本發(fā)明屬于牧草生物育種，具體涉及一種利用幼胚挽救技術(shù)獲得羊草與新麥草遠(yuǎn)緣雜交后代的方法。

背景技術(shù)：

1、羊草（ leymus?chinensis）具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，抗寒、抗旱、耐堿，耐瘠薄，耐風(fēng)沙，而且葉量多，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，適口性好，各類家禽一年四季均喜食，其根莖穿透侵占能力較強(qiáng)，能夠防風(fēng)固沙，是較為重要的禾本科牧草和生態(tài)草。羊草分布范圍廣泛，種質(zhì)資源較多。雖然目前羊草種質(zhì)資源在某些特性方面也存在一定的差異，但由于分子育種以及常規(guī)的種內(nèi)或種間育種方式存在局限性，在培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強(qiáng)的羊草新品種上較難有更好的突破。

2、遠(yuǎn)緣雜交是不同種、屬或親緣關(guān)系更遠(yuǎn)的物種之間的雜交方式。通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交獲得的后代遺傳變異較大，這樣能夠?yàn)楹Y選到草產(chǎn)量高、種子產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)更好、抗逆性更好的材料提供更多的資源，從而創(chuàng)造出新變異類型或新物種。

3、遠(yuǎn)緣雜交胚發(fā)育的過(guò)程中夭亡的機(jī)率較大，雜交結(jié)實(shí)率較低。羊草為異花授粉植物，且本身結(jié)實(shí)率就較低，再加上存在生殖隔離，通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交獲得雜交后代就更難成功。羊草與灰色賴草的雜交育種（杜建材等1998，用遠(yuǎn)緣雜交方法改良羊草結(jié)實(shí)性的研究）已有相關(guān)報(bào)道，作者去雄授粉了360個(gè)小花數(shù)，結(jié)實(shí)數(shù)為76個(gè)，但播種6粒僅有2粒出苗，最終成株1苗。羊草與灰色賴草的遠(yuǎn)緣雜交為同屬、同倍數(shù)的種間雜交，而羊草與其他屬的物種很大可能存在染色體倍性上的差異，羊草與其他屬的物種雜交，即使獲得了雜交后代也極易夭亡或不育，雜交育種工作難度更大。

4、胚挽救技術(shù)是基于組織培養(yǎng)技術(shù)將幼胚從未發(fā)育完成的種子中剝出，經(jīng)消毒后接種到培養(yǎng)基上培養(yǎng)成苗的過(guò)程，通過(guò)給予幼胚合適的激素水平、溫度、光照等生長(zhǎng)環(huán)境，提高幼胚的成活率和雜交后代的成功率，獲得更多的雜交后代。目前胚挽救技術(shù)已成功應(yīng)用在較多植物，如特早熟桃（專利授權(quán)公告號(hào)cn?105284620?b）、茉莉花（專利申請(qǐng)公布號(hào)cn112470920?a）、水稻（專利申請(qǐng)公布號(hào)cn?111264386?a）、芝麻（專利申請(qǐng)公布號(hào)cn105104185?b）、無(wú)核葡萄（專利授權(quán)公告號(hào)cn?104782474?b），而在羊草的育種中，還未見關(guān)于胚挽救技術(shù)的報(bào)道。

5、新麥草為多年生密叢型下繁禾草，具有返青早、分蘗多、耐牧、抗旱、耐鹽堿多重優(yōu)良特性，是干旱、半干旱地區(qū)一種放牧與刈割兼用型牧草。新麥草具有較豐富的種質(zhì)資源，遺傳變異較大，可以為改良羊草種子產(chǎn)量、牧草產(chǎn)量、抗病性提供較多的基因庫(kù)。通過(guò)羊草與新麥草雜交，可以將新麥草的優(yōu)異基因轉(zhuǎn)入羊草，提高羊草的種子產(chǎn)量、牧草產(chǎn)量以及抗銹病、抗蚜蟲特性，通過(guò)鑒定評(píng)價(jià)雜交后代可以篩選出具有更優(yōu)異特性的羊草種質(zhì)資源，進(jìn)而培育羊草新品種。

6、然而，羊草與新麥草屬于不同屬的物種，雜交育種難度較大，如何通過(guò)胚挽救技術(shù)，解決羊草與親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的新麥草在進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交時(shí)存在的獲得雜種f1植株較難及所用時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題，是目前亟需研究的內(nèi)容。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種利用幼胚挽救技術(shù)獲得羊草與新麥草遠(yuǎn)緣雜交后代的方法，以解決羊草與親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的新麥草在進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交時(shí)存在的獲得雜種f1植株較難及所用時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題。

2、本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種利用幼胚挽救技術(shù)獲得羊草與新麥草遠(yuǎn)緣雜交后代的方法，包括以下步驟：

3、1）雜交：

4、羊草作為母本，新麥草作為父本；在母本散粉前24?h，將穗頂部和基部小穗去掉，再將其余小穗的中間小花去掉，只留下最外面的兩朵小花，然后去雄并套袋；采集父本的花粉，將花粉用鑷子點(diǎn)在母本雌蕊柱頭上進(jìn)行授粉，并立即套袋；

5、2）消毒：

6、取授粉后的雜交穗，剝出未敗育的子房，采用體積分?jǐn)?shù)75%酒精浸泡1?min，無(wú)菌水沖洗三次，10%?v/v次氯酸鈉浸泡10min，后無(wú)菌水沖洗5次；

7、3）采用一步成苗法或誘導(dǎo)愈傷擴(kuò)繁、分化成苗法成苗；

8、所述一步成苗法包括如下步驟：剝出雜交幼胚，放置于萌發(fā)培養(yǎng)基中，放置有雜交幼胚的萌發(fā)培養(yǎng)基放置在溫度為25℃、光照16?h、黑暗8?h的培養(yǎng)箱培養(yǎng)28天，直接萌發(fā)發(fā)育成苗；所述萌發(fā)培養(yǎng)基包括4.4?g/l?ms、30?g/l蔗糖、8?g/l瓊脂及0.5?mg/l赤霉素，萌發(fā)培養(yǎng)基的ph值為5.8；

9、所述誘導(dǎo)愈傷擴(kuò)繁、分化成苗法包括如下步驟：剝出雜交幼胚，接種于誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基，放置在溫度25℃黑暗的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)28天；采用誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基，在誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)相同條件下繼代增值培養(yǎng)14?d后，轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中，置于25℃、光照16h、黑暗8h的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)28d；轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)21天；所述誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基包括4.4?g/l?ms、30?g/l蔗糖、8?g/l瓊脂、0.5?mg/l赤霉素、2?mg/l?2,4-d及1mg/l酵母提取物ye，誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基的ph值為5.8；所述分化培養(yǎng)基包括4.4?g/l?ms、30?g/l蔗糖、8?g/l瓊脂、1.0?mg/l-2.0mg/l赤霉素及0.5?mg/l-2?mg/l?6-ba，分化培養(yǎng)基的ph值為5.8；所述生根培養(yǎng)基包括2.2g/l?ms、30?g/l蔗糖、8?g/l瓊脂及1.0?mg/l?naa，生根培養(yǎng)基的ph值為5.8；

10、4）練苗移栽：組培苗生長(zhǎng)至10?cm-15?cm時(shí)，向培養(yǎng)瓶中加入超純水，室內(nèi)煉苗7d后，將植株根部培養(yǎng)基沖洗干凈，移栽到滅菌的營(yíng)養(yǎng)土中培養(yǎng)。

11、在所述步驟1）中，第一次授粉24?h后再次重復(fù)授粉。

12、在所述步驟2）中，所述雜交穗為授粉后14d-18d的雜交穗。

13、在所述步驟2）中，所述未敗育的子房為綠色、飽滿、無(wú)病蟲害的未敗育子房。

14、本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明采用親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的新麥草與羊草進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，采用幼胚挽救技術(shù)，通過(guò)雜交方法優(yōu)化，成功地在較短時(shí)間內(nèi)獲得了雜交后代植株。

技術(shù)特征：

1.一種利用幼胚挽救技術(shù)獲得羊草與新麥草遠(yuǎn)緣雜交后代的方法，其特征在于包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用幼胚挽救技術(shù)獲得羊草與新麥草遠(yuǎn)緣雜交后代方法，其特征在于：在所述步驟1）中，第一次授粉24?h后再次重復(fù)授粉。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用幼胚挽救技術(shù)獲得羊草與新麥草遠(yuǎn)緣雜交后代方法，其特征在于：在所述步驟2）中，所述雜交穗為授粉后14d-18d的雜交穗。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用幼胚挽救技術(shù)獲得羊草與新麥草遠(yuǎn)緣雜交后代方法，其特征在于：在所述步驟2）中，所述未敗育的子房為綠色、飽滿、無(wú)病蟲害的未敗育子房。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種利用幼胚挽救技術(shù)獲得羊草與新麥草遠(yuǎn)緣雜交后代的方法，包括以下步驟：1）雜交：羊草作為母本，新麥草作為父本；采集父本花粉，將花粉用鑷子點(diǎn)在母本雌蕊柱頭上進(jìn)行授粉，并立即套袋；2）消毒：取授粉后的雜交穗，剝出未敗育的子房，采用體積分?jǐn)?shù)75%酒精浸泡1min，無(wú)菌水沖洗三次，次氯酸鈉浸泡10min，后無(wú)菌水沖洗5次；3）采用一步成苗法或誘導(dǎo)愈傷擴(kuò)繁、分化成苗法成苗；4）練苗移栽：組培苗生長(zhǎng)至10cm?15cm時(shí)，向培養(yǎng)瓶中加入超純水，室內(nèi)煉苗7d后，將植株根部培養(yǎng)基沖洗干凈，移栽到滅菌營(yíng)養(yǎng)土中培養(yǎng)。本發(fā)明具有較高幼胚萌發(fā)率、誘導(dǎo)愈傷率及分化率，在較短時(shí)間內(nèi)獲得羊草與新麥草的雜交后代。

技術(shù)研發(fā)人員：楊艷婷,陳曉菲,武自念,田春育,宮文龍,馮玉梅,劉樂萌,萬(wàn)文雅
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/5