專利名稱:用于增加植物的油含量、生長速率和/或產量的多核苷酸、多肽和方法
用于增加植物的油含量、生長速率和/或產量的多核苷酸、 多肽和方法[0001]本發(fā)明的領域和背景[0002]本發(fā)明在其一些實施方案中涉及多肽、編碼該多肽的多核苷酸、表達該多肽的轉基因植物和產生及應用該多肽的方法，以及更具體且非排他地，涉及增加植物的油含量、產量、生長速率、生物量和/或產量的方法。[0003]營養(yǎng)或種子油是人類和動物飲食的能量及營養(yǎng)的主要來源。它們還可用于生產工業(yè)產品，諸如涂料、油墨和潤滑劑。此外，植物油代表了可用作燃料的長鏈烴的可再生來源。 由于目前使用的化石燃料是有限的資源且正在逐漸耗盡，生物質快速生長的作物可用作替代燃料或用作能量原料并且可以減少對化石能量供應的依賴。然而，增加植物油作為生物燃料消費的主要瓶頸是油價格，其仍然比化石燃料更高[超文本傳輸協(xié)議//W0rld Wide Web (點)eia(點)doe (點)gov/oiaf/analysispaper/biodiesel/ ;超文本傳輸協(xié)議// World Wide Web (點)njbiz (dot) com/weekly_article· asp aID = 19755147 (點)6122555(點)957931 (點)7393254 (點)4337383 (點)561&aID2 = 73678]。此外，植物油的生產速率受到農用地和水的可獲得性的限制。因此，增加來自相同種植面積的植物油產量能有效地克服生產空間的短缺并且能同時降低植物油的價格。[0004]目標在于增加植物的油產量的研究聚焦于鑒定與油代謝有關的基因以及能夠增加轉基因植物中的植物和種子產量的基因。[0005]已知的與增加植物油產量有關的基因包括參與脂肪酸合成或分離的那些，例如脫氫酶[例如，DELTA6、DELTA12或?；?ACP(Ssi2 ;擬南芥屬信息來源(TAIR ;超文本傳輸協(xié)議//WorId Wide Web (點)arabidopsis (點)org/)，TAIR No. AT2G43710) ]，OleosinA (TAIR No. AT3G01570)或FAD3 (TAIR No. AT2G29980)，以及各種轉錄因子和激活子諸如Lecl [TAIR No. AT1G21970, Lotan 等人，1998. Cell. 26 ;93 (7) :1195-205]、Lec2[TAIR No. AT1G28300, Santos Mendoza 等人，2005，F(xiàn)EBS Lett. 579(21) :4666-70]、Fus3 (TAIR No. AT3G26790)、 AB13 [TAIR No. AT3G24650，Lara 等人，2003. J Biol Chem. 278(23) :21003-11] 和 Wril[TAIR No. AT3G54320，Cernac 和 Benning，2004. Plant J. 40(4) :575-85]。[0006]Zabrouskov V.等人，2002 (Physiol Plant. 116 :172-185)證實了在馬鈴薯中上調內質網(wǎng)(FAD3)和質體(FAD7)脂肪酸脫飽和酶增加了轉 基因克隆中的總脂類級分。[0007]Wang HW 等人，2007 (Plant J. 52 :716-29. Epub 2007 年 9 月 18 日)發(fā)現(xiàn)了過表達 GmDof4和GmDofll轉錄因子的轉基因植物種子展示出增加的總脂肪酸和脂質含量。[0008]Vigeolas H 等人，[Plant Biotechnol J. 2007,5(3) :431-41]和美國專利申請?zhí)?20060168684公開了通過在種子特異性啟動子的控制下過表達酵母甘油_3_磷酸脫氫酶增加了油籽油(撫青甘藍)中的菜籽油含量。[0009]Katavic V，等，2000 (Biochem Soc Trans. 28 :935_7)描述了使用擬南芥 FAEl 和酵母SLCl-1來改善油菜籽中芥酸和油含量的用途。[0010]美國專利申請?zhí)?0080076179公開了分離的編碼脂質代謝蛋白(LMP)的苔蘚核酸以及表達該蛋白的具有增加的脂質水平的轉基因植物。[0011]美國專利申請?zhí)?0060206961公開了通過在植物中表達YprHOw多肽而增加植物中(例如，在植物種子中)的油含量的方法。[0012]美國專利申請?zhí)?0060174373公開了通過在植物中表達編碼三?；视?TAG)合成增強蛋白(TEP)的核酸來增加植物中油含量的方法。[0013]美國專利申請?zhí)?0070169219、20070006345、20070006346 和 20060195943 號公開了具有改善的氮利用效率的轉基因植物，其可被用于轉化為燃料或化學原料。[0014]發(fā)明概述[0015]根據(jù)本發(fā)明一些實施方案的一個方面，提供了增加植物的油含量、生長速率、生物量、產量和/或活力的方法，其包括將外源多核苷酸引入到該植物中，所述的外源多核苷酸編碼包含與選自由 SEQ ID NOs :199、166-198、200-221、229-307、311-330、351-353、 355-361、363-364、366-368、218、222-228、308-310、350、354、362、365、523-649、786-920、 1047和1048組成的組的氨基酸序列至少90%同源的氨基酸的多肽，從而增加該植物的油含量、生長速率、生物量、產量和/或活力。[0016]根據(jù)本發(fā)明一些實施方案的一個方面，提供了生產油的方法，其包括(a)根據(jù)本發(fā)明的方法提供植物，以及(2)從該植物中提取油；從而生產油。[0017]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的一個方面，提供了分離的多核苷酸，其包含與SEQ ID NOs :34、1-33、35-52、54-56、64-165、332-334、336-342、344-345、347-349、53、57-63、 143-145、331、335、343、346、369-522、650-785、1016-1046 至少 90% 同一的核酸序列。[0018]根據(jù)本發(fā)明一些實施方案的一個方面，提供了核酸構建體，其包含本發(fā)明的分離的多核苷酸和用于指導該核酸序列轉錄的啟動子。[0019]根據(jù)本發(fā)明一些實施方案的一個方面，提供了分離的多肽，其包含與SEQ ID NO :199、166-198、200-221、229-307、311-330、351-353、355-361、363-364、366-368、218、 222-228、308-310、350、354、362、365、523-649、786-920、1047 和 1048 至少 90% 同源的氨基酸序列。[0020]根據(jù)本發(fā)明一些實施方案的一個方面，提供了外源性地表達本發(fā)明的多肽的植物細胞。[0021]根據(jù)本發(fā)明一些實施方案的一個方面,提供了外源性地表達本發(fā)明的多核苷酸的植物細胞。[0022]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述多核苷酸包含選自由SEQ ID NOs :34,1-33, 35-52、54-56、64-165、332-334、336-342、344-345、347-349、53、57-63、143-145、331、335、 343,346,369-522,650-785,1016-1046 組成的組的核酸序列。[0023]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述氨基酸序列選自由SEQ ID NOs : 199、166-198、 200-221、229-307、311-330、351-353、355-361、363-364、366-368、218、222-228、308-310、 350、354、362、365、523-649、786-920、1047 和 1048 組成的組。[0024]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述多核苷酸選自由SEQ ID NOs :34、1_33、35_52、 54-56、64-165、332-334、336-342、344-345、347-349、53、57-63、143-145、331、335、343、 346、369-522、650-785、1016-1046 組成的組。[0025]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述多肽選自由SEQ ID NOs 1 99、166_198、 200-221、229-307、311-330、351-353、355-361、363-364、366-368、218、222-228、308-310、350、354、362、365、523-649、786-920、1047 和 1048 組成的組。[0026]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述油包含種子油。[0027]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述油包含營養(yǎng)部分油。[0028]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述植物細胞形成植物的一部分。[0029]除非另外定義，本文中使用的技術和/或科學術語具有與本發(fā)明所屬領域普通技術人員通常所理解的相同的含義。盡管與本文描述的那些類似或等價的方法和材料可用于實踐或測試本發(fā)明的實施方案，但以下描述了示范性的方法和/或材料。在相沖突的情況下，以本書(包括定義)為準。此外，所述材料、方法和實施例僅僅是舉例說明性的，并且不能被理解為必要的限制。[0030]
附圖簡述[0031]本文參照附圖僅以示例的方式描述了本發(fā)明的一些實施方案。在現(xiàn)在具體詳細地參考附圖的情況下，要強調的是，僅以示范性的方式且以舉例說明性地討論本發(fā)明的實施方案為目的。在這一點上，結合附圖的描述使得本領域技術人員顯而易見地可如何實施本發(fā)明的實施方案。[0032]在附圖中[0033]圖la-d是描述了葉子的長度(圖la，葉子的長度由箭頭表示)、葉片長度(圖lb， 葉片的長度由箭頭表示)、葉片面積(圖lc，葉片的面積由白色橢圓表示)和葉片的寬度 (圖ld，葉片的寬度由箭頭表示)的葉子的數(shù)字圖像。將葉片的圓度計算成葉片的寬度除以葉片的長度。[0034]圖2a_b是描述在透明瓊脂板中生長的植物根發(fā)育的圖像。讓不同的生態(tài)型在透明的瓊脂板中生長17天，并在第7天開始每2天給板拍照。在圖2a中顯示了示范性的圖像(在瓊脂板上12天以后拍得)。測量的根長度由紅色箭頭表示(圖2b)。[0035]圖3是描述從轉基因植物中分離的脂質的碘蒸汽染色的圖像，所述轉基因植物表達在以下實施例部分的實施例7的表56中所列的基因。箭頭指向了三?；视蛶А0036]本發(fā)明的具體實施方案的描述[0037]本發(fā)明在一些實施方案中涉及分離的多肽和編碼該多肽的多核苷酸，以及更具體地且非排他地涉及應用它們增加植物的油含量、生長速率、產量、生物量和/或活力的方法。[0038]在詳細說明本發(fā)明的至少一個實施方案之前，應當理解，不必在其應用中將本發(fā)明限制于以下描述中闡明的細節(jié)或通過實施例示例的細節(jié)。本發(fā)明能有其它實施方案或能夠以不同的方式實施或實現(xiàn)。[0039]在實施本發(fā)明時，本發(fā)明人鑒定了新的多肽和多核苷酸，其可用于增加植物的油含量、種子產量、生長速率、生物量、產量和/或活力。[0040]因此，如在以下的實施例部分中所示的那樣，本發(fā)明人應用了生物信息學方法，該方法比較了在79個組織或發(fā)育階段中擬南芥衍生的基因的表達模式和油鉤基因( OHG)的表達模式，已知所述油鉤基因在胚發(fā)生、種子發(fā)育和油形成及積累中起著重要作用，并且鑒定了展示出顯著相關性的基因(表1，實施例1)。此外，應用寡核苷酸微陣列，本發(fā)明人確定了所鑒定的基因在各種擬南芥生態(tài)型的組織和發(fā)育階段中的表達輪廓(表3，實施例2)，并將該表達輪廓與所選擇的產量或活力相關參數(shù)相關聯(lián)(表4、5和6,實施例2)。鑒定了在表達輪廓與生態(tài)型的產量或活力參數(shù)之間展示出顯著相關性的基因(表7，實施例2)。在這些當中，發(fā)現(xiàn)幾個基因調節(jié)種子產量(表8)、油產量(表9)、生長速率(表10)、器官形狀/大小/長度(表11)、收獲指數(shù)(表12)、每個種子的油含量(表13)、植物干物質(表 14)和每個長角果中的種子數(shù)(表15)。應用生物信息學工具鑒定了預測能增加植物的油含量、種子產量、生長速率、產量和/或生物量的其它基因(表2，實施例1)。此外，還鑒定了與表I和2中預測的多肽同源的多肽和編碼其的多核苷酸(表18，實施例5)。此外，如在以下實施例部分的實施例3、4和6中所述的那樣，表達所鑒定的多核苷酸的轉基因植物展示出增加的種子產量、油產量、干物質、收獲指數(shù)、生長速率、花結面積(rosette area)、 種子中油的百分比和1000個種子的重量(表19-55 ;實施例6)。此外，表達本發(fā)明的多核苷酸的轉基因植物展示出與對照植物相比增加的油含量(圖3，實施例7)。總之，這些結果提示了本發(fā)明的新的多核苷酸和多肽用于增加植物的油含量、產量(包括種子產量)、生長速率、生物量和/或活力的用途。[0041]應當注意，由于油含量受到每株植物/每個生長階段產油組織的內在油產量、或質量/大小的影響，依照本發(fā)明的教導，影響那些上述過程的任何基因都被考慮了。[0042]因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種增加植物的油含量、產量、生長速率、 生物量和/或活力的方法。通過將外源多核苷酸引入所述植物而實施所述方法，所述的外源多核苷酸編碼包含與選自由 SEQ IDNOs :166-221、229-307、311-330、351-353、355-361、 363-364、366-368、218、222-228、308-310、350、354、362、365、523-649、786-920、1047 和 1048組成的組的氨基酸序列至少90%同源的氨基酸序列的多肽。[0043]本文中所使用的短語“油含量”是指在給定的植物器官，即種子(種子油含量)或植物營養(yǎng)部分(營養(yǎng)的油含量)中的脂質量，并且通常表達為干重(10%的種子濕度)或濕重(對于營養(yǎng)部分)的百分比。[0044]如所提到的那樣，在一個實施方案中，可通過增加每個生長期的植物的含油組織的大小/質量來實現(xiàn)植物油含量的增加。因此,可通過增加植物的產量、生長速率、生物量和活力來實現(xiàn)植物油含量的增加。[0045]正如本文中所使用的那樣，短語“植物產量”是指每株植物或每個生長季節(jié)產生的組織的量(通過重量/大小確定)或數(shù)量(數(shù)目)(例如，種子(稱為“種子產量”)和營養(yǎng)部分)。因此，增加的產量可以影響人們在某個種植面積和/或種植時間從該植物獲得的經濟收益。[0046]正如本文中所使用的那樣，短語“植物的生物量”是指在生長季節(jié)中由植物生產的組織的量(以風干組織的克數(shù)量度)，其還可以決定或影響植物產量或每生長面積的產量。[0047]正如本文所使用的那樣，短語“植物的活力”是指在給定時間中由植物生產的組織的量(通過重量測量)。因此，增加活力可以決定或影響植物產量或每生長時間或生長面積的產量。[0048]正如本文所使用的那樣，術語“增加”是指與天然植物相比[即，沒有用本發(fā)明的生物分子(多核苷酸或多肽)修飾的植物，例如，在相同的生 長條件下生長的相同物種的未轉化植物]，植物的油含量、種子產量(每株植物的種子產量和/或每生長面積的種子產量)、植物產量、生長速率、生物量和/或活力的至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約 5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%的增加。[0049]正如本文中所使用的那樣，短語“外源多核苷酸”是指不在所述植物中天然表達的或期望在該植物中過表達的異源核酸序列?？梢砸苑€(wěn)定的或瞬時的方式將所述外源多核苷酸引入到植物中，以便產生核糖核酸(RNA)分子和/或多肽分子。應當注意，所述外源多核苷酸可能包含與該植物的內源核酸序列同一或部分同源的核酸序列。[0050]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述外源多核苷酸編碼一種多肽，所述多肽包含與選自由 SEQ ID NOs :166-221、229-307、311-330、351-353、355-361、363-364、366-368、218、 222-228、308-310、350、354、362、365、523-649、786-920、1047 和 1048 組成的組的氨基酸序列至少約60 %、至少約65%、至少約70%、至少約75 %、至少約80 %、至少約81 %、至少約 82 %、至少約83 %、至少約84%、至少約85 %、至少約86 %、至少約87 %、至少約88 %、至少約90 %、至少約91 %、至少約92 %、至少約93 %、至少約94 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97%、至少約98%、至少約99%或更多例如100%同源的氨基酸序列。[0051]可以使用任何同源性比較軟件來測定同源性(例如同源性百分比)，當從多肽序列開始時，所述同源性比較軟件包括例如國立生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information, NCBI)的 BlastP 或 TBLASTN 軟件,例如通過使用缺省參數(shù)； 或tBLASTX算法(可通過NCBI獲得)，例如通過使用缺省參數(shù)，其將核苷酸查詢序列(兩條鏈)的6讀碼框概念翻譯產物與蛋白質序列數(shù)據(jù)庫進行比較。[0052]同源序列包括直向同源序列和平行進化同源序列。術語“平行進化同源的”涉及在物種的基因組內基因重復，其導致平行進化同源基因。術語“直向同源的”涉及由于祖先關系在不同的物種中的同源基因。[0053]在單子葉植物物種中鑒定直向同源的一個選擇是通過進行互惠的blast搜索。這可通過涉及如下的第一 blast搜索完成在任何序列數(shù)據(jù)庫，例如可在超文本傳輸協(xié)議'II World Wide Web (點)ncbi (點)nlm(點)nih(點)gov中找到的公眾可利用的NCBI數(shù)據(jù)中對感興趣的序列進行blast搜索。如果尋找水稻中的直向同源序列，例如在NCBI中可得到的來自粳稻(Oryza sativa Nipponbare)的28，469個全長cDNA克隆中對感興趣的序列進行blast搜索。可過濾blast搜索的結果。然后回頭將過濾結果或未過濾結果的全長序列針對衍生感興趣的序列的生物的序列進行blast搜索(第二 blast搜索)。然后比較第一和第二 blast搜索的結果。當在第一 blast搜索中得到最高得分(最佳命中)的序列以最佳命中在第二 blast搜索中識別查詢序列(最初的感興趣的序列)時，即識別了直向同源。 應用相同的推理，找到了平行進化同源序列(相同生物中的基因同源物)。在大序列家族的情況下，可以應用ClustalW程序[超文本傳輸協(xié)議//World Wide Web (點)ebi (點) ac(點)uk/Tools/clustalw2/i ndex(dot)html],隨后使用幫助顯現(xiàn)簇的相鄰連接世系圖 (超文件傳輸協(xié)議//en(點)wikipedia (點)orG/wiki/NeiGHbor-joining)。[0054]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述外源多核苷酸編碼選自由SEQ IDNOs :166-221、 229-307、311-330、351-353、355-361、363-364、366-368、218、222-228、308-310、350、354、 362、365、523-649、786-920、1047 和 1048 組成的組的多肽。[0055]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述外源多核苷酸包含與選自由SEQID NOs :1_52、 54-56、64-165、332-334、336-342、344-345、347-349、53、57-63、143-145、331、335、343、 346、369-522、650-785、1016-1046組成的組的核酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約81%、至少約82 %、至少約83 %、至少約84%、至少約85 %、至少約86 %、至少約87 %、至少約88 %、至少約90 %、至少約91%、至少約92 %、至少約93 %、至少約94 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98 %、至少約99 %， 例如100%同一的核酸序列。[0056]可以使用任何同源性比較軟件例如通過使用缺省參數(shù)來測定同一性(例如同源性百分比)，所述同源性比較軟件包括例如國立生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information, NCBI)的 BlastN 軟件。[0057]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，外源多核苷酸例如由SEQ IDNOs :1-52、54_56、 64-165、332-334、336-342、344-345、347-349、53、57-63、143-145、331、335、343、346、 369-522,650-785,1016-1046 所示。[0058]正如本文中所使用的那樣，術語“多核苷酸”是指單或雙鏈核酸序列，其是分離的并且以RNA序列、互補的多核苷酸序列(cDNA)、基因組多核苷酸序列和/或復合的多核苷酸序列(例如，上述的組合)的形式被提供。[0059]正如本文中所使用的那樣，短語“互補的多核苷酸序列”是指使用逆轉錄酶或任何其他RNA依賴性DNA聚合酶而從信使RNA的逆轉錄中產生的序列。隨后可以使用DNA依賴性DNA聚合酶在體內或體外對此類序列進行擴增。[0060]正如本文所使用的那樣，短語“基因組多核苷酸序列”是指衍生(分離)自染色體的序列，因此它代表了染色體的毗連的部分。[0061]正如本文中所使用的那樣，短語“復合的多核苷酸序列”是指這樣的序列，其至少部分地是互補的并且至少部分地是基因組的。復合的序列可以包括編碼本發(fā)明的多肽所需的某些外顯子序列，以及插入其間的某些內含子序列。該內含子序列可以是任何來源的 (包括其他基因的)，并且典型地將包括保守的剪接信號序列。此類內含子序列可以進一步包括順式作用表達調控元件。[0062]可以就表達對編碼本發(fā)明多肽的核酸序列進行優(yōu)化。優(yōu)化的核酸序列的非限制性實例被提供在SEQ ID NOs : 1040、1041、1042、1043、1044、1045和1046中，其分別編碼包含由SEQ ID NOs :167、169、1047、181、185、189和196所示的氨基酸序列的多肽。此類序列修飾的實例包括但不限于改變的G/C含量，該改變的G/C含量更緊密地接近典型地在目的植物物種中發(fā)現(xiàn)的那種G/C含量，以及包括去除在所述植物物種中非典型地發(fā)現(xiàn)的密碼子 (通常被稱為密碼子優(yōu)化)。[0063]短語“密碼子優(yōu)化”是指選擇 合適的DNA核苷酸用于在結構基因或其片段內使用， 這接近于在目的植物內的密碼子的用途。因此，優(yōu)化的基因或核酸序列是指這樣的基因，在所述基因中天然或天然存在的基因的核苷酸序列已經被修飾，以便利用在植物中統(tǒng)計學上優(yōu)選的或統(tǒng)計學上偏好的密碼子。典型地在DNA水平上檢查核苷酸序列，并且使用任何合適的程序來確定對于在植物物種中的表達而言優(yōu)化的編碼區(qū)，例如如Sardana等人(1996， Plant Cell Reports 15 :677-681)所描述的那樣。在這種方法中,可通過下述方式來計算密碼子使用的標準偏差(密碼子使用偏倚的量度)首先找到該天然基因的每種密碼子的使用相對于高度表達的植物基因的密碼子使用的平方比例偏差，隨后計算平均方差。使用的公式為1 SD⑶=n = 1N[ (Xn-Yn)/Yn] 2/Ν，其中Xn是指在高度表達的植物基因中密碼子η的使用頻率，其中Yn是指在感興趣的基因中密碼子η的使用頻率，并且N是指在感興趣的基因中密碼子的總數(shù)。使用Murray等人(1989, Nuc Acids Res. 17 :477-498)的數(shù)據(jù)， 匯編了來自雙子葉植物的高度表達的基因的密碼子使用的表格。[0064]依照對于特定植物細胞類型的優(yōu)選的密碼子使用來優(yōu)化核酸序列的一種方法基于密碼子優(yōu)化表的直接使用，而不進行任何額外的統(tǒng)計學計算，所述密碼子優(yōu)化表例如為通過日本的 NIAS(Nationallnstitute of Agrobiological Sciences)DNA庫在密碼子使用數(shù)據(jù)庫(Codon Usage Database)中在線提供的那些(http://www. kazusa. or. jp/codon/)。 該密碼子使用數(shù)據(jù)庫包含用于許多不同物種的密碼子使用表，其中已經基于在Genbank中存在的數(shù)據(jù)通過統(tǒng)計學方法確定了每個密碼子使用表。[0065]通過使用上述表來確定在特定物種(例如，稻)中每種氨基酸的最優(yōu)選或最偏愛的密碼子，編碼感興趣的蛋白質的天然存在的核苷酸序列可以是已經針對那種特定植物物種進行了優(yōu)化的密碼子。這是通過以下方式用統(tǒng)計學上更偏愛的關于氨基酸的相應密碼子替換在特定物種基因組中可能具有低統(tǒng)計學發(fā)生率的密碼子來完成的。然而，可以選擇一種或多種較不偏好的密碼子，以刪除現(xiàn)有的限制位點，以在潛在有用的接頭(用來添加信號肽或末端盒的5’和3’末端、可以用于切割片段并將片段剪接在一起以產生正確的全長序列的內部位點)處形成新的限制位點，或消除可能負面影響mRNA穩(wěn)定性或表達的核苷酸序列。[0066]天然存在的編碼核苷酸序列可以在任何修飾前已經包含對應于在特定植物物種中的統(tǒng)計學上偏好的密碼子的許多密碼子。因此，天然核苷酸序列的密碼子優(yōu)化可以包含確定就特定植物而言在天然核苷酸序列內哪些密碼子不是統(tǒng)計學上偏好的，并且依照特定植物的密碼子使用表來修飾這些密碼子，以產生密碼子優(yōu)化的衍生物。經修飾的核苷酸序列可以就植物密碼子使用而言是全部或部分優(yōu)化的，條件是由經修飾的核苷酸序列編碼的蛋白質以比由相應的天然存在或天然的基因編碼的蛋白質更高的水平被產生。通過改變密碼子使用來構建合成基因被描述在例如PCT專利申請93/07278中。[0067]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，本發(fā)明的多核苷酸的表達導致相應的內源多肽(例如，同源物)的表達水平或活性的下調。[0068]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，將所述外源多核苷酸用于共抑制或正義抑制內源多肽。因此，將外源多核苷酸引入植物細胞導致抑制相應的內源RNA分子的翻譯的RNA分子的轉錄(沿著相對于相應的內源基因的正義方向)，例如在Jorgensen的美國專利號 5,231,020中所描述的，在此其全文被引入本文作為參考。對于共抑制，外源多核苷酸不需要相應的內源基因的全部核酸序列，也不需要所導入的序列與內源基因精確同一。然而，與反義抑制一樣，當雜交的特異性升高時，例如，當將所導入的序列加長和/或增加所導入序列和內源序列之間的序列相似性時，抑制效率得到增強。關于更詳細的細節(jié)，參見美國專利申請?zhí)?0050172364，在此其被全文引入本文作為參考。[0069]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述外源多核苷酸包含不能翻譯的核酸序列，例如，包含一個或多個多個成熟前的終止密碼子的序列，或無義突變，例如在美國專利號 5，583,021中所述的。[0070]因此，本發(fā)明包括上文描述的分離的多核苷酸、其片段、可與之雜交的序列、與其同源的序列、編碼具有不同的密碼子用途的相似多肽的序列、特征在于突變例如一個或多個核苷酸的刪除、插入或替換(天然存在的，或者隨機地或以靶向方式人工誘導的)的經改變的序列。[0071]如所述的那樣，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了以前未被表征的多肽。[0072]因此，本發(fā)明提供了這樣的多肽，其具有與選自由SEQ IDNOs :166-221、229-307、 311-330、351-353、355-361、363-364、366-368、218、222-228、308-310、350、354、362、365、 523-649、786-920、1047和1048組成的組的氨基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約 80%、至少約81 %、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87 %、至少約88 %、至少約89 %、至少約90 %、至少約91%、至少約92 %、至少約93 %、至少約93 %、至少約94 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98 %、至少約99 %， 或更多例如100%同源的氨基酸序列。[0073]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，提供了選自由SEQ ID NOs :166-221、229_307、 311-330、351-353、355-361、363-364、366-368、218、222-228、308-310、350、354、362、365、 523-649,786-920,1047和1048組成的組的外源多肽。[0074]本發(fā)明還包括上述多肽的片段以及具有突變例如一個或多個氨基酸的缺失、插入或替換(天然存在的，或者隨機地或以靶向方式人工誘導的)的多肽。[0075]如本文所使用的那樣，術語“植物”包含整株植物、植物的祖先和后代以及植物的部分，包括種子、枝條、莖、根(包括塊莖)，以及植物的細胞、組織和器官?！爸参铩笨梢猿嗜魏涡问?，包括懸浮培養(yǎng)物、胚、分生組織區(qū)域、愈傷組織、葉、配子體、孢子體、花粉和小孢子。 在本發(fā)明的方法中特別有用的植物包括屬于綠色植物(Viridiplantae)總科的所有植物，特別是單子葉植物和雙子葉植物，包括選自包括下列的列表的飼料或草料用豆科植物、 觀賞植物、食物農作物、樹或灌木金合歡屬物種(Acacia spp.)、槭樹屬物種(Acer spp.)、 稱猴桃屬物種(Actinidia spp.)、七葉樹屬物種(Aesculus spp.)、新西蘭貝殼杉(Agathis australis)、苦味合歡(Albizia amara)、三色極稷(Alsophila tricolor)、須芒草屬物種(Andropogon spp·)、落花生屬物種(Arachis spp·)、模榔(Areca catechu)、Astelia fragrans、鷹嘴紫云英(Astragalus cicer)、多小葉紅蘇木(Baikiaeapluri juga)、樣屬物種(Betula spp.)、蕓苔屬物種(Brassica spp.)、木攬(Bruguiera gymnorrhiza)、 紅紫丁香(Burkea africana)、紫鉚(Butea frondosa)、Cadab a farinosa、朱纟嬰花屬物種(Calliandra spp)、茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒屬物種 (Capsicum spp·)、決明屬物種(Cassia spp·)、距瓣豆(Centroema pubescens)、木瓜屬物種(Chaenomeles spp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffea arabica)、 Colophospermum mopane、繡球小冠花(Coronillia varia)、Cotoneaster serotina、 山楂屬物種(Crataegus spp·)、甜瓜屬物種(Cucumis spp·)、柏木屬物種(Cupressus spp.)、銀厳(Cyathea dealbata)、媼梓(Cydonia oblonga)、日本柳杉(Cryptomeria Japonica)、香茅屬物種(Cymbopogon spp. )、Cynthea dealbata、媼梓(Cydonia oblonga)、 貨貝黃擅(Dalbergia monetaria)、大葉骨碎補(Davalila divaricata)、山螞幢屬物種 (Desmodium spp.)、粗糖蟲豐殼厳(Dicksonia squarosa)、Diheteropogon amplectens、迪奧豆屬物種(Dioclea spp)、鐮扁豆屬物種(Dolichos spp. )、Dorycnium rectum、錐形稗 (Echinochloa pyramidalis) > Ehraffia spp.、移子(Eleusine coracana)、畫眉草屬物種 (Eragrestis spp.)、刺桐屬物種(Erythrina spp.)、按屬物種(Eucalyptus spp)、Euclea schimpen、絨毛狀金茅(Eulalia villosa)、蕎麥屬物種(Fagopyrum spp.)、費約果(Feijoasellowiana)、草莓屬物種(Fragaria spp.)、千斤拔屬(Flemingia spp.)、河岸藤露覽樹 (Freycinetia banksli)、東亞老鶴草(Geraniu mthunbergi)、銀杏(Ginkgo biloba)、野大豆(Glycine javanica)、墨西哥丁香屬物種(Gliricidia spp.)、陸地棉(Gossypium hirsutum)、銀禪屬物種(Grevillea spp.)、鞘桿古夷布提木(Guibourtia coleosperma)、 巖黃甚屬物種(Hedysarum spp·)、牛鞭草(Hemarthia altissima)、黃茅(Heteropogon contortus)、大麥(Hordeum vulgare)、紅荀茅(Hyparrhenia rufa)、小連翅(Hypericum erectum)、Hypeffhelia dissoluta、異花木藍(Indigo incarnata)、鸞尾屬物種(Iris spp.) λLeptarrhena pyrolifolia、胡枝子屬物種(Lespediza spp.)、萬苣屬物種(Lettuca spp·)、銀合歡(Leucaena leucocephala)、Loudetia simplex、Lotonus baines1、百脈根屬物種(Lotus spp. )、Macrotyloma axif iare、蘋果屬物種(Malus spp·)、木薯(Manihot esculenta)、紫苜猜(Medicago sativa)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、香蕉 (Musa sapientum)、煙草屬物種(Nicotianum spp·)、驢食豆屬物種(Onobtychis spp·)、 鳥足豆屬物種(Ornithopus spp·)、稻屬物種(Oryza spp·)、非洲雙翼豆(Peltophorum africanum)、狼尾草屬物種(Pennisetum spp·)、酪梨(Perseagratissima)、碧冬煎屬物種(Petunia spp·)、菜豆屬物種(Phaseolus spp·)、模榔竹(Phoenix canariensis)、 新西蘭劍麻(Phormium cookianum)、石楠屬物種(Photinia spp.)、白云杉(Picea glauca)、松屬物種(Pinus spp·)、豌豆(Pisum sativum)、新西蘭羅漢松(Podocarpus totara)、Pogonarthria f Iecki Λ Pogonarthria squarrosa、楊屬物種(Populus spp.)、 瓜葉牧豆(Prosopiscineraria)、花旗松(Pseudotsuga menziesi)、星狀老虎剌 (Pterolobiumstellatum)、西洋梨(Pyrus communis)、櫟屬物種(Quercus spp.)、厚葉石斑木(Rhaphiolepsis umbel lata)、美味棒花掠(Rhopalostylis sapida)、納塔爾漆樹(Rhus natalensis)、歐洲醋栗(Ribes grossularia)、荼薦子屬物種(Ribes spp.)、剌槐(Robinia pseudoacacia)、薔薇屬物種(Rosa spp·)、懸鉤子屬物種(Rubus spp·)、柳屬物種(Salix spp.)、紅裂稃草(Schyzachyrium sanguineurn)、金松(Sciadopitys veffticillata)、北美紅杉(Sequoia sempervirens)、 巨杉(Sequoiadendron giganteum)、兩色高梁(Sorghum bicolor)、菠菜屬物種(Spinacia spp.)、流蘇狀鼠尾粟(Sporobolus fimbriatus)、 Stiburus alopecuroides、矮柱花草(Stylosanthos humilis)、葫蘆荼屬物種(Tadehagi spp)、落羽杉(Taxodium distichum)、阿拉伯黃背草(Themeda triandra)、三葉草屬物種 (Trifollum spp·)、小麥屬物種(Triticum spp·)、異葉鐵杉(Tsuga heterophylla)、越桔屬物種(Vaccinium spp.)、蠶豆屬物種(Vicia spp.)、葡萄(Vitis vinifera)、錐穗沃森花 (Watsonia pyramidata)、馬蹄蓮(Zantedeschia aethiopica)、玉蜀黍(Zea mays)、覓屬植物、洋薊、天門冬、球花甘藍、抱子甘藍、卷心菜、油菜(canola)、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、散葉甘藍(collard greens)、亞麻、羽衣甘藍、兵豆、油籽油菜(oilseed rape)、秋葵、洋蔥、馬鈴薯、稻、大豆、稻草、甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜、苞谷、大麥、燕麥、、花生、豌豆、小扁豆和紫花苜蓿、棉花、油菜籽、芥籽、胡椒、向日葵、煙草、茄子、桉樹、樹、觀賞植物、多年生草和飼料作物。備選地，藻類及其他非綠色植物可用于本發(fā)明的方法中。[0076]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，產油植物可以是含油種子作物、大豆、向日葵、蕪菁甘藍、芥菜、玉蜀黍、棉花、橄欖(Olea euiOpaea)、亞麻、黑芥菜、麻風樹以及蓖麻。[0077]可以通過下述方式實現(xiàn)將本發(fā)明的外源多核苷酸引入植物用外源多核苷酸轉化植物的一個或多個細胞，隨后從轉化的細胞中產生成熟植物，并且在適合于在成熟植物內表達外源多核苷酸的條件下培養(yǎng)成熟植物。[0078]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，通過將核酸構建體引入植物細胞中來實現(xiàn)所述的轉化，所述核酸構建體包含本發(fā)明一些實施方案的外源多核苷酸和至少一種能夠指導外源多核苷酸在植物細胞中轉錄的啟動子。在下文中提供了合適的轉化方法的更多細節(jié)。[0079]如本文中所使用的，術語“啟動子”是指位于基因的轉錄起始位點上游的DNA區(qū)域，RNA聚合酶與所述DNA區(qū)域結合以啟動RNA的轉錄。啟動子控制基因在何處(例如，植物的哪個部分)和/或何時(例如，在生物體的生存期中的哪個階段或狀況)被表達。[0080]本發(fā)明的核酸構建體可以使用任何合適的啟動子序列。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述啟動子是組成型啟動子、組織特異性的、或發(fā)育或胚特異性的啟動子。[0081]合適的組成型啟動子包括，例如，CaMV 35S啟動子(SEQ ID NO :921 ;0dell等人，Nature 313 :810_812，1985);在 6669 處的擬南芥啟動子(SEQID NO :1015 ;參見 PCT 公開號 W02004/104162);玉米 Ubi I (Christensen 等人，Plant Sol. Biol. 18 :675-689, 1992);稻肌動蛋白(McElroy等人，Plant Cell 2 :163-171,1990) ;pEMU(Last等人，Theor. Appl. Genet. 81 :581-588,1991) ；CaMV 19S(Nilsson 等人，Physiol. PlantlOO :456-462, 1997) ；G0S2 (de Pater 等人，Plant J Nov ；2(6) :837-44,1992);稻親環(huán)蛋白(Bucholz 等人，Plant Mol Biol. 25 (5) :837-43,1994);玉米 H3 組蛋白(Lepetit 等人，Mol. Gen. Genet. 231 :276-285,1992);肌動蛋白 2 (An 等人，Plant J. 10(1) ;107_121，1996)和合成的超MAS (Ni等人，ThePlant Journal 7:661-76,1995)。其它的組成型啟動子包括在美國專利號 5，659，026,5, 608，149,5. 608，144,5, 604，121,5. 569，597,5. 466，785,5, 399，680、 5，268，463和5，608，142中描述的那些。[0082]合適的組織特異性的啟動子包括但不限于，種子優(yōu)選的啟動子，[例如，來自種子特異性的基因(Simon,等人，Plant Mol. Biol. 5. 191,1985 ；Scofield,等人，J. Biol. Chem. 262 :12202,1987 ；Baszczynski,等人，Plant Mol. Biol. 14 633,1990)、巴西果白蛋白(Pearson,等人，Plant Mol. Biol. 18 :235_245,1"2)、豆球蛋白(Ellis,等人， Plant Mol. Biol. 10 :203-214,1988)、谷蛋白(稻)(Takaiwa,等人，Mol. Gen. Genet. 208 15-22，1986 ；Takaiwa,等人，F(xiàn)EBS Letts. 221 :43-47,1987)、玉米蛋白(Matzke 等人， Plant Mol Biol，143 :323-32 1990)、napA (Stalberg，等人，Plantal99 :515_519，1996)、 小麥 SPA(Albanietal, Plant Cell, 9 171-184,1997)、向日葵油質蛋白(Cummins,等人， Plant Mol. Biol. 19 :873-876,1992)];葉特異性啟動子[諸如描述于，例如，Yamamoto等人，Plant J. 12 :255-265,1997 ；Kwon 等人，Plant Physiol.1 05 :357-67,1994 ；Yamamoto 等人，PlantCell Physiol. 35 :773-778,1994 ；Gotor 等人，Plant J. 3 :509-18,1993 ； Orozco 等人，Plant Mol. Biol. 23 :1129-1138,1993 ；以及 Matsuoka 等人，Proc. Natl. Acad. Sc1.USA 90 :9586_9590，1993]，胚乳特異性啟動子[例如，小麥LMW和HMW、麥谷蛋白-1 (Mol Gen Genet 216 :81-90,1989 ；NAR 17 :461-2)、小麥 a、b 和 g 麥醇溶蛋白 (EMB03 =1409-15,1984)、大麥 Itrl 啟動子、大麥 B1、C、D 大麥醇溶蛋白(Theor Appl Gen 98 :1253-62，1999 ;Plant J 4:343-55,1993 ；Mol Gen Genet 250 :750_60，1996)、大麥 DOF(Mena 等人，The Plant Journal, 116(1) :53_62，1998)、Biz2 (EP99106056. 7)、合成啟動子(Vicente-Carbajosa 等人，Plant J. 13 :629_640，1998)、稻醇溶谷蛋白 NRP33、稻-球蛋白 Glb-1 (Wu 等人 Plant CellPhysiology 39 (8) 885-889,1998)、稻 α-球蛋白 REB/OHP-1 (Nakase 等人，Plant Mol. Biol. 33 :513_S22，1997)、稻 ADP-葡萄糖 PP (Trans Res6 :157-68,1997)、玉米 ESR 基因家族(Plant J 12 :235_46，1997)、高粱 Y -高粱醇溶蛋白(PMB 32 :1029-35,1996)]，胚特異性啟動子[例如，稻 OSHl (Sato 等人，Proc. Nat1. Acad. Sc1. USA, 93 :8117-8122) ,KNOX (Postma-Haarsma等人，Plant Mol. Biol. 39 :257-71, 1999)、稻油質蛋白(Wu等人，J. Biochem. , 123 :386,1998)]以及花特異性啟動子[例如， AtPRP4、chalene 合成酶(chsA) (Van der Meer,等人，Plant Mol. Biol. 15,95-109,1990)、 LAT52(Twell 等人，Mol. Gen Genet. 217 :240-245 ;1989)、apetala-3]。[0083]本發(fā)明的一些實施方案的核酸構建體可以進一步包含合適的選擇標記和/或復制起點。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所使用的核酸構建體是穿梭載體，其可以在大腸桿菌 (其中構建體包含合適的選擇標記和復制起點)中繁殖并且與細胞中的繁殖相容。根據(jù)本發(fā)明的構建體可以是例如質粒、桿粒、噬菌粒、粘粒、噬菌體、病毒或人工染色體。[0084]本發(fā)明的一些實施方案的核酸構建體可以用于穩(wěn)定地或瞬時地轉化植物細胞。在穩(wěn)定的轉化中，本發(fā)明的外源多核苷酸被整合到植物基因組中，如此它代表了穩(wěn)定的和遺傳的性狀。在瞬時的轉化中，外源多核苷酸被轉化的細胞表達，但它不被整合到基因組中， 如此它代表了瞬時性狀。[0085]存在將外源基因引入單子葉植物和雙子葉植物中的各種方法(Potrykus，1.， Annu. Rev. Plant. Physiol. , Plant. Mol. Biol. (1991)42 :205-225 ；Shimamoto 等人， Nature(1989)338 :274-276)。[0086]引起外源DNA穩(wěn)定整合到植物基因組DNA中的原則方法包括2種主要方法[0087](i) 土壤桿菌(Agrobacterium)介導的基因轉移Klee 等人(1987)Annu. Rev. Plant Physiol. 38 :467-486 ;Klee和Rogers I,Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants,第6卷,Molecular Biology of Plant Nuclear Genes,由 Schell, J.和 Vasil, L. K.編輯，Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989)第 2-25 頁；Gatenby, in Plant Biotechnology,由 Kung, S. ^PArntzen, C. J.編輯，Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989)第 93-112 頁。[0088](ii)直接的 DNA 攝取Paszkowski 等人，Cell Culture andSomatic Cell Genetics of Plants,第 6 卷，Molecular Biology ofPlant Nuclear Genes,由 Schell, J.和 Vasil, L. K.編輯；Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989)第 52-68 頁；包括用于將DNA直接攝取到原生質體中的方法，Toriyama, K.等人(1988)Bio/Technology6:1072-1074。由植物細胞的短暫電休克誘導的DNA攝取Zhang等人，Plant Cell Rep. (1988) 7 :379-384, Fromm 等人 Nature (1986) 319 :791_793。通過粒子轟擊將 DNA 注射至Ij 植物細胞或組織內，Klein 等人，Bio/Technology(1988)6 :559-563 ;McCabe 等人,Bio/ Technology (1988) 6 :923-926 ；Sanford, Physiol. Plant. (1990)79 :206-209 ;通過使用微量移液管(micropipette)系統(tǒng)Neuhaus 等人，Theor. Appl. Genet. (1987)75 :30-36 ； Neuhaus 和 Spangenberg, Physiol. Plant. (1990)79 :213-217 ;細胞培養(yǎng)物、胚或愈傷組織的玻璃纖維或碳化硅須晶轉化，美國專利號5，464，765 ;或通過直接使DNA與正在萌發(fā)的花粉一起溫育，DeWet 等人 Experimental Manipulation of Ovule Tissue,編輯 Chapman, G. P.,以及 Mantel I, S. H.和 Daniels, ff. Longman, London, (1985)第 197—209 頁；和 Ohta,Proc.Natl. Acad. Sc1. USA(1986)83 :715_719。[0089]土壤桿菌系統(tǒng)包括使用包含確定的DNA區(qū)段的質粒載體，所述確定的DNA區(qū)段被整合到植物基因組DNA中。植物組織的接種方法依植物物種和土壤桿菌遞送系統(tǒng)而變化。廣泛使用的方法是葉盤操作程序，其可以用任何為啟動全植物分化而提供良好來源的組織外植體來進行。Horsch 等人，Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer AcademicPubIishers, Dordrecht (1988)第1_9頁。補充的方法采用與真空滲入相組合的土壤桿菌遞送系統(tǒng)。土壤桿菌系統(tǒng)在轉基因雙子葉植物的創(chuàng)造中是特別有生命力的。[0090]存在直接將DNA轉移到植物細胞中的各種方法。在電穿孔中，使原生質體短暫地暴露于強電場。在顯微注射中，使用非常小的微量移液管直接將DNA機械地注射到細胞內。 在微粒轟擊中，將DNA吸附在微粒例如硫酸鎂晶體或鎢顆粒上，并對微粒進行物理加速從而使其進入細胞或植物組織中。[0091]在穩(wěn)定轉化之后，進行植物繁殖。最常見的植物繁殖方法是通過種子。然而，通過種子繁殖進行的再生具有這樣的缺點由于雜合性而在農作物中缺乏一致性，因為種子是根據(jù)由孟德爾定律控制的遺傳方差(genetic variances)由植物生產的?；旧?每個種子在遺傳學上都是不同的，并且每個種子將生長而具有其自身特異的性狀。因此，優(yōu)選的是， 如此生產轉化的植物，使得再生的植物具有與親本轉基因植物相同的性狀和特征。因此，優(yōu)選的是，轉化的植物是通過微繁殖法(micropropagation)進行再生的,所述微繁殖提供了轉化的植物的快速且一致的繁殖。[0092]微繁殖法是從單個組織塊生長出新一代植物的方法，所述單個組織塊已被從所選親本植物或栽培品種上切下。這種方法允許大量繁殖具有優(yōu)選的表達融合蛋白的組織的植物。所產生的新一代植物在遺傳學上等同于原始植物，并且具有原始植物的所有特征。微繁殖法允許在短時間段中大量產生有品質的植物材料，并且在保留原始轉基因或轉化植物的特征中提供所選栽培品種的快速增殖。克隆植物的優(yōu)點是植物增殖的速度以及所產生的植物的品質和一致性。[0093]微繁殖法是需要在階段之間改變培養(yǎng)基或生長條件的多階段操作程序。因此，微繁殖方法涉及4個基本階段階段1，最初的組織培養(yǎng)；階段2，組織培養(yǎng)物的增殖；階段3， 分化和植物形成；以及階段4，溫室培養(yǎng)和鍛煉(hardening)。在階段I (最初的組織培養(yǎng)) 期間，建立組織培養(yǎng)物并證實不含污染物。在階段2期間，增殖最初的組織培養(yǎng)物，直至產生足夠數(shù)目的組織樣品以滿足生產目 標。在階段3期間，將在階段2中生長的組織樣品分開并生長為個體小植株。在階段4時，將轉化的小植株轉移到溫室以進行鍛煉，在溫室中逐漸增加植物對光的耐受性，使得它可以在自然環(huán)境中生長。[0094]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，通過葉細胞、分生組織細胞或全植物的瞬時轉化來產生轉基因植物。[0095]瞬時轉化可以通過上述的直接DNA轉移方法中的任何一種或者通過使用經修飾的植物病毒進行的病毒感染來實現(xiàn)。[0096]已顯示對于轉化植物宿主有用的病毒包括CaMV、TMV和BV。使用植物病毒進行的植物轉化被描述在下述文獻中美國專利號4，855，237 (BGV)、EP-A 67，553 (TMV)、 日本公開申請?zhí)?63-14693 (TMV)、EPA 194，809 (BV)、EPA 278，667 (BV)，和 Gluzman， Y.等人，Communications in Molecular Biology Viral Vectors, Cold SpringHarborLaboratory, New York,第172-189頁(1988)。用于在許多宿主(包括植物)中表達外源 DNA的假病毒顆粒被描述在W087/06261中。[0097]根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，用于瞬時轉化的病毒是無毒性的，因此不能引起嚴重的癥狀例如減少的生長速率、花葉病、環(huán)斑病、卷葉病、黃化、條斑病、痘形成、瘤形成和紋孔病。合適的無毒性的病毒可以是天然存在的無毒性的病毒或人工減毒的病毒。病毒減毒可以通過使用本領域眾所周知的方法來實現(xiàn)，這些方法包括但不限于，亞致死性加熱、化學處理或通過定向誘變技術，例如由Kurihara和Watanabe (Molecular Plant Pathology 4: 259-269,2003)，Gal-on 等人(1992)，Atreya 等人(1992)和 Huet 等人(1994)所描述的。[0098]合適的病毒毒株可以從可獲得的來源例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，或者通過從受感染的植物中分離而獲得。從受感染的植物組織中分離病毒可以通過本領域中眾所周知的技術來實現(xiàn)，例如由Foster和Tatlor編輯的“Plant Virology Protocols From Virus Isolationto Transgenic Resistance(Methods in Molecular Biology(Humana Pr)，第81卷)”, Humana Press, 1998所描述的。簡而言之，將被認為包含高濃度的合適病毒的受感染植物的組織，優(yōu)選嫩葉和花瓣，在緩沖液(例如，磷酸鹽緩沖溶液)中磨碎以產生受病毒感染的汁液，所述汁液可以被用在隨后的接種中。[0099]用于在植物中引入和表達非病毒的外源多核苷酸序列的植物RNA病毒的構建由上述參考文獻以及下述參考文獻所展示Dawson, W. 0.等人，Virology(1989) 172 285-292 ；Takamatsu 等人 EMBO J. (1987)6 :307-311 ；French 等人 Science(1986)231 1294-1297 ;和 Takamatsu 等人，F(xiàn)EBS Letters (1990) 269 :73_76。[0100]當病毒是DNA病毒時，可以對病毒本身進行合適的修飾。備選地，為了易于構建所需的具有外源DNA的病毒載體，可以首先將病毒克隆到細菌質粒中。隨后，可以將病毒從質粒上切下。如果病毒是DNA病毒，那么可以使細菌的復制起點附著在病毒DNA上，所述病毒 DNA隨后被細菌復制。這種DNA的轉錄和翻譯將產生會使病毒DNA殼體化的外殼蛋白。如果病毒是RNA病毒，那么病毒一般以cDNA形式被克隆并被插入到質粒內。隨后，將該質粒用于進行所有的構建。隨后，通過轉錄質粒的病毒序列，并且翻譯病毒基因以產生使病毒RNA 殼體化的外殼蛋白來產生RNA病毒。[0101]用于在植物中引入和表達非病毒外源多核苷酸序列(例如包括在本發(fā)明構建體中的那些)的植物RNA病毒的構建由上述參考文獻以及美國專利號5，316，931所展示。[0102]在一個實施方案中，提供了植物病毒多核苷酸，其中已從病毒多核苷酸中刪除了天然的外殼蛋白編碼序列，插入了非天然的植物病毒外殼蛋白編碼序列和非天然的啟動子，優(yōu)選地是非天然的外殼蛋白編碼序列的亞基因組啟動子，所述啟動子能夠在植物宿主中表達、包 裝重組的植物病毒多核苷酸，并且通過重組的植物病毒多核苷酸確保宿主的全身感染。備選地，可以通過在其內插入非天然的多核苷酸序列從而產生蛋白質來滅活外殼蛋白基因。重組的植物病毒多核苷酸可以包含一種或多種附加的非天然的亞基因組啟動子。每種非天然的亞基因組啟動子能夠在植物宿主中轉錄或表達相鄰的基因或多核苷酸序列，并且不能彼此以及與天然亞基因組啟動子重組。非天然的(外源的)多核苷酸序列可以被插入，與天然的植物病毒亞基因組啟動子相鄰，或者如果包括超過一種多核苷酸序列， 與天然和非天然的植物病毒亞基因組啟動子相鄰。非天然的多核苷酸序列在宿主植物中在亞基因組啟動子的控制下被轉錄或表達而產生所需的產物。[0103]在第二個實施方案中，提供了與第一個實施方案中相同的重組植物病毒多核苷酸，除了下列之外將天然外殼蛋白編碼序列置于與所述非天然的外殼蛋白亞基因組啟動子之一相鄰而不是與非天然的外殼蛋白編碼序列相鄰。[0104]在第三個實施方案中，提供了重組的植物病毒多核苷酸，其中天然的外殼蛋白基因與其亞基因組啟動子相鄰，并且將一種或多種非天然的亞基因組啟動子插入病毒多核苷酸內。插入的非天然的亞基因組啟動子能夠在植物宿主中轉錄或表達鄰近的基因，并且不能彼此以及與天然亞基因組啟動子重組?？梢圆迦敕翘烊坏亩嗪塑账嵝蛄信c所述非天然的亞基因組植物病毒啟動子相鄰，從而使得所述序列在宿主植物中在亞基因組啟動子的控制下進行轉錄或表達，以產生所需的產物。[0105]在第四個實施方案中，提供了與第三個實施方案中相同的重組的植物病毒多核苷酸，除了天然外殼蛋白編碼序列被非天然的外殼蛋白編碼序列替換之外。[0106]通過由重組植物病毒多核苷酸編碼的外殼蛋白將病毒載體殼體化，從而產生重組的植物病毒。所述重組的植物病毒多核苷酸或重組的植物病毒被用于感染合適的宿主植物。所述重組的植物病毒多核苷酸能夠在宿主中復制，在宿主中全身性地傳播，并在宿主中轉錄或表達外源基因(外源多核苷酸)，以產生所需的蛋白質。[0107]用于給植物接種病毒的技術可以在下述參考文獻中找到=Foster和Taylor 編輯 的“Plant Virology Protocols From Virus Isolation toTransgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr),第 81 卷)，，，Humana Press, 1998 ;Maramorosh 和 Koprowski 編輯的“Methods in Virology，，7 卷，Academic Press,New York 1967-1984 ；Hill, S. A. “Methods in Plant Virology”，Blackwell, Oxford,1984; ffalkey, D. G. A. “Applied Plant Virology”，Wiley, New York, 1985 ;以及 Kado 和 Agrawa 編輯的“Principles and Techniques in Plant Virology，，, Van Nostrand-Reinhold, New York。[0108]除了上述之外，還可以將本發(fā)明的多核苷酸引入葉綠體基因組中，從而使得能夠進行葉綠體表達。[0109]用于將外源多核苷酸序列引入葉綠體基因組中的技術是已知的。這種技術涉及下述操作程序。首先，對植物細胞進行化學處理以便將每個細胞的葉綠體數(shù)目減少到約I 個。隨后，為了將至少一個外源多核苷酸分子引入葉綠體內，經由粒子轟擊將外源多核苷酸引入細胞內。選擇外源多核苷酸以使得它可經由同源重組整合到葉綠體的基因組中，所述同源重組通過葉綠體所固有的酶而很容易地實現(xiàn)。為此，外源多核苷酸除了包括目的基因外，還包括源自葉綠體基因組的至少一段多核苷酸鏈段。此外，外源多核苷酸還包括選擇標記，所述選擇標記通過順次的選擇操作程序而用于確定葉綠體基因組的所有或基本上所有拷貝在此類選擇后將包含外源多核苷酸。關于這種技術的更多細節(jié)可在美國專利號 4，945, 050 ;和5，693，507中找到， 其在此被引入本文作為參考。因此，可以通過葉綠體的蛋白質表達系統(tǒng)來產生多肽，并且多肽變得被整合到葉綠體的內膜中。[0110]因為植物的油含量、產量、生物量、生長速率和/或活力的增加可以涉及累加地或協(xié)同地起作用的多種基因(參見，例如，Quesda等人，Plant Physiol. 130 =951-063,2002), 所以本發(fā)明還設想在單個宿主植物中表達多個外源多核苷酸，從而實現(xiàn)植物的油含量、產量、生物量、生長速率和/或活力的優(yōu)越的增加。[0111]在單個宿主植物中表達多個外源多核苷酸可以通過將多個核酸構建體共引入到單個植物細胞內來實現(xiàn)，每個所述核酸構建體包含不同的外源多核苷酸。隨后，可以使用上文描述的方法使經轉化的細胞再生為成熟植物。[0112]備選地，在單個宿主植物中表達多個外源多核苷酸可以通過將單個核酸構建體共引入到單個植物細胞中來實現(xiàn)，所述單個核酸構建體包含多個不同的外源多核苷酸。這種構建體可以被設計成具有單個啟動子序列，所述單個啟動子序列可以轉錄包括所有不同外源多核苷酸序列的多順反子信使RNA。為了使得能夠共翻譯由該多順反子信使RNA編碼的不同多肽，多核苷酸序列可以經由內部核糖體進入位點(IRES)序列進行互連，所述IRES序列促進位于IRES序列下游的多核苷酸序列的翻譯。在這種情況下，編碼上述不同多肽的轉錄的多順反子RNA分子將從加帽的5，末端和多順反子RNA分子的2個內部IRES序列開始翻譯，從而在細胞內產生所有不同的多肽。備選地，構建體可以包含各自與不同的外源多核苷酸序列連接的幾個啟動子序列。[0113]可以使用上文描述的方法將用包含多個不同的外源多核苷酸的構建體轉化的植物細胞再生為成熟植物。[0114]備選地，在單個宿主植物中表達多個外源多核苷酸可以通過將不同的核酸構建體 (包含不同的外源多核苷酸)引入到多個植物內來實施。隨后，可以對再生的轉化植物進行雜交育種，并且使用常規(guī)植物育種技術針對優(yōu)良的油含量、生長速率、生物量、產量和/或活力來選擇所得到的后代。[0115]因此，本發(fā)明包含外源性地表達(如上所述)本發(fā)明的多核苷酸和/或多肽的植物。一旦在植物細胞或整個植物中表達，可通過本領域公知的方法確定由該外源多核苷酸編碼的多肽的水平，所述方法例如是活性測試法、應用能夠特異性地結合該多肽的抗體的蛋白質印跡、酶連免疫吸附測試(ELISA)、放射免疫測試法(RIA)、免疫組織化學、免疫熒光坐寸ο[0116]確定植物中從外源多核苷酸轉錄的RNA水平的方法是本領域公知的，并且例如包括，RNA印跡分析、逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)分析(包括定量的、半定量的或實時的 RT-PCR)以及RNA原位雜交。[0117]上述多核苷酸和多肽可以以安全且有成本有效的方式被用在大范圍的經濟植物中。[0118]可應用本領域公知的方法確定轉基因(編碼所述多肽的外源多核苷酸)對油含量、植物產量、種子產量、生物量、生長速率和/或活力的影響。[0119]可通過從植物的種子或營養(yǎng)部分提取油來確定植物的油含量。簡而言之， 可通過在特定溶劑(例如，己烷或石油醚)的存在下研磨植物組織并在連續(xù)浸提器中提取油從而從植物(例如，種子)中移除脂質(油)。間接的油含量分析可以使用各種公知的方法來進行，例如以下方法核磁共振(NMR)光譜法，其測量液態(tài)樣品中由氫原子吸收的共振能[例如參見，Conway TF.和Earle FR. , 1963, Journal of the American Oil Chemists ' Society ；Springer Berlin/Heidelberg, ISSN 0003-021X (Print) 1558-9331 (在線)；近紅外(NI)光譜法，其利用樣品對于近紅外輻射能 (1100-2500nm)的吸收；以及在W0/2001/023884中描述的方法，其基于用溶劑提取油、在氣流中蒸發(fā)該溶劑，其形成油顆粒，并且將光導向 該氣流和油顆粒，形成可檢測的反射光。在以下實施例部分的實施例7中描述了另一種測定油含量的方法。[0120]可通過生長參數(shù)例如每時間的葉面積、花結直徑、植物鮮重等的增加來計算植物的活力。[0121]可應用生長中的植物的數(shù)碼分析來測量生長速率。例如，可以每3天獲得在樣地基礎上的溫室中生長的植物照片，并且通過數(shù)碼分析計算花結面積。通過用采樣天數(shù)之間花結面積的差別除以樣本之間天數(shù)的差別計算花結面積的生長。[0122]可通過從總共8-16株植物收集總種子，應用分析天平稱重并且使總重量除以植物數(shù)目來測量種子產量?？梢砸韵嗤姆绞?，同時考慮給予單個植物的生長面積來計算每生長面積的種子?？赏ㄟ^增加每個植物的種子產量和/或通過增加在給定面積中能夠生長的植物數(shù)目來實現(xiàn)每生長面積的種子產量的增加。[0123]可以通過測量從8-16株植物生產并收獲的干種子的量(重量或大小)或數(shù)量 (即，數(shù)目)，并除以植物數(shù)目來評估每植物的種子產量。[0124]可通過測量每時間產生的植物生物量、花結面積、葉子的大小和根長度來估算生長速率(可以以每天cm2葉面積計算)。[0125]因此，本發(fā)明具有很高的提高商業(yè)上期望的作物(例如，種子)產量的農業(yè)價值。[0126]可加工上述任何的轉基因植物或其部分以生產飼料、食物、蛋白質或油制備物，例如用于反芻類動物。[0127]上述的展示出增加的油含量的轉基因植物可被用于生產植物油(通過從該植物中提取油)。[0128]根據(jù)本發(fā)明方法生產的植物油(包括種子油和/或營養(yǎng)部分油)可以與各種其它組分組合?？梢愿鶕?jù)預期的用途確定在產品中包含的特定組分。示范性的產品包括動物飼料、用于化學改性的原材料、生物可降解的塑料、混合的食物產品、食用油、生物燃料、烹調油、潤滑劑、生物柴油、點心、化妝品和發(fā)酵過程原料。將要被摻入該植物油中的示范性產品包括動物飼料、人類食物產品，諸如擠出點心、面包、作為食物粘合劑、水產養(yǎng)殖飼料、可發(fā)酵的混合物、食品補劑、運動飲料、營養(yǎng)食品條、多維生素補劑、膳食飲料和谷類食物。[0129]本文所使用的術語“約”是指±10%。[0130]術語“包含”、“包括”、“具有”及它們的變化形式的意思是“包括但不限于”。[0131]術語“由......組成”的意思是“包括且限于”。[0132]術語“基本上由......組成”的意思是所述的組合物、方法或結構可以包括附加的組分、步驟和/或部分，只要所述附加的組分、步驟和/或部分不會實質上地改變所要求保護的組合物、方法或結構的基本和新穎的特征。[0133]本文所使用的單數(shù)形式“一種”、“一個”和“該”包括復數(shù)形式，除非上下文明確地另外指出。例如，術語“一種化合物”或“至少一種化合物”可以包括多種化合物(包括其混合物)。[0134]在本申請的全文中，可能以范圍形式表示本發(fā)明的各個實施方案。應當理解，以范圍形式的描述僅僅是為了方便和簡潔并且不能認為是對本 發(fā)明范圍的剛性限制。因此，應當將范圍的描述理解為已具體地公開了在該范圍中的所有可能的亞范圍以及各個數(shù)值。例如，諸如I至6的范圍描述應當被理解為具體公開了諸如I至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等的亞范圍，以及在該范圍內的單個數(shù)字，例如，1、2、3、4、5和6。本申請不考慮范圍的寬度。[0135]當任何時候被本文中指出數(shù)值范圍時，其意思是包括在該指定范圍內的任何引用的數(shù)字(分數(shù)或整數(shù))。短語“在(第一個指明的數(shù)字和第二個指明的數(shù)字)之間的范圍” 和“(第一個指明的數(shù)字)‘至’(第二個指明的數(shù)字)的范圍”在本文中可互換使用，并且意思是包括所述第一和第二個指明的數(shù)字和它們之間的所有分數(shù)和整數(shù)數(shù)值。[0136]在本文中所使用的術語“方法”是指用于完成給定任務的方式、手段、技術和步驟， 包括但不限于化學、藥學、生物學、生物化學和醫(yī)藥領域從業(yè)者公知的那些方式、手段、技術和步驟，或可從已知的方式、手段、技術和步驟很容易地發(fā)展的那些。[0137]應當理解，為了清楚而在分開的實施方案中描述的本發(fā)明的某些特征也可以在單個實施方案中以組合方式被提供。相反，為了簡要而在單個實施方案的上下文中描述的本發(fā)明的多個特征也可以在任何其它的所描述的實施方案中被分開地、或以任何合適的亞組合或合適地提供。在各個實施方案的上下文中描述的某些特征不能被認為是這些實施方案的必要特征，除非沒有這些元素則該實施方案是無效的。[0138]上述且在權利要求
部分要求保護的本發(fā)明的各個實施方案和方面可以在以下實施例中找到試驗支持。實施例[0139]現(xiàn)在參考下述實施例，所述實施例連同上文說明書一起以非限制性方式舉例說明了本發(fā)明的一些實施方案。[0140]一般而言，本文使用的命名和本發(fā)明中使用的試驗操作程序包括分子的、生物化學的、微生物學的和重組DNA的技術。此類技術已經在文獻中得到充分說明。參見，例如，〃 Molecular Cloning A IaboratoryManual" Sambrook 等人，(1989) ； " Current Protocols in Molecular Biology "卷1-1II Ausubel, R. M,編輯(1994) ；Ausubel 等人，"Current Protocols inMolecular Biology" , John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1989) ；Perbal," A Practical Guide to Molecular Cloning" ,John Wiley & Sons, NewYork (1988) ;Watson 等人，"Recombinant DNA" , Scientific AmericanBooks, New York ;Birren 等人(編輯)"Genome Analysis A LaboratoryManual Series ", 卷 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1998);如在美國專利號 4，666，828,4, 683，202,4, 801，531,5, 192，659 和 5，272，057 中提出的方法；"Cell Biology A Laboratory Handbook "，卷1-1IICellis, J. E.，編輯(1994) ； " Current Protocols in Immunology" Volumes1-1IIColigan J.E·，編輯(1994) ;Stites 等人(編輯)，"Basic and Clinical Immunology "(第 8 版)，Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994) ;Mishell 和 Shiigi (編輯)，"Selected Methods in Cellular Immunology"， ff. H. Freeman and Co. , New York(1980);可用的免疫測定法在專利和科學文獻中得到深入地描述，參見，例如美國專利號3，791,932 ;3，839，153 ;3，850，752 ;3，850，578 ； 3，853，987 ;3，867，517 ;3，879，262 ;3，901，654 ;3，935，074 ;3，984，533 ;3，996，345 ； 4，034，074 ;4，098，876 ;4，879，219 ;5，011，771 和 5, 281, 521 ； " Oligonucleotide Synthesis " Gait, M. J.，編輯(1984) ;“NucleicAcid Hybridization " Hames, B. D.， 和 Higgins S.J.,編輯(1985) ； " Transcription and Translation " Hames, B. D.,和 Higgins S. J.,編輯(1984) ； " Animal Cell Culture " Freshney, R.1.,編輯 (1986) ； " ImmobilizedCells and Enzymes" IRL Press,(1986) ； " A Practical Guide to MolecularCloning " Perbal, B. , (1984)和"Methods in Enzymology "卷 1-317， Academic Press ； " PCR Protocols A Guide To Methods And Applications" ,Academic Press, San Diego, CA(1990) ;Marshak 等人，"Strategies forProtein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996);它們所有均在此被引入本文作為參考，就好象充分地在本文中提出一樣。其它一般的引用被提供在該文件全文中。它們中的方法被認為是本領域公知的，并且被提供在本文以方便讀者。所有在它們中包含的信息均在此被引入本文作為參考。[0141]實施例1[0142]應用生物信息學工具進行基因鑒定及基因作用預測[0143]通過對因特網(wǎng)上儲存的RNA表達輪廓、序列相似性、基因注釋、生物化學通路、 DNA、EST、蛋白質和表達數(shù)據(jù)的深入分析，鑒定了編碼適用于增加種子油和種子產量的多肽的基因。[0144]生物信息學工具[0145]經由電腦模擬(In-Silico)的基因鑒定-為了鑒定能夠極大地影響種子的油產量的新基因，在文獻中鑒定了已發(fā)現(xiàn)在胚發(fā)生、種子發(fā)育和油合成及積累中起著重要作用的擬南芥屬基因Γ油鉤基因，-OHG)。OHG數(shù)量是根據(jù)TAIR網(wǎng)站[超文本傳輸協(xié)議"/World Wide Web (點)arabidopsis (點)org/]并且包括所有有關OHG的信息。OHG 包括 Ssi2(AT2G43710)、油質蛋白 A (AT3G01570)、Lecl (AT1G21970)、Lec2 (AT1G28300)、 Fus3 (AT3G26790)、FAD3 (AT2G29980)、ABI3 (AT3G24650)和 Wril (AT3G54320)的野生型等位基因。對OHG基因和在諾丁安擬南芥屬儲存中心[(NASC)，超文本傳輸協(xié)議// affymetrix(點)arabidopsis (點)info/]]的描述解剖學、發(fā)育和各種脅迫的試驗的微陣列上打印出來的所有其它基因在79個不同的發(fā)育階段進行基因表達輪廓的比較。應用Pearson相關性統(tǒng)計學分析[超文本傳輸協(xié)議//davidmlane (點)com/hyperstat/ A34739(點)html]確定相 關性。[0146]用于每一基因的標準被詳細描述于下表I中并且覆蓋了應用各種生物信息學手段的多種生物學原理。選擇基因以基于它們與一個或多個OHG的最高表達相關性(約定為 O. 7 < R < I之間的Pearson R值)而引起種子大小和/或種子油產量的變化。在以下的表I中提供了所鑒定的基因及它們和每一 OHG的相關性(R值)。[0147]表I[0148]
權利要求
1.增加植物的油含量、生長速率和/或產量的方法，其包括將外源多核苷酸引入到該植物中，所述的外源多核苷酸編碼SEQ ID NOs :199所示的多肽，從而增加該植物的油含量、生長速率和/或產量。
2.生產油的方法，其包括(a)提供根據(jù)權利要求
1的植物，以及(b)從該植物中提取油；從而生產油。
3.權利要求
1或2的方法，其中所述的多核苷酸包含選自由SEQID NOs 34和1039組成的組的核酸序列，其中所述多核苷酸能夠增加植物的油含量、生長速率和/或產量。
4.權利要求
1或2的方法，其中所述的油包含種子油。
5.權利要求
1或2的方法，其中所述的油得自植物的營養(yǎng)部分。
專利摘要
本發(fā)明提供了增加植物的油含量、生長速率和/或產量的方法。通過在該植物中上調多肽的表達水平來實施該方法，所述多肽包含SEQ ID NO199氨基酸序列。還提供了表達該多肽的多核苷酸、核酸構建體、多肽和轉基因植物，其可用于增加植物的油含量、生長速率和/或產量以及生產油。
文檔編號A01H5/00GKCN101854798 B發(fā)布類型授權 專利申請?zhí)朇N 200880017707
公開日2013年4月3日 申請日期2008年4月9日
發(fā)明者E·伊曼紐爾, G·羅南, N·薩維爾 申請人:伊沃基因有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (2),