本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)，涉及一種珠芽魔芋體細胞胚直接發(fā)生途徑形成再生植株的方法。

背景技術(shù)：

1、魔芋(amorphophallus?konjac)是亞熱帶地區(qū)常見的多年生草本植物，為天南星科、魔芋屬植物，塊莖扁球形，是半陰性植物，喜歡溫暖環(huán)境，忌高溫暴曬；喜肥忌旱、怕大風(fēng)來襲，在水質(zhì)良好和有機質(zhì)豐富的砂質(zhì)壤土中生長狀況良好。魔芋塊莖富含葡甘聚糖，具有重要的食用價值和藥用價值。隨著我國經(jīng)濟發(fā)展，市場對魔芋的產(chǎn)品需求正在擴大，產(chǎn)業(yè)前景比較廣闊，但由于優(yōu)良種質(zhì)少、種芋售價高、種植技術(shù)方法落后、缺乏基礎(chǔ)設(shè)施、農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)含量較低等原因，目前魔芋病害嚴重，品質(zhì)較差，種植效率低下，難以進入外地市場，獲得豐厚收入。至今，花魔芋在我國種植面積最大，其次是白魔芋，但多數(shù)魔芋栽培品種屬于地方群體種，品種間性狀如抗病性、豐產(chǎn)性等差異較大。傳統(tǒng)的魔芋種植方法通常是采用地下魔芋球莖側(cè)生的小魔芋球莖進行繁殖，魔芋繁殖系數(shù)低，病害發(fā)病率高，產(chǎn)量和質(zhì)量下降嚴重，對魔芋產(chǎn)業(yè)造成很大的負面影響(張東華,汪慶平.珠芽魔芋葉面球莖豐產(chǎn)技術(shù)[j].農(nóng)村新技術(shù),2020(02):8-10.)。

2、珠芽類黃魔芋(amorphophallus?bulbiferi)屬于我國野生魔芋馴化種，相較于以上其他魔芋品種，其種芋較大、含水量低、干片出粉率高、精粉部分指標皆優(yōu)于其他品種。珠芽類黃魔芋是一類葉面上能生長氣生珠芽小球莖，其珠芽小球莖可作為種植材料，也具有開花后可未經(jīng)授粉，以無性繁殖方式生長得到成熟種子，規(guī)避了傳統(tǒng)栽培品種有性繁殖能力極弱的障礙。珠芽類黃魔芋獨特的繁殖授粉方式使其在魔芋繁殖生產(chǎn)上獲得了較大優(yōu)勢。雖然珠芽類黃魔芋可以進行無性開花結(jié)籽，但并非任何多年生魔芋球莖都可自然開花繁殖，尤其在花葉同生現(xiàn)象發(fā)生的時候，隨著葉片的旺盛生長，球莖養(yǎng)分逐漸消耗，導(dǎo)致種子生長緩慢，甚至難以結(jié)實成熟，生長繁殖率降低(張東華，周凡，趙建榮，等.珠芽魔芋人工誘導(dǎo)開花無性育種方法[p].云南?。篶n200510048637.9，2008-10-01.)。因此，必須對魔芋球莖使用人工誘導(dǎo)的方法，才能獲得規(guī)?；闹仓?、繁殖用種。

3、此外，相較于其他魔芋品質(zhì)，珠芽類黃魔芋，適宜于熱帶、亞熱帶低海拔地區(qū)的半陰性經(jīng)濟作物，目前是最適應(yīng)海南地區(qū)氣候條件的栽培種植品種，具有葡甘聚糖含量高、生長周期較短、生育期較長等特點，適宜海南等低海拔地區(qū)高溫高濕的氣候環(huán)境，具備良好的產(chǎn)品種植開發(fā)與市場發(fā)展?jié)摿?，但目前在栽培中用種量較大(毛大建,王顯安.對魔芋種芋繁育及良種選育的思考[j].農(nóng)業(yè)與技術(shù),2013,33(10):123.)，采用球莖切塊的方式繁殖，不足以滿足日益增長的用種需求，且品系不純(劉好霞和張盛林.魔芋育種研究進展[j].南方農(nóng)業(yè),2007(02):37-40.)，品系間品質(zhì)差異較大(石新龍.人工調(diào)控對魔芋產(chǎn)生多葉影響的研究[d].西南大學(xué),2011.)，急切需要組織培養(yǎng)技術(shù)解決種芋需求及品系純化的問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種珠芽魔芋體細胞胚直接發(fā)生途徑形成再生植株的方法，通過誘導(dǎo)雌花序中子房等主要器官直接發(fā)生體細胞胚，進行離體組織培養(yǎng)條件的優(yōu)化，為魔芋脫毒組培苗繁育體系的建立及基因遺傳轉(zhuǎn)化奠定良好的基礎(chǔ)。

2、一種珠芽魔芋體細胞胚直接發(fā)生途徑形成再生植株的方法，包括：

3、1)選擇2～3代珠芽類黃魔芋種芋種植前未展開的10cm～15cm花芽萌芽，采集未開佛焰苞，切取嫩雌花序作為外植體；

4、2)外植體材料先用70％～75％酒精浸潤45s后，無菌水沖洗一遍，再以2.0％～2.5％次氯酸鈉浸泡消毒10min～15min；然后切成(0.4±0.1)cm×(0.4±0.1)cm大小，平鋪接種于培養(yǎng)基中，實現(xiàn)初代誘導(dǎo)、增殖和萌發(fā)再生；初代體細胞胚(具有珠芽結(jié)構(gòu))誘導(dǎo)培養(yǎng)基為ms+0.5mg/l?6-ba+1mg/l?naa+3mg/l?2,4-d+30g/l蔗糖+2.3g/l植物凝膠，珠芽體胚增殖培養(yǎng)基為ms+6-ba?3.0mg/l+naa0.5mg/l+30g/l蔗糖+2.3g/l植物凝膠；珠芽體胚植株再生培養(yǎng)基為：ms+6-ba?0.5mg/l+naa?0.1mg/l+30g/l蔗糖+2.3g/l植物凝膠。

5、優(yōu)選地，步驟1)還包括：12月份采收適應(yīng)海南地區(qū)種植的2～3年生珠芽魔芋球莖，選取大小1000g～1500g、無病蟲、無機械損傷(更優(yōu)選表皮棕色、球莖扁圓飽滿、花芽飽滿)的球莖，初步甄選出具花芽的球莖，用稻草灰涂抹后在陰涼干燥處儲藏；來年2～3月份，球莖陸續(xù)萌發(fā)頂芽至4cm時，將頂芽(花芽)萌發(fā)的球莖置于河沙上，每天噴水催芽，待花芽萌發(fā)抽生形成花莖和佛焰苞至10cm～15cm長時，采集未開佛焰苞。

6、優(yōu)選地，誘導(dǎo)體細胞胚直接發(fā)生的具體外植體器官主要為子房等。優(yōu)選地，步驟2)中，初代啟動誘導(dǎo)具有珠芽結(jié)構(gòu)的體細胞胚直接發(fā)生培養(yǎng)條件為：將材料接種后置于(25±2)℃下暗環(huán)境培養(yǎng)2周，后轉(zhuǎn)到(25±2)℃，光照1000lx～1500lx條件下培養(yǎng)，每日光照12h，培養(yǎng)10d～15d。

7、優(yōu)選地，步驟2)中，具有珠芽結(jié)構(gòu)的體細胞胚直接發(fā)生誘導(dǎo)培養(yǎng)條件為：將材料置于(27±2)℃，光照2000lx條件下進行培養(yǎng)，每天光照12h，培養(yǎng)25d～30d。

8、優(yōu)選地，步驟2)中，體胚苗再生培養(yǎng)條件為：將材料置于(27±2)℃，光照1000lx條件下培養(yǎng)，每天光照12h，培養(yǎng)20d～25d。

9、更優(yōu)選地，體胚苗再生培養(yǎng)還包括：將珠芽體胚剔成單個或切取含幾個珠芽體胚的組織塊，接種到植株再生培養(yǎng)基中。

10、優(yōu)選地，上述方法還包括：將經(jīng)體胚萌發(fā)和生根后獲得的珠芽類黃魔芋體胚苗移到自然光、室溫下放置幾天，將小苗移栽于裝有滅菌基質(zhì)的穴盤中，保持小苗生長過程中水分平衡。

11、更優(yōu)選地，所述滅菌基質(zhì)中河沙：腐殖土＝1：1。

12、本發(fā)明的有益效果在于：

13、本發(fā)明通過對珠芽類黃魔芋不同外植體部位進行初代啟動培養(yǎng)、體胚或芽的分化增殖、植株再生和移栽育苗等操作，篩選出以珠芽類黃魔芋嫩花序為外植體，芽分化和增殖效率更高，初步建立了包含外植體的消毒及篩選、體胚或芽的誘導(dǎo)分化和增殖、體胚苗植株再生和移栽種植的珠芽類黃魔芋完整離體快繁體系，其中，由嫩雌花序的子房部位細胞直接發(fā)生珠芽體細胚形成再生植株的途徑，流程更簡約，初代誘導(dǎo)時間明顯縮短，增殖率更高，具有速度更快、遺傳穩(wěn)定性更強的優(yōu)點。

14、本發(fā)明為海南熱區(qū)珠芽類黃魔芋的種質(zhì)資源離體保存、種苗快速繁育和大面積推廣以及珠芽類黃魔芋的遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)再生體系構(gòu)建提供理論依據(jù)和技術(shù)方法，對珠芽類黃魔芋生產(chǎn)過程中種芋供求問題以及病害問題的解決具有積極的作用，對助力海南熱區(qū)珠芽類黃魔芋產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

技術(shù)特征：

1.一種珠芽魔芋體細胞胚直接發(fā)生途徑形成再生植株的方法，包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)還包括：12月份采收適應(yīng)海南地區(qū)種植的2～3年生珠芽魔芋球莖，選取大小1000g～1500g、無病蟲、無機械損傷的球莖，初步甄選出具花芽的球莖，用稻草灰涂抹后在陰涼干燥處儲藏；來年2～3月份，球莖陸續(xù)萌發(fā)頂芽至4cm時，將頂芽萌發(fā)的球莖置于河沙上，每天噴水催芽，待花芽萌發(fā)抽生形成花莖和佛焰苞至10cm～15cm長時，采集未開佛焰苞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，誘導(dǎo)體細胞胚直接發(fā)生的具體外植體器官主要為子房。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中，初代啟動誘導(dǎo)具有珠芽結(jié)構(gòu)的體細胞胚直接發(fā)生培養(yǎng)條件為：將材料接種后置于(25±2)℃下暗環(huán)境培養(yǎng)2周，后轉(zhuǎn)到(25±2)℃，光照1000lx～1500lx條件下培養(yǎng)，每日光照12h，培養(yǎng)10d～15d。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中，具有珠芽結(jié)構(gòu)的體細胞胚直接發(fā)生誘導(dǎo)培養(yǎng)條件為：將材料置于(27±2)℃，光照2000lx條件下進行培養(yǎng)，每天光照12h，培養(yǎng)25d～30d。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中，體胚苗再生培養(yǎng)條件為：將材料置于(27±2)℃，光照1000lx條件下培養(yǎng)，每天光照12h，培養(yǎng)20d～25d。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，體胚苗再生培養(yǎng)還包括：將珠芽體胚剔成單個或切取含幾個珠芽體胚的組織塊，接種到植株再生培養(yǎng)基中。

8.根據(jù)權(quán)利要求1～7任意一項所述的方法，其特征在于，還包括：將經(jīng)體胚萌發(fā)和生根后獲得的珠芽類黃魔芋體胚苗移到自然光、室溫下放置幾天，將小苗移栽于裝有滅菌基質(zhì)的穴盤中，保持小苗生長過程中水分平衡。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述滅菌基質(zhì)中河沙：腐殖土＝1：1。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種珠芽魔芋體細胞胚直接發(fā)生途徑形成再生植株的方法，采集珠芽類黃魔芋的萌發(fā)未開佛苞焰，以嫩雌花序作為外植體，篩選優(yōu)化珠芽魔芋雌花序誘導(dǎo)體細胞胚直接發(fā)生、成熟和植株再生條件，初步建立了一種高效的植株再生體系。在適宜的溫度、光照和培養(yǎng)條件，體胚直接萌發(fā)成苗和移栽情況良好。本發(fā)明為海南熱區(qū)珠芽魔芋的種質(zhì)資源離體保存、種苗快速繁育大面積推廣以及珠芽魔芋的遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)再生體系構(gòu)建提供理論依據(jù)和技術(shù)方法，對助力海南熱區(qū)珠芽魔芋產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

技術(shù)研發(fā)人員：陳健妙,王凱旋,郭佳忻,羅紅麗,伍法撰,唐朝榮
受保護的技術(shù)使用者：海南大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10