本發(fā)明涉及2-辛基-3-異噻唑啉酮在防治煙草真菌病害中的應(yīng)用及鑒定方法，屬于真菌病害防治。

背景技術(shù)：

1、煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，然而，煙草屬于葉用經(jīng)濟(jì)作物，在其生長(zhǎng)過程中容易受各種病蟲危害，其中煙草黑脛病和赤星病危害十分嚴(yán)重。目前生產(chǎn)上對(duì)上述兩種病害的防治主要以化學(xué)農(nóng)藥防治為主，甲霜靈錳鋅、烯酰嗎啉、霜霉威、菌核凈等主用藥劑使用年限長(zhǎng)，由于藥劑品種相對(duì)單一，藥劑抗藥性問題日益突出，亟需開發(fā)新的替代藥劑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供一種從枯草芽孢桿菌和棘孢木霉共培養(yǎng)代謝物中鑒定的新型抑菌物質(zhì)2-辛基-3-異噻唑啉酮，該化合物對(duì)煙草黑脛病菌和赤星病菌具有強(qiáng)抑制活性，可用于煙草黑脛病和赤星病的綠色防控，可以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案：

3、2-辛基-3-異噻唑啉酮作為抑菌物質(zhì)的應(yīng)用。

4、2-辛基-3-異噻唑啉酮作為防治煙草黑脛病的應(yīng)用。

5、2-辛基-3-異噻唑啉酮作為防治煙草赤星病的應(yīng)用。

6、所述2-辛基-3-異噻唑啉酮的分子式為c11h19nos，結(jié)構(gòu)式如i所示：

7、

8、i

9、前述的2-辛基-3-異噻唑啉酮是，所述的2-辛基-3-異噻唑啉酮是從枯草芽孢桿菌和棘孢木霉共培養(yǎng)代謝物中鑒定所得。

10、前述的2-辛基-3-異噻唑啉酮是，從枯草芽孢桿菌和棘孢木霉共培養(yǎng)代謝物中鑒定所得步驟為：

11、(1)將棘孢木霉hg1在pda培養(yǎng)基中28℃恒溫培養(yǎng)5d，無菌水洗滌孢子，將20μl孢子懸浮液滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板中用全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)算孢子數(shù)目，無菌水調(diào)節(jié)孢子懸浮液的濃度為1×105cfu/ml，獲得棘孢木霉hg1孢子懸浮液；

12、將枯草芽孢桿菌tpb55在na培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，接種于lb培養(yǎng)基中，在28℃、180rpm下培養(yǎng)24h，將200μl菌液置于微孔板中并通過酶標(biāo)儀讀取od600值，用無菌水將菌液濃度稀釋至1×106cfu/ml，獲得tpb55菌懸液；

13、(2)將5ml棘孢木霉hg1孢子懸浮液?jiǎn)为?dú)接種于250ml?lb培養(yǎng)基中，在28℃、180rpm下發(fā)酵7d，得到單培養(yǎng)發(fā)酵液h；將500μl枯草芽孢桿菌tpb55菌懸液?jiǎn)为?dú)接種于250ml?lb培養(yǎng)基中，在28℃、180rpm下發(fā)酵6d，得到單培養(yǎng)發(fā)酵液t；將5ml棘孢木霉hg1和500μl枯草芽孢桿菌tpb55順序接種于lb肉湯中，接種時(shí)間間隔24h，在28℃、180rpm下共培養(yǎng)7d，得到共培養(yǎng)發(fā)酵液ht；

14、(3)將h、t和ht發(fā)酵液各50ml，6000rpm離心5min，pbs緩沖液洗滌，離心3次清除培養(yǎng)基，獲得菌絲提取物，液氮速凍后-80℃保存；取各樣品100mg于1.5ml微量離心管中，加入500μl濃度為80％的甲醇水溶液，渦旋振蕩后冰浴5min，在4℃，15000rpm的條件下離心20min，收集上清液用于lc-ms分析；lc-ms/ms在正離子模式和負(fù)離子模式下使用以下洗脫系統(tǒng)，正離子模式，流動(dòng)相0.1％甲酸和流動(dòng)相甲醇；負(fù)離子模式，流動(dòng)相5mm乙酸銨，ph?9.0和流動(dòng)相甲醇；柱溫設(shè)置為40℃，流速為0.2ml/min；洗脫梯度設(shè)置如下：0min，12％?b；1.5min，2％?b；12min，100％?b；14min，100％?b；14.1min，2％b；17min，2％b；

15、(4)原始數(shù)據(jù)通過compound?discoverer?3.1篩選保留時(shí)間、荷質(zhì)比等參數(shù)，然后對(duì)每一種代謝物進(jìn)行前對(duì)齊、峰提取和峰面積定量；此后將獲得的信息與mzcloud、mzvault和masslist三種數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，最終得到代謝物的鑒定與相對(duì)定量的結(jié)果；使用統(tǒng)計(jì)軟件r?version?r-3.4.3，python?2.7.6version和centos?release?6.6進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；偏最小二乘判別分析pls-da由代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理軟件metax進(jìn)行；基于單變量分析t檢驗(yàn)計(jì)算組間代謝物的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性p-value和差異倍數(shù)變化，差異代謝物的篩選標(biāo)準(zhǔn)為vip>1.0、fc>1.5或fc<0.667和p-value<0.05；

16、代謝組學(xué)分析表明，棘孢木霉hg1與枯草芽孢桿菌tpb55共培養(yǎng)能夠促進(jìn)具有抗菌活性的次級(jí)代謝物生成，次級(jí)代謝物包括2-辛基-3-異噻唑啉酮。

17、與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明通過枯草芽孢桿菌和棘孢木霉共培養(yǎng)代謝物中鑒定的新型抑菌物質(zhì)2-辛基-3-異噻唑啉酮，通過將2-辛基-3-異噻唑啉酮用于煙草盆栽試驗(yàn)，試驗(yàn)表明2-辛基-3-異噻唑啉酮對(duì)煙草黑脛病和赤星病具有優(yōu)異的防病效果，其中以100μg/ml、200μg/ml的2-辛基-3-異噻唑啉酮稀釋液灌根處理防治煙草黑脛病效果分別為92.38％和100％；100μg/ml和200μg/ml?2-辛基-3-異噻唑啉酮對(duì)煙草葉面噴霧防治赤星病的效果分別為80.80％和84.33％。

技術(shù)特征：

1.2-辛基-3-異噻唑啉酮作為抑菌物質(zhì)的應(yīng)用。

2.2-辛基-3-異噻唑啉酮作為防治煙草黑脛病的應(yīng)用。

3.2-辛基-3-異噻唑啉酮作為防治煙草赤星病的應(yīng)用。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的2-辛基-3-異噻唑啉酮的分子式為c11h19nos，結(jié)構(gòu)式如i所示：

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的2-辛基-3-異噻唑啉酮，其特征在于：所述的2-辛基-3-異噻唑啉酮是從枯草芽孢桿菌和棘孢木霉共培養(yǎng)代謝物中鑒定所得。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的2-辛基-3-異噻唑啉酮，其特征在于，從枯草芽孢桿菌和棘孢木霉共培養(yǎng)代謝物中鑒定所得步驟為：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了2?辛基?3?異噻唑啉酮在防治煙草真菌病害中的應(yīng)用及鑒定方法，特別是2?辛基?3?異噻唑啉酮作為抑菌物質(zhì)及其防治煙草黑脛病與赤星病的應(yīng)用。本發(fā)明通過枯草芽孢桿菌和棘孢木霉共培養(yǎng)代謝物中鑒定的新型抑菌物質(zhì)2?辛基?3?異噻唑啉酮，通過將2?辛基?3?異噻唑啉酮用于煙草盆栽試驗(yàn)，試驗(yàn)表明2?辛基?3?異噻唑啉酮對(duì)煙草黑脛病和赤星病具有優(yōu)異的防病效果，其中以100μg/mL、200μg/mL的2?辛基?3?異噻唑啉酮稀釋液灌根處理防治煙草黑脛病效果分別為92.38%和100%；100μg/mL和200μg/mL?2?辛基?3?異噻唑啉酮對(duì)煙草葉面噴霧防治赤星病的效果分別為80.80%和84.33%。

技術(shù)研發(fā)人員：韓小斌,蔣光華,萬軍,鄭艷芬,溫明霞,陳文敏,趙棟霖,吳慧子,張成省,彭玉龍,劉京,王小彥,謝孔華,沈智強(qiáng),祝乾湘,周鄭雄
受保護(hù)的技術(shù)使用者：貴州省煙草公司遵義市公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/5