naa0.1mg/l，誘導(dǎo)幼苗，調(diào)查增殖系數(shù)。

在花序軸培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其增殖系數(shù)幅度為9～34，平均增殖系數(shù)分別為27.3、7.8和22.8，一次性平均增殖26，比莖尖培養(yǎng)增殖系數(shù)高8.7倍。

由上述可知，莖尖培養(yǎng)繼代增殖系數(shù)較低，而花序軸培養(yǎng)增殖系數(shù)較高，而將熱處理莖尖培養(yǎng)和花序軸培養(yǎng)二者結(jié)合可加快脫毒株系的繁殖。

實施例3誘導(dǎo)試管鱗莖

將繼代培養(yǎng)獲得的組培苗繁殖系置于鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為2000lx，每天光照12h條件下培養(yǎng)65天；其中，鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基以ms培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括以下成分：ba0.5-1.5mg/l、kt0-0.5mg/l和naa0.1-1.5mg/l；其中，ba含量按0.1mg/l的濃度梯度變化，kt按0.05mg/l的濃度梯度變化，naa按0.1mg/l的濃度梯度變化，進(jìn)行正交試驗，得出有利于4個品種的鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基為ms+ba1mg/l+naa1.5mg/l和ms+naa0.1mg/l+kt0.5mg/l，其誘導(dǎo)率分別為76.5％和73.9％。

將上述誘導(dǎo)的二水早、云頂早、彭縣早和溫江蒜的鱗莖于8-10月種植于消毒的營養(yǎng)土中，用40目尼龍網(wǎng)罩全覆蓋，后期按常規(guī)方法管理，如長葉時補(bǔ)充2％尿素，提供氮源，長鱗莖時補(bǔ)充2％磷酸二氫鉀，提供磷和鉀，于次年4-5月收獲，獲得脫毒原原種鱗莖，其中營養(yǎng)土包括以下重量份的組分：草炭4份、蛭石2份和菜園土4份。

計算其成活率，二水早、云頂早、彭縣早和溫江蒜的成活率分別為89％、88％、88％和89％。

實施例4病毒檢測

選取33個經(jīng)莖尖培養(yǎng)馴化成活的大蒜苗樣品，檢測oydv、lysv、gclv和slv四種病毒，檢測出10個樣品完全脫去oydv、lysv、gclv和slv四種病毒，脫毒率為30.3％，與脫毒前，slv的檢出率幾乎為100％，oydv的檢出率為41.8％，lysv的檢出率為56.5％，gclv的檢出率很低相比，可說明本發(fā)明方法脫毒效果好。

本發(fā)明將熱處理莖尖培養(yǎng)和花序軸繼代培養(yǎng)結(jié)合起來，可加快脫毒株系的繁殖，若將獲得的繼代培養(yǎng)組培苗直接栽植，其成活率較低，約為20％，而經(jīng)過誘導(dǎo)試管鱗莖后再種植，其成活率為89％。