專利名稱:一種開(kāi)放式植物組織培養(yǎng)育苗方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)林領(lǐng)域的植物組織培養(yǎng)育苗技術(shù)，具體涉及一種開(kāi)放式植物組織培養(yǎng)工廠化育苗方法。即在培養(yǎng)基中添加采用植物提取物配制而成的抑菌劑的條件下，使植物組織培養(yǎng)育苗過(guò)程脫離嚴(yán)格無(wú)菌的操作環(huán)境，尤其是不需要高壓滅菌，可在開(kāi)放的帶菌環(huán)境中進(jìn)行植物組織培養(yǎng)育苗，從根本上簡(jiǎn)化了植物組織培養(yǎng)育苗環(huán)節(jié)，提高了育苗工作效率，大大降低了植物組織培養(yǎng)育苗成本。
背景技術(shù)：
植物組織培養(yǎng)是本世紀(jì)初開(kāi)始，以植物生理學(xué)為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)植物繁殖技術(shù)。植物組織培養(yǎng)又稱植物克隆，指通過(guò)無(wú)菌操作把植物的任何器官、組織或細(xì)胞接種于人工配制的含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)等組成的培養(yǎng)基上，在人工控制環(huán)境下進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其生長(zhǎng)、分化形成完整植株的過(guò)程。植物組織培養(yǎng)為植物的快速繁殖提供了新的手段，接種的一個(gè)小外植體，可以被誘導(dǎo)形成愈傷組織并再生芽和根，繼代多次后，即可建立無(wú)性繁殖系，大量生產(chǎn)試管苗。建立植物試管苗繁育體系，有著非常重要的意義，其一， 快速繁殖不受季節(jié)限制，可在短期內(nèi)獲得大量個(gè)體；其二，選擇優(yōu)良單株擴(kuò)繁，可保證品種的純合性，可對(duì)高產(chǎn)、高抗、優(yōu)質(zhì)新品種進(jìn)行快速推廣；其三，通過(guò)脫毒離體培養(yǎng)，可以培育出不帶任何病原物和病毒的試管苗，減少病害的發(fā)生。因此，利用植物組織培養(yǎng)快繁技術(shù)， 在提高繁殖系數(shù)、有效防止種性退化和生產(chǎn)高質(zhì)量的種苗中起到了決定性作用。經(jīng)過(guò)近一個(gè)世紀(jì)的發(fā)展，植物組織培養(yǎng)技術(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，作為現(xiàn)代生物技術(shù)的一個(gè)重要手段現(xiàn)已在工廠化育苗、種苗脫毒復(fù)壯、遺傳育種、種質(zhì)資源的保存與交換等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。目前，已在多種經(jīng)濟(jì)植物中建立了相應(yīng)的良種快速繁育體系。
發(fā)展至今，植物組織培養(yǎng)的理論研究已經(jīng)相當(dāng)精深，但它的技術(shù)環(huán)節(jié)還存在不少問(wèn)題。目前廣泛使用的植物組織培養(yǎng)育苗是在密閉、無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行，包括接種外植體、誘導(dǎo)愈傷組織、愈傷組織分化形成試管苗、試管苗的移栽等幾個(gè)步驟。這種組織培養(yǎng)方式存在四個(gè)缺陷培養(yǎng)基污染難以解決、試管苗成本過(guò)高、規(guī)?；a(chǎn)技術(shù)不成熟和試管生產(chǎn)技術(shù)繁瑣。
由于富含營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基既適合植物組織生長(zhǎng)發(fā)育，更適合雜菌的滋生。因此，不論是在植物組織培養(yǎng)的試驗(yàn)研究中還是在工廠化生產(chǎn)中，污染是普遍存在的問(wèn)題，它嚴(yán)重地影響了植物苗木的規(guī)?；a(chǎn)、植物試管基因庫(kù)的構(gòu)建、生產(chǎn)成本和寶貴材料保全等方面。 因此，控制污染成了組織培養(yǎng)中的首要技術(shù)。而影響污染的因素多種多樣，如外植體的種類、取材的時(shí)間、預(yù)處理方法、消毒劑的種類、消毒方法、培養(yǎng)基和器皿滅茵、操作人員和工作環(huán)境的要求等都與污染密切相關(guān)，因此，使得污染問(wèn)題難以防治，成為限制組織培養(yǎng)產(chǎn)業(yè)化的重要原因之一。
此外，傳統(tǒng)的植物組織培養(yǎng)方式均是在嚴(yán)格無(wú)菌的封閉條件下進(jìn)行的，無(wú)菌操作是常規(guī)植物組織培養(yǎng)的一項(xiàng)嚴(yán)格要求，如要對(duì)培養(yǎng)基、培養(yǎng)器皿高溫滅菌，任何用于操作和處理植物組織的器皿都要消毒，其操作過(guò)程都必須在無(wú)菌環(huán)境如超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。如果能夠建立起不滅菌的組織培養(yǎng)技術(shù)，還能夠?qū)⑽廴韭式档偷娇山邮芊秶鷥?nèi)，組織培養(yǎng)技術(shù)將得到巨大的飛躍。因此，尋找一種無(wú)需滅菌程序的開(kāi)放式組織培養(yǎng)技術(shù)非常重要。植物開(kāi)放式組織培養(yǎng)，即在抑菌劑的作用下，使植物組織培養(yǎng)脫離嚴(yán)格無(wú)菌的操作環(huán)境，不需高壓滅菌和超凈工作臺(tái)，在開(kāi)放的有菌環(huán)境中進(jìn)行植物組織培養(yǎng)，從根本上簡(jiǎn)化組織培養(yǎng)環(huán)節(jié)， 降低成本。
眾所周知，傳統(tǒng)組織培養(yǎng)過(guò)程中的污染，主要表現(xiàn)為培養(yǎng)基的污染，營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基為細(xì)菌、真菌提供了適宜的滋生場(chǎng)所。因此，只要將培養(yǎng)基改造成既可保證植物組織正常生長(zhǎng)，又具有抑菌功能的培養(yǎng)基，菌類一旦失去滋生場(chǎng)所，就不會(huì)對(duì)組織培養(yǎng)過(guò)程產(chǎn)生危害。改造培養(yǎng)基的關(guān)鍵在于找到一種能夠添加到培養(yǎng)基的廣譜抑菌劑。目前，廣譜抑菌劑的篩選一直是困擾植物組織培養(yǎng)專家的難題，有學(xué)者對(duì)抑菌劑及組織培養(yǎng)關(guān)系進(jìn)行過(guò)研究。 單文修等采用在培養(yǎng)基中添加大量化學(xué)殺菌消毒劑苯甲酸類、山梨酸類、酚類、含氯化合物類、季胺鹽類、脲類、胍類或天然消毒抑菌劑，建立了一種非無(wú)菌條件下的植物組織培養(yǎng)方法(申請(qǐng)?zhí)?004100M035. 5公開(kāi)號(hào)CN1^8507A)。他們對(duì)常用抗生素、抗菌素、防腐劑做了大量單一或組合添加到培養(yǎng)基中的試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)證明，常用抗生素、抗菌素、防腐劑對(duì)植物組織培養(yǎng)中的污染具有的一定的防治作用，但是針對(duì)不同的植物品種要想找到一種合適的處理組合是比較困難的，往往當(dāng)培養(yǎng)基抗菌時(shí)，植物組織的生長(zhǎng)也受到抑制；而植物組織能正常生長(zhǎng)時(shí)，卻無(wú)法獲得滿意的抗菌效果。這也是國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者普遍遇到的障礙。其原因之一是還沒(méi)有一種抗生素對(duì)所有的細(xì)菌都有效，而且藥效期短；二是有些抗菌素、防腐劑在有效濃度下，其殺菌、抗菌離子對(duì)植物組織直接產(chǎn)生傷害。
為此，我們從多種植物中提取具有抑菌活性物質(zhì)，建立了具有良好抑菌效果的植物提取物資源庫(kù)，研制了適合于開(kāi)放式組織培養(yǎng)的抑菌劑，使植物組織培養(yǎng)育苗過(guò)程可在開(kāi)放的帶菌環(huán)境中進(jìn)行，從根本上簡(jiǎn)化了育苗環(huán)節(jié)，提高了工作效率，大大降低了植物組織培養(yǎng)育苗成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于建立一種低成本、高效益的開(kāi)放式植物組織培養(yǎng)育苗方法，在添加植物提取物配制而成的抑菌劑的條件下，使植物組織培養(yǎng)育苗過(guò)程脫離嚴(yán)格無(wú)菌的操作環(huán)境，尤其是不需要高壓滅菌，可在開(kāi)放的帶菌環(huán)境中進(jìn)行植物組織培養(yǎng)育苗，簡(jiǎn)化了植物組織培養(yǎng)育苗環(huán)節(jié)，提高了工作效率，降低了植物組織培養(yǎng)育苗成本。
本發(fā)明提供的開(kāi)放式植物組織培養(yǎng)育苗方法，其特征在于，該方法在有菌的室溫自然環(huán)境條件下進(jìn)行在培養(yǎng)基中添加植物提取物抑菌劑，以IL培養(yǎng)基計(jì)算，植物提取物抑菌劑的添加量為4 15g，制備抑菌培養(yǎng)基，再利用該抑菌培養(yǎng)基進(jìn)行接種培養(yǎng)。
上述植物提取物抑菌劑可以采用下述兩類，其一包括大蒜提取物、黃連提取物和忍冬葉提取物，其質(zhì)量百分比為20 100% 0 40% 0 50%;其二包括甘草根提取物、桂花提取物和石蒜提取物，其質(zhì)量比為10 100% 0 80% 0 50%。
使用本發(fā)明所提供的抑菌培養(yǎng)基，可用于植物的種子、根、莖、葉和愈傷組織等接種和培養(yǎng)，以及試管苗的移栽，可以有效地減少植物組織培養(yǎng)過(guò)程中微生物的污染，保證植物組織、器官、細(xì)胞和試管苗的正常發(fā)育生長(zhǎng)。
本發(fā)明所述的接種是指在有菌的自然環(huán)境條件下，將上述植物組織或試管苗接種在抑菌培養(yǎng)基中，除了無(wú)需進(jìn)行無(wú)菌處理程序外，具體接種操作手續(xù)與常規(guī)組織培養(yǎng)的接種手續(xù)相同。
由于使用了抑菌培養(yǎng)基，因而本發(fā)明所述的開(kāi)放式植物組織培養(yǎng)方法中的接種及培養(yǎng)過(guò)程無(wú)需再進(jìn)行嚴(yán)格的無(wú)菌處理(無(wú)需高壓滅菌、無(wú)菌接種和無(wú)菌培養(yǎng))，改變了常規(guī)植物組織培養(yǎng)全過(guò)程中必須進(jìn)行無(wú)菌處理的傳統(tǒng)觀念，可以省略了高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、紫外燈等設(shè)備及嚴(yán)格無(wú)菌的環(huán)境設(shè)施，并可以將易損的玻璃器皿更換為價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)便的塑料杯，省略了繁瑣的消毒手續(xù)，大大降低了生產(chǎn)成本。
本發(fā)明與傳統(tǒng)無(wú)菌組織培養(yǎng)相比，具有簡(jiǎn)化環(huán)節(jié)，節(jié)省成本等特點(diǎn)，具體如下
1.培養(yǎng)容器的選擇在傳統(tǒng)組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)容器需選擇耐高溫高壓的玻璃瓶和聚丙烯封口膜。而在開(kāi)放式組織培養(yǎng)中，在培養(yǎng)基中添加抑菌劑，讓抑菌培養(yǎng)基代替高壓滅菌，并可用廉價(jià)的一次性塑料杯作為培養(yǎng)容器，用保鮮膜封口，這大大降低了成本。
2.接種器具的滅菌傳統(tǒng)組織培養(yǎng)中，接種用的剪子、鑷子、刀片等均采用高壓滅菌或酒精燈灼燒滅菌，而在開(kāi)放組織培養(yǎng)中，接種器具用75%酒精擦洗后，即可有效的防止由于接種器具引發(fā)的污染。
3.接種方法在接種室內(nèi)，用75%的酒精將接種臺(tái)面和手擦干凈，揭開(kāi)封口膜一角，用接種器具把植物接種到培養(yǎng)基上，再將杯口封嚴(yán)即可。
4.技術(shù)環(huán)節(jié)與成本分析開(kāi)放式組織培養(yǎng)省去了高壓滅菌和超凈工作臺(tái)接種，簡(jiǎn)化了組織培養(yǎng)環(huán)節(jié)。由于制備抑菌劑的材料資源豐富，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，消毒液也能重復(fù)利用，因此開(kāi)放式組織培養(yǎng)與傳統(tǒng)組織培養(yǎng)相比，大大節(jié)省成本。
具體實(shí)施方式
下面通過(guò)借助以下實(shí)施例將更加詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，且以下實(shí)施例僅是說(shuō)明性的， 本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的限制。
開(kāi)放式植物組織培養(yǎng)育苗可以按照以下步驟進(jìn)行
(1)抑菌培養(yǎng)基的配制
植物組織培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基種類很多，如MS、N6、White等，本專利中植物組織培養(yǎng)以MS培養(yǎng)基為例進(jìn)行說(shuō)明。配制IL MS培養(yǎng)基，然后按照每升培養(yǎng)基添加4 15g抑菌劑標(biāo)準(zhǔn)，將抑菌劑添加至基本培養(yǎng)基中，用0. lmol/L NaOH或0. lmol/L HCl調(diào)節(jié)pH至 6. 0，配制成抑菌培養(yǎng)基(固體培養(yǎng)基中加入瓊脂)。采用透明的塑料杯分裝，將分裝好培養(yǎng)基的容器蓋上棉塞或用保鮮膜封口，培養(yǎng)基冷卻后即可接種。
(2)接種
接種過(guò)程在開(kāi)放環(huán)境中進(jìn)行。除了培養(yǎng)基不需滅菌、不需嚴(yán)格無(wú)菌的接種環(huán)境外，其它接種步驟與傳統(tǒng)的接種程序一樣，即先用消毒劑對(duì)外植體進(jìn)行消毒，獲得無(wú)菌外
植體，然后在接種臺(tái)面上，將消毒后的外植體接種至添加有抑菌劑的培養(yǎng)基中，用保鮮膜封□。
(3)初代培養(yǎng)
將接種材料置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)(培種室無(wú)需滅菌消毒)，以獲得愈傷組織，一個(gè)周期后，按照上述操作進(jìn)行繼代培養(yǎng)。
(4)愈傷組織的分化[0028]將愈傷組織接種于抑菌分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，生根長(zhǎng)芽，形成試管苗。
(5)試管苗的移栽
因?yàn)樵嚬苊绲恼麄€(gè)培養(yǎng)過(guò)程為開(kāi)放式培養(yǎng)，因此試管苗的移栽不需要煉苗。將試管苗取出后，用清水將其根部沖洗干凈，再用抑菌劑浸泡試管苗根部，30分鐘后用清水沖洗干凈后移栽。
實(shí)施例一魔芋開(kāi)放式組織培養(yǎng)
魔芋開(kāi)放式組織培養(yǎng)按照以下步驟進(jìn)行
(1)抑菌劑的制備
①大蒜提取物的制備
剝皮后的新鮮白皮大蒜1kg，洗凈后加入水300ml，用打漿機(jī)攪打20分鐘得到蒜泥，倒入密封罐中，滴加0. 02mol/L的鹽酸并不斷攪拌至蒜泥pH = 6，在溫度40°C下密封靜置，讓蒜泥中的內(nèi)源蒜酶解蒜氨酸4小時(shí)以產(chǎn)生大蒜素。酶解完成后，將蒜漿轉(zhuǎn)移到攪拌罐中，加入4L 95 %食用乙醇，充分?jǐn)嚢韬?，板框過(guò)濾得到大蒜素提取液，轉(zhuǎn)移到真空減壓濃縮罐中，60°C下減壓蒸餾至干，得到黃色大蒜提取物，經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)大蒜素含量等于 6. 98%。
②黃連提取物的制備
稱取干燥的黃連根莖1kg，粉碎機(jī)粉碎后過(guò)80目篩網(wǎng)，黃連粉末置于提取罐中加入3L 95%工業(yè)乙醇，95°C浸提5小時(shí)，通過(guò)板框過(guò)濾得到黃連提取液，轉(zhuǎn)移到真空減壓濃縮罐中，55°C下減壓蒸餾至干，得到黃連提取物，經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)黃連素含量等于 20%。
③忍冬葉提取物的制備
稱取干燥的忍冬葉1kg，粉碎機(jī)粉碎后過(guò)60目篩網(wǎng)，忍冬葉粉末置于提取罐中加入2L 80%工業(yè)乙醇，調(diào)節(jié)pH值5. 0，95°C浸提3小時(shí)，通過(guò)板框過(guò)濾得到忍冬葉提取液，轉(zhuǎn)移到真空減壓濃縮罐中，減壓蒸餾至干，得到忍冬葉提取物。經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)綠原酸含量等于10%。
將三種提取物按照附表1所述的5種比例分別混合，制備成5種抑菌劑。
(2)抑菌培養(yǎng)基的配制
配制5份IL MS培養(yǎng)基，于其中加入瓊脂，完全溶解后，添加激素6-BA 2mg/ L+NAA 0. lmg/L+IBA 0. ang/L，然后分別加入(1)中所述的5種抑菌劑，添加量為10g/L，配制成5種固體抑菌培養(yǎng)基。采用透明的塑料杯分裝，將分裝好培養(yǎng)基的容器用保鮮膜封口， 培養(yǎng)基冷卻后即可接種。
(3)接種魔芋球莖
接種經(jīng)常規(guī)消毒后的魔芋球莖，進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)照1為O)中所述的不添加抑菌劑的固體培養(yǎng)基；對(duì)照2為(2)中所述的不添加抑菌劑的固體培養(yǎng)基，而且培養(yǎng)基需要滅菌。 每組接種20瓶，每瓶接種5塊外植體，共100塊外植體。抑菌培養(yǎng)基對(duì)魔芋愈傷組織誘導(dǎo)及芽形成的影響見(jiàn)附表1。
實(shí)施例二開(kāi)放式條件下光果甘草、脹果甘草和烏拉爾甘草種子萌發(fā)
開(kāi)放式條件下光果甘草、脹果甘草和烏拉爾甘草種子萌發(fā)按照以下步驟進(jìn)行
(1)抑菌劑的制備[0048]按照實(shí)施例一中所述的制備方法制備大蒜提取物、黃連提取物和忍冬葉提取物， 并將三種提取物按照附表2所述的5種比例分別混合，制備成5種抑菌劑。
(2)抑菌培養(yǎng)基的配制
配制5份IL MS培養(yǎng)基，于其中加入瓊脂，即為種子萌發(fā)培養(yǎng)基。分別加入(1) 中所述的5種抑菌劑，添加量為4g/L，配制成5種固體抑菌培養(yǎng)基。采用透明的塑料杯分裝，將分裝好培養(yǎng)基的容器用保鮮膜封口，培養(yǎng)基冷卻后即可接種。
(3)甘草種子接種
用濃硫酸分別浸泡光果甘草、脹果甘草和烏拉爾甘草種子Ih后，用清水沖洗干凈，經(jīng)常規(guī)消毒后，分別接種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種20瓶，每瓶接種10粒種子，共200粒種子。對(duì)照1為( 中所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基，且培養(yǎng)基不添加抑菌劑；對(duì)照 2為(2)中所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基，且培養(yǎng)基不添加抑菌劑，但培養(yǎng)基需要滅菌。抑菌培養(yǎng)基對(duì)三種甘草種子萌發(fā)的影響見(jiàn)附表2。
實(shí)施例三甘草開(kāi)放式組織培養(yǎng)育苗
甘草開(kāi)放式組織培養(yǎng)育苗按照以下步驟進(jìn)行
(1)抑菌劑的制備
①甘草根提取物的制備
準(zhǔn)確稱取干燥的甘草根莖1kg，粉碎機(jī)粉碎后過(guò)80目篩網(wǎng)，甘草粉末置于提取罐中加入3L 50 %工業(yè)乙醇，超聲提取1小時(shí)，通過(guò)板框過(guò)濾得到甘草黃酮提取液，轉(zhuǎn)移到真空減壓濃縮罐中，55°C下減壓蒸餾至干，得到甘草根提取物，其中甘草黃酮的純度等于 70%。
②桂花提取物的制備
準(zhǔn)確稱取干燥的桂花1kg，加入500ml 90%乙醇，解吸15分鐘。再加入4L 80%的乙醇回流提取15分鐘，提取2次，過(guò)濾，濾液轉(zhuǎn)移到真空減壓濃縮罐中，55°C下減壓蒸餾至干，得到桂花提取物，其中桂花黃酮的純度等于40%。
③石蒜提取物的制備
準(zhǔn)確稱取干燥的石蒜1kg，粉碎機(jī)粉碎后過(guò)80目篩網(wǎng)，石蒜粉末置于提取罐中加入IOL甲醇，75°C回流提取3小時(shí)，通過(guò)板框過(guò)濾得到石蒜提取液，轉(zhuǎn)移到真空減壓濃縮罐中，55°C下減壓蒸餾至干，得到石蒜提取物，經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)石蒜生物堿的純度等于
2 % ο
將三種提取物按照附表3所述的5種比例分別混合，制備成5種抑菌劑。
(2)抑菌培養(yǎng)基的配制
配制5份1 L MS培養(yǎng)基，于其中加入瓊脂，完全溶解后，添加激素6-BA 2mg/ L+KT 0. 5mg/L+IBA 0. 5mg/L后，然后分別加入(1)中所述的5種抑菌劑，添加量為4g/L，配制成5種抑菌培養(yǎng)基。采用透明的塑料杯分裝，將分裝好培養(yǎng)基的容器蓋上棉塞，培養(yǎng)基冷卻后即可接種。
(3)接種脹果甘草下胚軸
接種經(jīng)常規(guī)消毒后的脹果甘草、光果甘草下胚軸，進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)照1為O)中所述的不添加抑菌劑的固體培養(yǎng)基；對(duì)照2為( 中所述的不添加抑菌劑的固體培養(yǎng)基，而且培養(yǎng)基需要滅菌。每組接種20瓶，每瓶接種6個(gè)莖段，共120個(gè)莖段。抑菌培養(yǎng)基對(duì)脹果甘草、光果甘草愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率的影響見(jiàn)附表3。
實(shí)施例四開(kāi)放式條件下刺山柑種子萌發(fā)及誘導(dǎo)下胚軸分化
開(kāi)放式條件下刺山柑種子萌發(fā)及誘導(dǎo)下胚軸分化按照以下步驟進(jìn)行
(1)抑菌劑的制備
按照實(shí)施例一中所述的制備方法制備大蒜提取物、黃連提取物和忍冬葉提取物， 并將三種提取物按照附表4所述的5種比例分別混合，制備成5種抑菌劑。
(2)抑菌培養(yǎng)基的配制
配制MS培養(yǎng)基，于其中加入瓊脂，完全溶解后，添加激素。種子萌發(fā)培養(yǎng)基中添加激素為6-BA 1. Omg/L,誘導(dǎo)下胚軸分化培養(yǎng)基中添加激素為6-BA 0. lmg/L+NAA 0.01mg/L。分別加入(1)中所述的5種抑菌劑，添加量為15g/L，配制成抑菌培養(yǎng)基。采用透明的塑料杯分裝，將分裝好培養(yǎng)基的容器用保鮮膜封口，培養(yǎng)基冷卻后即可接種。
(3)刺山柑種子接種
用濃硫酸浸泡刺山柑種子Ih后，用清水沖洗干凈，經(jīng)常規(guī)消毒后，接種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種15粒種子，共150粒種子。當(dāng)種子萌發(fā)后，切取下胚軸，置于分化培養(yǎng)基中，每組接種20瓶，每瓶接種6個(gè)莖段，共120個(gè)莖段。對(duì)照1為 (2)中所述的不添加抑菌劑的培養(yǎng)基；對(duì)照2為( 中所述的不添加抑菌劑的培養(yǎng)基，但是培養(yǎng)基需要滅菌。抑菌培養(yǎng)基對(duì)刺山柑種子萌發(fā)和下胚軸分化的影響見(jiàn)附表4。
實(shí)施例五開(kāi)放式條件下魔芋試管苗的形成和移栽
開(kāi)放式條件下魔芋試管苗的形成和移栽按照以下步驟進(jìn)行
(1)抑菌劑的制備
按照實(shí)施例三中所述的制備方法制備甘草根提取物、桂花提取物和石蒜提取物， 并將三種提取物按照附表5所述的5種比例分別混合，制備成5種抑菌劑。
(2)抑菌培養(yǎng)基的配制
配制IL MS培養(yǎng)基，于其中加入瓊脂，完全溶解后，添加激素6-BA1.5mg/ L+NAA 0.3mg/L后，分別加入(1)中所述的5種抑菌劑，添加量為15g/L，配制成抑菌培養(yǎng)基。采用透明的塑料杯分裝，將分裝好培養(yǎng)基的容器用保鮮膜封口，培養(yǎng)基冷卻后即可接種。
(3)接種魔芋不定芽
接種經(jīng)常規(guī)消毒后的魔芋不定芽，進(jìn)行培養(yǎng)，使之分化形成試管苗。對(duì)照1為(2) 中所述的不添加抑菌劑的培養(yǎng)基；對(duì)照2為( 中所述的不添加抑菌劑的培養(yǎng)基，而且培養(yǎng)基需要滅菌，每組接種20瓶，每瓶接種5個(gè)不定芽，共100個(gè)不定芽。
(4)液體抑菌劑的制備
分別取(1)中所述的5種抑菌劑，每種稱取5g溶于IL水中，攪拌均勻后制得5種液體抑菌劑，分別用于試管苗根部的浸泡。
(5)試管苗的移栽
待不定芽形成粗壯的試管苗后，將試管苗取出，用清水將其根部沖洗干凈，再將其根部分別置于(4)中制備的5種液體抑菌劑中，浸泡30分鐘后，用清水沖洗干凈，移栽。抑菌培養(yǎng)基對(duì)魔芋試管苗的形成和移栽的影響見(jiàn)附表5。
實(shí)施例六開(kāi)放式條件下紅豆杉外植體誘導(dǎo)形成愈傷組織[0088]開(kāi)放式條件下紅豆杉外植體誘導(dǎo)形成愈傷組織按照以下步驟進(jìn)行
(1)抑菌劑的制備
按照實(shí)施例三中所述的制備方法制備甘草根提取物、桂花提取物和石蒜提取物， 并將三種提取物按照附表6所述的5種比例分別混合，制備成5種抑菌劑。
(2)抑菌培養(yǎng)基的配制
配制5份IL MS培養(yǎng)基，于其中加入1 %瓊脂，完全溶解后，添加激素二氯苯氧乙酸O.aiig/L和α-萘乙酸0.5mg/L，然后分別加入(1)中所述的5種抑菌劑，添加量為Sg/ L，配制成5種抑菌培養(yǎng)基。采用透明的塑料杯分裝，將分裝好培養(yǎng)基的容器蓋上棉塞，培養(yǎng)基冷卻后即可接種。
(3)接種紅豆杉外植體
接種經(jīng)常規(guī)消毒后的中國(guó)紅豆杉、東北紅豆杉和曼地亞紅豆杉嫩莖，進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)照1為O)中所述的不添加抑菌劑的固體培養(yǎng)基；對(duì)照2為( 中所述的不添加抑菌劑的固體培養(yǎng)基，而且培養(yǎng)基需要滅菌。每組接種20瓶，每瓶接種6個(gè)莖段，共120個(gè)莖段。抑菌培養(yǎng)基對(duì)中國(guó)紅豆杉、東北紅豆杉和曼地亞紅豆杉愈傷組織誘導(dǎo)率的影響見(jiàn)附表6。
附表1開(kāi)放式條件下魔芋愈傷組織誘導(dǎo)和芽的形成
權(quán)利要求
1.一種開(kāi)放式植物組織培養(yǎng)育苗方法，其特征在于，該方法在有菌的室溫自然環(huán)境條件下進(jìn)行在培養(yǎng)基中添加植物提取物抑菌劑，以1 L培養(yǎng)基計(jì)算，植物提取物抑菌劑的添加量為4 15 g，制備抑菌培養(yǎng)基，再利用該抑菌培養(yǎng)基進(jìn)行接種培養(yǎng)；所述植物提取物抑菌劑的第一種配方包括大蒜提取物、黃連提取物和忍冬葉提取物， 其質(zhì)量百分比為20 100% 0 40% 0 50% ；所述植物提取物抑菌劑的第二種配方包括甘草根提取物、桂花提取物和石蒜提取物， 其質(zhì)量百分比為10 100% 0 80% 0 50%。
2.如權(quán)利要求
1所述的開(kāi)放式植物組織培養(yǎng)育苗方法，其特征在于，在所述植物提取物抑菌劑的第一種配方中，大蒜提取物中的大蒜素的重量百分比大于或等于6. 0%，黃連提取物中黃連素的重量百分比大于或等于20. 0%，忍冬葉提取物中綠原酸的重量百分比大于或等于10. 0%。
3.如權(quán)利要求
1所述的開(kāi)放式植物組織培養(yǎng)育苗方法，其特征在于，在所述植物提取物抑菌劑的第二種配方中，甘草根提取物中的甘草黃酮純度大于或等于70%，桂花提取物中的桂花黃酮純度大于或等于40%，石蒜提取物中的石蒜生物堿純度大于或等于m。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種開(kāi)放式植物組織培養(yǎng)育苗方法，屬于農(nóng)林領(lǐng)域的植物組織培養(yǎng)育苗技術(shù)。該方法在有菌的室溫自然環(huán)境條件下進(jìn)行在培養(yǎng)基中添加植物提取物抑菌劑，以1L培養(yǎng)基計(jì)算，抑菌劑的添加量為4～15g，制備抑菌培養(yǎng)基，再利用該抑菌培養(yǎng)基進(jìn)行接種培養(yǎng)。抑菌劑有兩類，其一包括大蒜提取物、黃連提取物和忍冬葉提取物，其質(zhì)量百分比為20～100％∶0～40％∶0～50％；其二包括甘草根提取物、桂花提取物和石蒜提取物，其質(zhì)量比為10～100％∶0～80％∶0～50％。本發(fā)明方法可使植物組織培養(yǎng)育苗過(guò)程脫離嚴(yán)格無(wú)菌的操作環(huán)境，在開(kāi)放的有菌環(huán)境中進(jìn)行植物組織培養(yǎng)育苗，這從根本上簡(jiǎn)化了植物組織培養(yǎng)育苗環(huán)節(jié)，提高了工作效率，大大降低了育苗成本。
文檔編號(hào)A01H4/00GKCN101455180 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 200910060484
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2009年1月9日
發(fā)明者何峰, 余龍江, 季家興, 楊英, 金文聞 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan非專利引用 (4),