專利名稱:一種冬蟲夏草菌中國被毛孢的原生態(tài)分離法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種冬蟲夏草無性階段的真菌一中國被毛孢的原生態(tài)分離法。
技術(shù)背景
冬蟲夏草是藥食同源的稀有珍品，數(shù)百年一直與天然的人參、鹿茸相媲美，在國內(nèi)外享有盛譽(yù)。它不溫不燥，特別適合老、少、病、弱、虛者，可常年服用，具有補(bǔ)肺益腎和返老還童之功效，而無副作用。但是，由于其天然資源匱乏，價(jià)格貴過黃金，各種蟲草相繼充訴于市場，魚目混珠，真假難辨。
為了解決供求矛盾，國內(nèi)外許多科學(xué)家進(jìn)行了大量的研究。研究表明，冬蟲夏草為麥角菌科蟲草屬真菌，冬蟲夏草菌[Cordyceps Sinensis (berk. ) Sacc.]是寄生在蝙fe蛾 科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合物。簡單地說，冬蟲夏草就是由昆蟲和真菌聯(lián)合而生。而蟲草屬真菌發(fā)現(xiàn)的有幾百種，我國記錄的也有68種，因此，有一些學(xué)者把凡是由蟲草屬真菌寄生并產(chǎn)生子實(shí)體的菌物結(jié)合體通稱為蟲草。然而，近20年來，通過分子生物學(xué)和生物還原法，證明了中醫(yī)藥所論述的冬蟲夏草僅分布于青藏高原高海拔的嚴(yán)寒地區(qū)。特別是青海玉樹的冬蟲夏草，更具有代表性。它的生長過程經(jīng)歷了無性階段到有性階段。而無性階段的菌種，只有中國被毛孢與冬蟲夏草DNA指紋圖譜相似率高達(dá)96 %(李增智等，確證冬蟲夏草無性型的分子生物學(xué)證據(jù)，菌物系統(tǒng)，19 (1) 60-64,2000).現(xiàn)在，學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為中國被毛孢是冬蟲夏草菌唯一的無性型(劉錫琎等，冬蟲夏草無性階段的分離和堅(jiān)定，真菌學(xué)報(bào)，1988，8 (1)，35-40)。而在市面出現(xiàn)的“人工冬蟲夏草”尤其是所謂深層發(fā)酵生產(chǎn)的“冬蟲夏草”，幾乎都不是冬蟲夏草菌中國被毛孢。由于冬蟲夏草僵蟲體及其子座營養(yǎng)豐富，常有多種其他菌類寄生或腐生，如果分離材料選擇不當(dāng)或分離方法不正確，經(jīng)?？赡芘囵B(yǎng)生長出不同種類的真菌。尤其象中國被毛孢菌這樣在人工培養(yǎng)基上生長緩慢的菌種，很可能為生長快速的其它真菌所掩蓋。所以，要獲得純正的冬蟲夏草菌種并采用深層發(fā)酵方法生產(chǎn)冬蟲夏草是非常困難的。
雖然，自80年代沈南英先生第一個(gè)申請中國被毛孢分離法專利(專利號CN85101971A)以來，有很多關(guān)于人工培養(yǎng)冬蟲夏草和對冬蟲夏草菌絲體的液體深層發(fā)酵培養(yǎng)的報(bào)道和相關(guān)的專利出現(xiàn)，但是，迄今為止，所有的公開的中國被毛孢的分離方法都過于復(fù)雜，難度大，尤其是人工培養(yǎng)基，與天然的原生態(tài)冬蟲夏草寄主蝙蝠蛾昆蟲相比，存在較多缺陷，再加上培養(yǎng)參數(shù)模糊、染菌率高，實(shí)際上很難推廣。
一般來說，菌種分離有三種方法子囊孢子分離法、組織分離法、基內(nèi)菌絲分離法。相對來說，采取前兩種分離方法，比較容易得到純的中國被毛孢。中國被毛孢的子囊孢子分離法是利用冬蟲夏草菌成熟的子囊孢子萌發(fā)菌絲，來獲得中國被毛孢純種的一種方法。業(yè)界所采用的子囊孢子分離法比較復(fù)雜(張永杰等，分離自冬蟲夏草可培養(yǎng)真菌的多樣性研究，2010年，菌物學(xué)報(bào))，因而多采用組織分離法。中國被毛孢的組織分離法是利用新鮮冬蟲夏草的子實(shí)體的幼嫩組織，在適宜的培養(yǎng)基和生長條件下，促使它恢復(fù)到菌絲生長階段，長成沒有組織分化的菌絲體，從而獲得中國被毛孢純種的一種方法。所謂純種其實(shí)與冬蟲夏草的采集地有關(guān)，除了少數(shù)人采集的是青海玉樹的冬蟲夏草，大部分的都是四川的。從分子生物學(xué)來說，它們相差不大，相似性應(yīng)該達(dá)到96%以上。但從品質(zhì)上說，它們確實(shí)有差別。所以，種源是決定中國被毛孢菌種優(yōu)劣的重要因素。當(dāng)然，采用什么培養(yǎng)基，在什么條件下才能培養(yǎng)得到純種中國被毛孢也是很重要的。到目前為止，所公開的文獻(xiàn)包括專利，培養(yǎng)基都是人工合成的，所使用的碳源和氮源不盡一致，比例也各不相同，配制方法相對于天然培養(yǎng)基都比較復(fù)雜。在培養(yǎng)條件方面，所述參數(shù)范圍大，例如，培養(yǎng)溫度的控制，有的是5 20°C(沈南英，專利公開號CN85101971A)，有的是10°C左右(俞永信專利公開號CN1031393A，)有的是在5. 6 9. 20C (楊躍雄等，蟲草菌感染蟲草蝠蛾幼蟲的研究，1989年，動物學(xué)研究)。在控制雜菌生長的關(guān)鍵環(huán)節(jié)上，所述也比較模糊，例如，消毒環(huán)節(jié)上，沈南英石用O. 1%的氯化汞對蟲體表面消毒5分鐘，而朱佳石的實(shí)驗(yàn)則是消毒7 10分鐘(冬蟲夏草成熟過程中中國被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉DNA共存及競爭增殖力、化學(xué)成分變化，2007年，菌物研究)，尹定華則采用75%酒精對蟲體表面消毒(專利公開號CN102283022A)。然而，大量的實(shí)驗(yàn)證明，采用75%酒精表面消毒，2 3天即長出大量雜菌，根本無法汰除，使中國被毛孢菌的生長被掩蓋；即使采用濃度O. I %氯化汞對它們進(jìn)行表面消毒10分鐘，仍然有少量雜菌生長， 給后續(xù)分離工作帶來困難。這樣且不說是否能真正分離得到中國被毛孢，其菌種質(zhì)量的優(yōu)劣也可想而知。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種簡單易行、培養(yǎng)周期短、可得到青海玉樹的冬蟲夏草純菌種——中國被毛孢的原生態(tài)分離法。為此，本發(fā)明采取了如下具體技術(shù)方案
本發(fā)明包括以下步驟及條件a、種源是來自于中國青海玉樹地區(qū)的新鮮的正在成熟的冬蟲夏草，采集時(shí)要保留以子實(shí)體周圍直徑10 12cm、深8 12cm的土壤；培養(yǎng)基來源于冬蟲夏草的寄主蝙蝠蛾幼蟲的活體，選擇白潤、健壯的，4 5齡期的、活的蝙蝠蛾幼蟲，采集時(shí)及時(shí)用無菌水漂洗并儲放；所述冬蟲夏草和冬蟲夏草的寄主蝙蝠蛾幼蟲的活體在采集后的儲存溫度為O 4°C，儲存時(shí)間為O 15天；b、將種源轉(zhuǎn)接于培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)參數(shù)控制在溫度6 9°C，pH值6 6. 5，光照50 lOOlux，空氣濕度55 60%，氧氣含量20% (體積百分比)。
作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，為中國被毛孢子囊孢子分離法，還包括以下步驟及條件
a、所述種源在采集時(shí)應(yīng)及時(shí)用滅過菌的牛皮紙袋套住冬蟲夏草子實(shí)體部分，將所述種源的子實(shí)體正在彈射的子囊孢子進(jìn)行分離，即當(dāng)見到牛皮紙上附著有白色、線狀子囊孢子時(shí)，用無菌剪刀剪取表面線狀子囊孢子所在的牛皮紙片，保存于滅過菌的PE盒中備用；
b、將蝙蝠蛾幼蟲活體的整條蟲浸泡在75度酒精里3分鐘，再用無菌水換洗3次；將消毒過的蝙蝠蛾幼蟲切去頭部、外皮和黑色的腸道，再打漿，用巴馬天壽泉天然礦泉水微調(diào)pH值至6 6. 5，加入I. 8 2. 2% (wt%)的瓊脂，制成試管斜面或平板，凝固作為培養(yǎng)基；[0011]C、培養(yǎng)，用無菌接種環(huán)，挑取牛皮紙片上的白色線狀子囊孢子，轉(zhuǎn)接于所述培養(yǎng)基試管斜面或平板上，并放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 45天。
作為本發(fā)明的另一種實(shí)施方式，為中國被毛孢組織分離法，還包括以下步驟及條件
a、將所述種源的蟲體部分，首先用9 lit無菌水清洗掉其表面的膜皮，然后，用濃度O. I %氯化汞對它們進(jìn)行表面消毒10 15分鐘，然后，用無菌水清洗5 7次，保存于滅過菌的試管中；
b、將蝙蝠蛾幼蟲活體的整條蟲浸泡在75度酒精里3分鐘，再用無菌水換洗3次；將消毒過的蝙蝠蛾幼蟲切去頭部、外皮和黑色的腸道，再打漿，用巴馬天壽泉天然礦泉水微調(diào)pH值至6 6. 5，加入I. 8 2. 2% (wt%)的瓊脂，制成試管斜面或平板，凝固作為培養(yǎng)基;C、培養(yǎng)用滅過菌的鑷子從試管中取出冬蟲夏草，用無菌手術(shù)刀從蟲體頭部切離子實(shí)體，再用另一無菌手術(shù)刀將菌核(蟲體部分)切成I. 5 2. O mm薄片，轉(zhuǎn)接于培養(yǎng)基試管斜面或平板上；將所述蟲漿培養(yǎng)基平板放入培養(yǎng)箱中，設(shè)置溫度6 9°C，光照50 lOOlux，空氣濕度55 60%，氧氣含量20% (體積百分比)左右，培養(yǎng)50 55天。
本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，與其他已報(bào)道過的分離法不同，種源和培養(yǎng)基都是原生態(tài)的，即將新鮮的冬蟲夏草作為分離中國被毛孢菌種的材料來源，將冬蟲夏草的寄主蟲草蝠蛾幼蟲的新鮮蟲體作為天然培養(yǎng)基；而且培養(yǎng)條件也和玉樹的冬蟲夏草生長的原生態(tài)環(huán)境基本相同，即培養(yǎng)時(shí)參數(shù)控制在溫度6 9°C，pH值6 6. 5，光照50 IOOlux(相當(dāng)于室內(nèi)的自然光)，空氣濕度55 60%，氧氣含量20%左右。用該方法培養(yǎng)得到的中國被毛孢純母種的時(shí)間相對于其他分離法提前了一個(gè)月，而且后續(xù)純化、選育工作更簡單，更容易獲得高純度的優(yōu)良菌種。該方法簡單易行，消毒方法更簡單，在分離培養(yǎng)過程中，不需要經(jīng)常去剔除雜菌，特別是子囊孢子分離法，子囊孢子處理簡單，培養(yǎng)時(shí)間短。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步闡述
圖I為菌核培養(yǎng)第5天即前期圖；
圖2為菌核培養(yǎng)第25天即中期圖；
圖3為菌核培養(yǎng)第45天即后期圖
圖4為子囊孢子培養(yǎng)第5天即前期圖；
圖5為子囊孢子培養(yǎng)第25天即中期圖。
圖6圖子囊孢子培養(yǎng)第45天即后期圖；
具體實(shí)施方式
本發(fā)明的分離方法具體的步驟及條件如下
I、采集新鮮冬蟲夏草和冬蟲夏草的寄主蝙蝠蛾幼蟲活體
a、采集時(shí)間分別為每年的立夏以后和立冬前后；采集地分別為我國青海省玉樹地區(qū)治多縣和玉樹縣的高山牧場，海拔分別為4500米和4000米左右、坡度為20° 30°，都是在草甸中；
b、采集新鮮冬蟲夏草時(shí)，將圍繞其直徑10 12cm、深8 12cm的土壤整體一并采挖，并現(xiàn)場將采集到的新鮮冬蟲夏草要用已滅過菌的牛皮紙袋套于新鮮冬蟲夏草的子實(shí)體上，用保鮮袋包好放入有盛有冰袋的保溫箱里；
C、采集冬蟲夏草的寄主蝙蝠蛾幼蟲活體時(shí)，現(xiàn)場將采集到的活幼蟲用無菌水進(jìn)行漂洗，并置于試管里，同樣放入有盛有冰袋的保溫箱里，以便運(yùn)輸。
2、實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)前期工作
a、將采集到的采集新鮮冬蟲夏草和冬蟲夏草的寄主蝙蝠蛾幼蟲活體以最快速度帶回實(shí)驗(yàn)室，并迅速放入0-4°C的冰箱里，時(shí)間不超過15天。
b、準(zhǔn)備好接種工具及其他無菌操作的必備品，尤其是超凈工作臺、試管、平板培養(yǎng)M、多參數(shù)控制的自動培養(yǎng)箱和消毒用的酒精、氯化汞等。
C、選擇子實(shí)體短、蟲體粗壯的正在成熟的新鮮的冬蟲夏草，以保證中國被毛孢菌健壯，有活力，同時(shí)能較好地抵抗O. 1%氯化汞較長時(shí)間的消毒；選擇白潤、健壯，4 5齡期的冬蟲夏草的寄主蝙蝠蛾幼蟲活體，以保證更適合培養(yǎng)中國被毛孢菌，同時(shí)也能減少其它雜菌的干擾。
d、對成熟的新鮮的冬蟲夏草，先用無菌水洗去膜皮，其次用濃度O. 1%氯化汞對它們進(jìn)行表面消毒10 15分鐘(盡可能將表面及附近的寄生或腐生菌殺滅)，再用無菌水清洗5 7次，保存于滅過菌的試管中，作為中國被毛孢的組織分離法的種源；對套有牛皮紙袋的新鮮的冬蟲夏草見到牛皮紙上附著有白色、線狀子囊孢子，則用無菌剪刀剪取表面線狀子囊孢子較密集的牛皮紙片，保存于滅過菌的PE盒中，作為中國被毛孢的子囊孢子分離法的種源。
e、對活體蝙蝠蛾幼蟲，首先將整條蟲浸泡在75度酒精里3分鐘，其次用無菌水換洗3次，以防蟲體上的雜菌污染。再次，將消毒過的蝙蝠蛾幼蟲切去頭部、外皮和黑色的腸道，再用巴馬天壽泉天然礦泉水收集、打漿，微調(diào)pH值至6 6. 5，加入I. 8-2. 2% (重量百分比)的瓊脂，制成試管斜面或平板，待凝固即可作為分離中國被毛孢的天然培養(yǎng)基。
3、實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)工作
a、在超凈臺或百級無菌工作室里，將子囊孢子彈射盛期的子實(shí)體進(jìn)行子囊孢子分離用無菌接種環(huán)，挑取牛皮紙片上的白色線狀子囊孢子，轉(zhuǎn)接于蟲漿培養(yǎng)基試管斜面或平板上。
b、在超凈臺或百級無菌工作室里，將消毒過的新鮮冬蟲夏草進(jìn)行組織分離用滅過菌的鑷子取出試管中冬蟲夏草，用無菌手術(shù)刀從蟲體頭部切離子實(shí)體，再用另一無菌手術(shù)刀將菌核(蟲體部分)切成I. 5 2. O mm薄片(綠豆大小)，轉(zhuǎn)接于蟲漿培養(yǎng)基試管斜面或平板上，如果是平板，密度為每平板5-6片。
C、將上述試管或平板放入全自動培養(yǎng)箱中，設(shè)置溫度6 9°C (天然的中國被毛孢侵染蝙蝠蛾幼蟲開始在寄主體腔內(nèi)生長時(shí)的土溫在5. 6 9. 2°C之間，在低溫下可減少其它雜菌干擾)，光照50 IOOlux (相當(dāng)于室內(nèi)的自然光)，空氣濕度55 60%，氧氣含量20%左右，靜置培養(yǎng)若干天(組織分離法50 55天，子囊孢子分離法40 45天)，肉眼可見菌落。
用本發(fā)明分離得到的培養(yǎng)物，從形態(tài)上與沈南英所描述的基本一致，即在10 25天看見有凸起平滑的白色菌絲，30天后白色變成棕褐色，形似花朵，其周圍有棕黑色素，45天后看見有較長的白色菌絲，并呈不規(guī)則的棉花形，菌落凸起，基中呈棕褐或黑色。通過與GenBank中冬蟲夏草菌序列號從FJ654206到FJ654259的對比，其相似性達(dá)到97. 9%，確定為中國被毛孢。
下面通過實(shí)施例進(jìn)一步說明了本發(fā)明，但不限制本發(fā)明的范圍
實(shí)施例I
材料來源作為天然培養(yǎng)基的冬蟲夏草的寄主蝙蝠蛾幼蟲活體，于2011年11月5日，采自青海省玉樹地區(qū)玉樹縣國有牧場，海拔4000米的高山草甸中；作為種源的新鮮冬蟲夏草，于2012年5月31日，采自于青海省玉樹地區(qū)治多縣的藏族牧場，海拔4500米的高山草甸中。
中國被毛孢子囊孢子分離法
I、在采集新鮮冬蟲夏草的現(xiàn)場，選擇其中一條子實(shí)體短(長3cm)、蟲體粗壯(長3. 5cm、直徑6. 5mm)、可以肉眼看到子囊孕部有白色子囊孢子溢出，立刻用滅過菌的牛皮紙袋套住其子實(shí)體，并置于保溫箱；
2、采集的材料運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室，立刻放入0-4°C的冰箱，5天后在實(shí)驗(yàn)室取出該新鮮冬蟲夏草，將牛皮紙上白色、線狀子囊孢子取下，即，用無菌剪刀剪取表面線狀子囊孢子較密集的牛皮紙片，保存于滅過菌的PE盒中。
3、在實(shí)驗(yàn)室選擇5條3. 5cm的冬蟲夏草的寄主蝙蝠蛾幼蟲活體，浸泡于75°C酒精3min,用無菌水換洗3次。再將消毒過的蝙蝠蛾幼蟲切去頭部、外皮和黑色的腸道，再用巴馬天壽泉天然礦泉水收集、打漿，微調(diào)pH值6 6. 5，加入2% (重量百分比)的瓊脂，制成試管斜面，待凝固即作為分離中國被毛孢的天然培養(yǎng)基。
4、用無菌接種環(huán)，在無菌條件下，挑取線狀子囊孢子(不是蟲體組織)直接轉(zhuǎn)接于蟲漿培養(yǎng)基斜面上，全部置于8°C培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。45天可以看到直徑大約2cm的菌落，表面長滿不發(fā)達(dá)灰白色菌絲，基中呈黑色。
中國被毛孢組織分離法
I、用無菌自來水(約IO0C )和無菌刀片將一新鮮冬蟲夏草表面的膜皮(被膜，菌絲與土壤的粘結(jié)物)剝洗掉，露出乳(米)黃色至棕黃色的蟲體。
2、然后將蟲草置于一已滅過菌的200ml燒杯,用O. 1%氯化萊(重量百分比)進(jìn)行表面消毒12 min (秒表精確計(jì)時(shí))，再用滅過菌的鑷子將蟲草夾出，浸入盛有約IOOml無菌水的已滅過菌的200ml燒杯中，洗滌20秒。再用滅過菌的鑷子將蟲草夾出，浸入盛有約IOOml無菌水的已滅過菌的另一 200ml燒杯中，上述洗滌步驟重復(fù)進(jìn)行，共用無菌水約1000ml。
3、同子囊孢子分離法3，但不同的是試管換成了平板。
4、將已洗去表面氯化汞的蟲草用無菌紗布揩干水分，置于已滅過菌的培養(yǎng)皿中，用滅過菌的鑷子夾住，無菌手術(shù)刀從蟲體頭部切離子實(shí)體，再用另一無菌手術(shù)刀將蟲體切成I. 8 mm薄片，轉(zhuǎn)接于蟲漿培養(yǎng)基平板上，每塊平板4片，共三塊，全部置于9°C培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。15天可以看到有黑褐色分泌物和少量灰白色菌絲，50 55天可以看見直徑大約Icm的菌落，表面長滿不發(fā)達(dá)灰白色菌絲，基中呈棕褐或黑色。
實(shí)施例2
材料來源同實(shí)施例I[0056]中國被毛孢子囊孢子分離法
I、在采集新鮮冬蟲夏草的現(xiàn)場，選擇其中一條子實(shí)體短(長2. 5cm)、蟲體粗壯(長3. 5cm、直徑7_)、可以肉眼看到子囊孕部比較飽滿，用滅過菌的牛皮紙袋套住其子實(shí)體，并置于保溫箱；
2、采集的材料運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室，立刻放入0-4°C的冰箱，15天后在實(shí)驗(yàn)室取出該新鮮冬蟲夏草，可以看到牛皮紙上有白色絲狀物，即可將子囊孢子取下，用無菌剪刀剪取表面線狀子囊孢子較密集的牛皮紙片，保存于滅過菌的PE盒中。
3、在實(shí)驗(yàn)室選擇7條3. Ocm的冬蟲夏草的寄主蝙蝠蛾幼蟲活體，浸泡于75°C酒精3min,用無菌水換洗3次。再將消毒過的蝙蝠蛾幼蟲切去頭部、外皮和黑色的腸道，再用巴馬天壽泉天然礦泉水收集、打漿，微調(diào)pH值6 6. 5，加入2% (重量百分比)的瓊脂，制成試管斜面，待凝固即作為分離中國被毛孢的培養(yǎng)基。4、用無菌接種環(huán)，在無菌條件下，挑取線狀子囊孢子轉(zhuǎn)接于蟲漿培養(yǎng)基斜面上，共兩支，全部置于7°C培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。40天可以看到直徑大約2cm的菌落，表面長滿不發(fā)達(dá)灰白色菌絲，基中呈黑色。
中國被毛孢組織分離法
I、同實(shí)施例I。
2、然后將蟲草置于一已滅過菌的200ml燒杯,用O. 1%氯化萊(重量百分比)進(jìn)行表面消毒10 min (秒表精確計(jì)時(shí))，再用滅過菌的鑷子將蟲草夾出，浸入盛有約IOOml無菌水的已滅過菌的200ml燒杯中，洗滌20秒。再用滅過菌的鑷子將蟲草夾出，浸入盛有約IOOml無菌水的已滅過菌的另一 200ml燒杯中，上述洗滌步驟重復(fù)進(jìn)行，共用無菌水約1000ml。
3、同子囊孢子分離法3，但不同的是試管換成了平板。
4、將已洗去表面氯化汞的蟲草用無菌紗布揩干水分，置于已滅過菌的培養(yǎng)皿中，用滅過菌的鑷子夾住，無菌手術(shù)刀從蟲體頭部切離子實(shí)體，再用另一無菌手術(shù)刀將蟲體切成I. 8 _薄片，轉(zhuǎn)接于蟲漿培養(yǎng)基平板上，每塊平板4片，共二塊，全部置于8°C培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。15天可以看到有黑褐色分泌物和少量灰白色菌絲，50 55天可以看見直徑大約Icm的菌落，表面長滿不發(fā)達(dá)灰白色菌絲，基中呈棕褐或黑色。
以上實(shí)施例均米用江蘇省金壇實(shí)驗(yàn)儀器廠150B_250C數(shù)顯光照培養(yǎng)箱。該培養(yǎng)箱可以自動控制溫度、空氣、光照等參數(shù)。
權(quán)利要求
1.一種冬蟲夏草菌中國被毛孢的原生態(tài)分離法，包括以下步驟和條件 a、種源是來自于中國青海玉樹地區(qū)的新鮮的正在成熟的冬蟲夏草，采集時(shí)要保留以子實(shí)體周圍直徑10 12cm、深8 12cm的土壤；培養(yǎng)基來源于冬蟲夏草的寄主蝙蝠蛾幼蟲的活體，選擇白潤、健壯的，4 5齡期的、活的蝙蝠蛾幼蟲，采集時(shí)及時(shí)用無菌水漂洗并儲放；所述冬蟲夏草和冬蟲夏草的寄主蝙蝠蛾幼蟲的活體在采集后的儲存溫度為O 4°C，儲存時(shí)間為O 15天； b、將種源轉(zhuǎn)接于培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)參數(shù)控制在溫度6 9°C，pH值6 6.5，光照50 lOOlux，空氣濕度55 60%，氧氣含量20%。
2.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的冬蟲夏草菌中國被毛孢的原生態(tài)分離法，其特征為還包括以下步驟和條件 a、所述種源在采集時(shí)應(yīng)及時(shí)用滅過菌的牛皮紙袋套住冬蟲夏草子實(shí)體部分，將所述種源的子實(shí)體正在彈射的子囊孢子進(jìn)行分離，即當(dāng)見到牛皮紙上附著有白色、線狀子囊孢子時(shí)，用無菌剪刀剪取表面線狀子囊孢子所在的牛皮紙片，保存于滅過菌的PE盒中備用； b、將蝙蝠蛾幼蟲活體的整條蟲浸泡在75度酒精里3分鐘，再用無菌水換洗3次；將消毒過的蝙蝠蛾幼蟲切去頭部、外皮和黑色的腸道，再打漿，用巴馬天壽泉天然礦泉水微調(diào)PH值至6 6. 5，加入I. 8 2. 2% (wt%)的瓊脂，制成試管斜面或平板，凝固作為培養(yǎng)基； C、培養(yǎng)用無菌接種環(huán)，挑取牛皮紙片上的白色線狀子囊孢子，轉(zhuǎn)接于所述培養(yǎng)基試管斜面或平板上，并放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 45天。
3.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的冬蟲夏草菌中國被毛孢的原生態(tài)分離法，其特征為還包括以下步驟和條件 a、將所述種源的蟲體部分，首先用9 irC無菌水清洗掉其表面的膜皮，然后，用濃度O.I %氯化汞對它們進(jìn)行表面消毒10 15分鐘，然后，用無菌水清洗5 7次，保存于滅過菌的試管中； b、將蝙蝠蛾幼蟲活體的整條蟲浸泡在75度酒精里3分鐘，再用無菌水換洗3次；將消毒過的蝙蝠蛾幼蟲切去頭部、外皮和黑色的腸道，再打漿，用巴馬天壽泉天然礦泉水微調(diào)PH值至6 6. 5，加入I. 8 2. 2% (wt%)的瓊脂，制成試管斜面或平板，凝固作為培養(yǎng)基； C、培養(yǎng)用滅過菌的鑷子從試管中取出冬蟲夏草，用無菌手術(shù)刀從蟲體頭部切離子實(shí)體，再用另一無菌手術(shù)刀將蟲體部分切成I. 5 2. O mm薄片，轉(zhuǎn)接于培養(yǎng)基試管斜面或平板上，并放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)置溫度6 9°C，光照50 lOOlux，空氣濕度55 60%，氧氣含量20%，培養(yǎng)50 55天。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種冬蟲夏草菌中國被毛孢的原生態(tài)分離法，包括組織分離法和子囊孢子分離法。該方法選用的種源是來自于中國青海玉樹地區(qū)的新鮮的正在成熟的冬蟲夏草，采集時(shí)要保留以子實(shí)體周圍直徑10～12cm、深8～12cm的土壤；培養(yǎng)基來源于冬蟲夏草的寄主蝙蝠蛾幼蟲的活體，選擇白潤、健壯的，4～5齡期的、活的蝙蝠蛾幼蟲，采集時(shí)及時(shí)用無菌水漂洗并儲放；所述冬蟲夏草和冬蟲夏草的寄主蝙蝠蛾幼蟲的活體在采集后的儲存溫度為0～4℃，儲存時(shí)間為0～15天；將種源轉(zhuǎn)接于培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)參數(shù)控制在溫度6～9℃，pH值6～6.5，光照50～100lux，空氣濕度55～60%，氧氣含量20%。
文檔編號A01G1/04GKCN102845218SQ201210302363
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月23日
發(fā)明者馬建彬 申請人:大化金玉草生物科技有限責(zé)任公司, 馬建彬?qū)С鲆腂iBTeX, EndNote, RefMan