本發(fā)明屬于生物，特別是一種干細(xì)胞外泌體高活性凍干配方。

背景技術(shù)：

1、隨著生物科技的飛速發(fā)展，干細(xì)胞研究獲得了不斷的發(fā)展，而針對(duì)干細(xì)胞的發(fā)展之下，干細(xì)胞外泌體凍干憑借其獨(dú)特的生物學(xué)特性和廣泛的應(yīng)用前景，得到進(jìn)一步的發(fā)展。

2、干細(xì)胞外泌體是細(xì)胞在特定條件下分泌的一種微小囊泡，直徑約為30-150納米。它們富含多種生物活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等，這些物質(zhì)在細(xì)胞間信息傳遞和物質(zhì)交換中發(fā)揮著重要作用。

3、為了方便干細(xì)胞外泌體的保存與運(yùn)輸，現(xiàn)有技術(shù)通過(guò)將提取得到的干細(xì)胞外泌體，經(jīng)過(guò)冷凍干燥技術(shù)制成的粉末狀產(chǎn)品，這種凍干粉保留了外泌體的完整結(jié)構(gòu)和生物活性。

4、干細(xì)胞外泌體凍干后，能夠應(yīng)用于醫(yī)療領(lǐng)域，干細(xì)胞外泌體凍干后可用于不同疾病模型的組織修復(fù)、治療等。

5、然而，現(xiàn)有技術(shù)制備的干細(xì)胞外泌體凍干配方的外泌體復(fù)蘇率相對(duì)較低，導(dǎo)致外泌體的活性大幅度下降，引發(fā)其對(duì)于組織修復(fù)、治療效果明顯下降。

6、基于此，提供一種干細(xì)胞外泌體高活性凍干配方，來(lái)解決現(xiàn)有的技術(shù)問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種干細(xì)胞外泌體高活性凍干配方及其凍干工藝，以解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、一種干細(xì)胞外泌體高活性凍干配方，按重量份計(jì)包括以下成分制成：干細(xì)胞外泌體90-100份、海藻酸鈉1-5份、絲膠蛋白混合物3-6份、甘露醇5-15份、苦蕎提取物0.3-0.6份、β-巰基乙醇0.3-0.6份。

4、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，所述絲膠蛋白混合物：苦蕎提取物：β-巰基乙醇重量份比為10:1:1。

5、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，所述苦蕎提取物制備方法為：

6、將經(jīng)過(guò)干燥后的苦蕎添加到粉碎機(jī)中，進(jìn)行粉碎處理，過(guò)80目篩，得到苦蕎粉；

7、然后，采用石油醚對(duì)苦蕎粉進(jìn)行脫脂處理，得到脫脂苦蕎粉；

8、采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80％的乙醇溶液對(duì)脫脂苦蕎粉進(jìn)行混合，然后經(jīng)過(guò)回流處理2小時(shí)，過(guò)濾，去除濾液，得到濾渣，經(jīng)過(guò)干燥至恒重，得到初步處理物；

9、將純凈水經(jīng)過(guò)等離子體處理10min，得到預(yù)處理純凈水；

10、將所得到的預(yù)處理純凈水與初步處理物進(jìn)行混合，經(jīng)過(guò)超聲分散10min，再經(jīng)過(guò)加熱回流提取4-5小時(shí)，最后進(jìn)行一次離心處理，取上清液；

11、將上清液濃縮至原體積的40％；

12、向經(jīng)過(guò)濃縮后的上清液中添加3倍體積的無(wú)水乙醇，置于4℃醇沉24小時(shí)，然后再經(jīng)過(guò)二次離心處理，收集沉淀，經(jīng)過(guò)干燥，得到。

13、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，石油醚對(duì)苦蕎粉進(jìn)行脫脂處理為：

14、將苦蕎粉與石油醚進(jìn)行混合，以500r/min轉(zhuǎn)速進(jìn)行攪拌處理2小時(shí)，靜置1小時(shí)，然后經(jīng)過(guò)旋蒸干燥，即可；

15、其中，苦蕎粉與石油醚混合比例為12-18g：150ml；

16、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80％的乙醇溶液、脫脂苦蕎粉按1:5質(zhì)量比例混合。

17、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案：所述預(yù)處理純凈水制備方法為：

18、將純凈水經(jīng)過(guò)等離子體處理；

19、其中，等離子體處理時(shí)間為30min，功率為180w；

20、等離子體處理氣體為氦氣。

21、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，所述預(yù)處理純凈水與初步處理物混合比例為1:12-15；

22、所述一次離心處理的轉(zhuǎn)速為7500r/min；

23、所述二次離心處理的轉(zhuǎn)速為6000r/min。

24、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，所述絲膠蛋白混合物制備方法為：

25、首先，采用蒸餾水將蠶繭進(jìn)行清洗10min，然后進(jìn)行干燥至恒重，其中，干燥溫度為60℃，時(shí)間為10小時(shí)；

26、將經(jīng)過(guò)清洗干燥后的蠶繭進(jìn)行剪碎，得到蠶繭碎料；

27、將蠶繭碎料添加到蒸餾水中，攪拌混合，得到混合液；

28、調(diào)節(jié)混合液ph至6.5；

29、向混合液中添加木瓜蛋白酶，進(jìn)行攪拌混合2-3小時(shí)，然后經(jīng)過(guò)滅活處理，再經(jīng)過(guò)離心處理，取上清液，經(jīng)過(guò)凍干，得到絲膠蛋白混合物。

30、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案：所述蠶繭碎料、蒸餾水混合質(zhì)量比為1:40-50；

31、所述混合液與木瓜蛋白酶混合比例為1kg：3g；

32、所述木瓜蛋白酶添加后，在55℃下進(jìn)行攪拌混合；

33、其中，滅活為在95℃下處理5min；

34、離心轉(zhuǎn)速為4500r/min。

35、一種干細(xì)胞外泌體高活性凍干配方的凍干工藝，包括以下步驟：

36、s1首先，將苦蕎提取物、絲膠蛋白混合物依次添加到無(wú)菌水中，攪拌混合均勻，得到第一混合液；

37、s2將干細(xì)胞外泌體添加到第一混合液中，然后混合均勻，置于37℃下培養(yǎng)2小時(shí)，得到培養(yǎng)液；

38、s3向培養(yǎng)液中依次添加海藻酸鈉、甘露醇、β-巰基乙醇進(jìn)行混合均勻，在37℃下培養(yǎng)30min，得到第二混合液；

39、s4對(duì)第二混合液進(jìn)行預(yù)凍處理24h；

40、s5經(jīng)過(guò)預(yù)凍處理后再進(jìn)行冷凍處理24小時(shí)，然后置于4℃下保存，即可。

41、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案：第一混合液中苦蕎提取物濃度為1mo?l/l；

42、預(yù)冷凍溫度為-80℃；

43、冷凍干燥溫度為-55℃，真空壓力為12pa。

44、有益效果：

45、本發(fā)明制備的干細(xì)胞外泌體凍干配方具有較高的活性，能夠在經(jīng)過(guò)水化后，保持較高的復(fù)蘇率，從而極大的提高了其生物穩(wěn)定性。

46、本發(fā)明主要是通過(guò)在真空條件下，將水分直接從固態(tài)升華成氣態(tài)，從而避免了冰晶形成對(duì)外泌體結(jié)構(gòu)的破壞，這種低溫低壓的環(huán)境可以有效減少外泌體的氧化和降解反應(yīng)，從而使得所獲得的干細(xì)胞外泌體凍干配方保持其生物活性。

47、本發(fā)明工藝中通過(guò)進(jìn)行預(yù)凍處理，主要是將溶液置于低溫環(huán)境下，使得其中的水分結(jié)冰形成穩(wěn)定的晶體結(jié)構(gòu)，為后續(xù)凍干做鋪墊，再在后續(xù)凍干過(guò)程中使冰晶升華，最終得到干燥的外泌體粉末。

48、本發(fā)明通過(guò)引入了絲膠蛋白混合物，有助于保持外泌體中蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能完整性，能夠在凍干過(guò)程中減少氧化和降解作用。

49、通過(guò)引入的苦蕎提取物，能夠在凍干過(guò)程中保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，對(duì)于肝細(xì)胞外泌體的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)得以保護(hù)，而這對(duì)于保證外泌體的生物活性具有極其重要的影響，凍干粉中還會(huì)殘留少量的水分以無(wú)定形狀態(tài)存在，配合β-巰基乙醇的作用，能夠在進(jìn)一步的保護(hù)細(xì)胞膜免受機(jī)械損傷。通過(guò)引入的海藻酸鈉、甘露醇配合作用，能夠進(jìn)一步的提高外泌體凍干粉的穩(wěn)定性，在低溫下長(zhǎng)時(shí)間保存而不影響其生物活性，具有較高的復(fù)蘇率。

50、本發(fā)明制備的外泌體高活性凍干配方產(chǎn)品能夠在再生醫(yī)學(xué)、疾病診斷與治療以及醫(yī)療美容等領(lǐng)域得到顯著的應(yīng)用。

技術(shù)特征：

1.一種干細(xì)胞外泌體高活性凍干配方，其特征在于，按重量份計(jì)包括以下成分制成：干細(xì)胞外泌體90-100份、海藻酸鈉1-5份、絲膠蛋白混合物3-6份、甘露醇5-15份、苦蕎提取物0.3-0.6份、β-巰基乙醇0.3-0.6份。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種干細(xì)胞外泌體高活性凍干配方，其特征在于，所述絲膠蛋白混合物：苦蕎提取物：β-巰基乙醇重量份比為10:1:1。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種干細(xì)胞外泌體高活性凍干配方，其特征在于，所述苦蕎提取物制備方法為：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種干細(xì)胞外泌體高活性凍干配方，其特征在于，石油醚對(duì)苦蕎粉進(jìn)行脫脂處理為：

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種干細(xì)胞外泌體高活性凍干配方，其特征在于：所述預(yù)處理純凈水制備方法為：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種干細(xì)胞外泌體高活性凍干配方，其特征在于，所述預(yù)處理純凈水與初步處理物混合比例為1:12-15；

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種干細(xì)胞外泌體高活性凍干配方，其特征在于，所述絲膠蛋白混合物制備方法為：

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種干細(xì)胞外泌體高活性凍干配方，其特征在于：所述蠶繭碎料、蒸餾水混合質(zhì)量比為1:40-50；

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種干細(xì)胞外泌體高活性凍干配方的凍干工藝，其特征在于：包括以下步驟：

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種干細(xì)胞外泌體高活性凍干配方的凍干工藝，其特征在于：第一混合液中苦蕎提取物濃度為1mol/l；

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種干細(xì)胞外泌體高活性凍干配方及其凍干工藝，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，包括以下成分制成：干細(xì)胞外泌體90?100份、海藻酸鈉1?5份、絲膠蛋白混合物3?6份、甘露醇5?15份、苦蕎提取物0.3?0.6份、β?巰基乙醇；本發(fā)明制備的干細(xì)胞外泌體凍干配方具有較高的活性，能夠在經(jīng)過(guò)水化后，保持較高的復(fù)蘇率，從而極大的提高了其生物穩(wěn)定性。本發(fā)明主要是通過(guò)在真空條件下，將水分直接從固態(tài)升華成氣態(tài)，從而避免了冰晶形成對(duì)外泌體結(jié)構(gòu)的破壞，這種低溫低壓的環(huán)境可以有效減少外泌體的氧化和降解反應(yīng)，從而使得所獲得的干細(xì)胞外泌體凍干配方保持其生物活性。

技術(shù)研發(fā)人員：趙蓉
受保護(hù)的技術(shù)使用者：晶能科工（北京）制藥科技集團(tuán)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10