專利名稱:用秀麗線蟲生物模型對甾體類激素進(jìn)行檢測的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品安全檢測、飼料安全檢測等技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans, C. elegans)是一種可以獨立生存的線蟲，其個體小，成體僅I. 5mm長，為雌雄同體，雄性個體僅占群體的0. 2%，可自體受精或雙性生殖，在20°C下平均生活史為3. 5天，平均繁殖力為300-350個，但若與雄蟲交配，可產(chǎn)生多達(dá)1400個以上的后代。秀麗線蟲的基因組大小為97Mb，分布于6條染色體，預(yù)測有編碼基因19717個，基因組序列40%與人類同源，這就意味著它與更高等的生物體共有一些相似的細(xì)胞及分子結(jié)構(gòu)以及控制通路；它是第一個基因體完全被定序的多細(xì)胞真核生物，且每 一個體細(xì)胞的發(fā)育情況都研究得較為清楚，這個細(xì)胞世系的規(guī)律在各個個體之間是幾乎不變的；其遺傳背景清楚、個體結(jié)構(gòu)簡單、生活史短；并且標(biāo)本便宜、在實驗室中容易掌控。因此在衰老與壽命、人類遺傳性疾病、動物的應(yīng)急反應(yīng)、環(huán)境生物學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。例如用秀麗線蟲測定藥品與個人護(hù)理品的世代毒性的方法(公開號CN 101451983A)等。
留體類激素是眾多環(huán)境激素類物質(zhì)的一類化合物，其特點是具有很高的穩(wěn)定性，對人體內(nèi)分泌有干擾作用。近年來，有關(guān)學(xué)者研究表明留體類激素對野生生物造成的危害主要表現(xiàn)為生殖器官、生殖機(jī)能和生殖行為異常。例如通過PCB-60、-104、-190及雌激素17 3-雌二醇對斑馬魚的實驗研究表明，這些激素物質(zhì)可以大大增加魚類胚胎和幼體死亡率；長期暴露于IOu g/L壬基酚環(huán)境中的片腳類動物，其種群密度和生長速度明顯降低；在英國海灣生活的雄性比目魚由于受環(huán)境激素的影響，其血液卵黃素濃度有升高的趨勢，繁殖行為異常；美國佛羅里達(dá)州污染湖泊中的鱷魚幼體，由于受環(huán)境激素的影響，它們體內(nèi)性激素的調(diào)節(jié)和甲狀腺激素的濃度有所改變。留體類激素在動物體內(nèi)的殘留，通過食物鏈進(jìn)入人體，會使人的正常生理功能發(fā)生紊亂，使小孩性成熟加快，影響正常生長和發(fā)育。
食品中留體類激素主要來源于生產(chǎn)源頭動植物自身的留體類激素、作為動物飼料添加劑和植物生長調(diào)節(jié)劑過量使用的外源性留體類激素、以及為了預(yù)防、治療動植物疾病和促進(jìn)產(chǎn)量時給動植物使用藥物中的留體類激素，導(dǎo)致食品中留體類激素水平呈顯著上升趨勢。國內(nèi)奶粉促幼兒性早熟事件，使得國家到地方各級政府高度重視。因此利用多細(xì)胞真核生物秀麗線蟲建立食品及飼料中留體類激素污染物安全性生物模型是非常必要的，為食品與飼料中留體類激素污染物檢測提供新方法。
目前國內(nèi)外對食品與飼料中留體類激素的研究方法主要有高效液相色譜法、放射免疫分析法、分光光度法、薄層層析法、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法等化學(xué)方法和生物方法，這些方法都是從定量的角度來研究留體類激素，并且成本高、周期長，對實驗人員的技術(shù)要求也較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用秀麗線蟲生物模型對留體類激進(jìn)行檢測的方法，利用多細(xì)胞真核生物秀麗線蟲建立食品及飼料中留體類激素污染物安全性生物模型，為人類的食品安全問題提供理論、技術(shù)基礎(chǔ)和新型檢測方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
用秀麗線蟲建立食品與飼料中留體類激素污染物生物模型。
本發(fā)明的方法是
一、利用秀麗線蟲生物模型對甾體類激素純品進(jìn)行安全性危害檢測的方法
I、獲得同步化的秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)蟲液將正在產(chǎn)卵期的秀麗線蟲雌雄同體成蟲用M9緩沖液從NGM培養(yǎng)板中洗下，1500rpm離心lmin，棄去上清。如上法再用M9緩沖液清洗一次后將含秀麗線蟲的M9緩沖液定容于容器內(nèi)，并加入等體積裂解液,上下顛倒混勻3-5min后1500rpm離心3min,棄去上清,收集底部沉淀。沉淀改用無菌的S-Medium 反復(fù)清洗2-3次至pH值達(dá)到中性，此時秀麗線蟲蟲體已被裂解而蟲卵仍然保存完好。將含有秀麗線蟲蟲卵的無菌的S-Medium溶液放于生化培養(yǎng)箱內(nèi)(16°C _25°C )培養(yǎng)8_12h。由于沒有食物，蟲卵孵化以后會全部停止在秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)，1500rpm離心3min收集幼蟲，備用。
2、將甾體類激素純品溶于體積百分濃度為1%的二甲基亞砜中。
3、將秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)蟲液暴露于留體類激素純品中
秀麗線蟲采用液體暴露方法進(jìn)行暴露，設(shè)置兩組樣品，第一組為暴露組用無菌的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入I步驟收集獲得的處于秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)的蟲液及E. coli 0P50及液體NGM培養(yǎng)液及留體類激素純品，并混勻，留體類激素的終濃度為0. Ing/ml-20ng/ml ;第二組為空白對照組用無菌的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入I步驟收集獲得的處于秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)的蟲液及E. coli 0P50及液體NGM培養(yǎng)液。將這兩組樣品放入生化培養(yǎng)箱(16°C -25°C )中暴露培養(yǎng)6h后分別用移液槍將樣品取出，置于離心管中。
4、分別向兩組樣品的離心管中加入M9緩沖液，搖勻后靜置lOmin，去上清液，再加入M9緩沖液，搖勻后靜置lOmin，再去上清液，再加入M9緩沖液搖勻。將兩組樣品取出分別涂布于含有E. coli 0P50的NGM固體培養(yǎng)基上，在生化培養(yǎng)箱(16°C -25°C )中培養(yǎng)直到線蟲長到可以挑出的長度為止，將線蟲挑出，分別放入新的含有E. coli 0P50的NGM固體培養(yǎng)基上，生化培養(yǎng)箱(16°C-25°C )中培養(yǎng)，每隔一天將線蟲挑出到新的含E. coli 0P50NGM固體培養(yǎng)基上，直到產(chǎn)卵期結(jié)束。丟失的線蟲、因爬到培養(yǎng)皿壁而死亡的線蟲以及“蟲袋”(worm bag)應(yīng)從統(tǒng)計數(shù)據(jù)中排除。采用體視顯微鏡所帶的成像軟件對秀麗線蟲進(jìn)行錄像，進(jìn)行如下指標(biāo)的測定
(I)甾體類激素對秀麗線蟲生殖系統(tǒng)的影響
A、從秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)到開始產(chǎn)卵時所需要的時間。
B、后代數(shù)目后代數(shù)目即整個產(chǎn)卵期的所有卵數(shù)。
C、世代時間P0代成蟲產(chǎn)卵到其Fl代成蟲產(chǎn)卵的時間間隔。
(2)甾體類激素對秀麗線蟲運動能力的影響
A、頭部擺動頻率將已發(fā)育為成蟲的線蟲挑入溶液中，經(jīng)過Imin的恢復(fù)，記錄線蟲在Imin內(nèi)頭部擺動的次數(shù)(當(dāng)身體彎曲達(dá)到體長的一半作為I次頭部擺動)。
B、身體彎曲頻率將已發(fā)育為成蟲的線蟲挑到一個沒有0P50的NGM培養(yǎng)基上，記錄下20 s內(nèi)身體彎曲的次數(shù)。假定沿著咽泵的方向為y軸，那么線蟲爬行過程中身體沿著相應(yīng)X軸方向上的I次改變定義為I個身體彎曲。
(3)甾體類激素對秀麗線蟲生長發(fā)育的影響
A、壽命以線蟲卵孵化開始記為線蟲生命起始的0天，以用取蟲器末端輕探蟲體無反應(yīng)記為線蟲生命終止。線蟲壽命期記為線蟲從生命起始到生命終止的時間。
B、體長的測定線蟲身體僵直，無彎曲時的體長。
5、重復(fù)1、2、3、4步驟，并將秀麗線蟲的暴露時間分別修改為12h、18h、24h。獲得暴露12h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標(biāo)的影響結(jié)果；暴露18h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標(biāo)的影響結(jié)果；暴露24h，留體類激素對秀麗線蟲各項 生理指標(biāo)的影響結(jié)果。
6、采用軟件0rigin7. 5對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，如果暴露在留體類激素中的秀麗線蟲的生理指標(biāo)與沒有暴露在留體類激素中的秀麗線蟲的生理指標(biāo)對比具有顯著性差異，則說明甾體類激素對秀麗線蟲有安全性危害；如果沒有顯著性差異，則說明甾體類激素對秀麗線蟲沒有安全性危害。
二、利用秀麗線蟲生物模型對食品中留體類激素污染物進(jìn)行安全性危害檢測的方法
I、重復(fù)技術(shù)方案一中的步驟I獲得的同步化秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)蟲液。
2、將新鮮的實驗用食品清洗干凈，用不銹鋼手術(shù)刀切片，用濾紙濾干水分，取適量置于均質(zhì)器中絞成泥狀，置于離心管中，加入體積百分濃度為I %的二甲基亞砜中，用玻棒攪拌均勻，漩渦振蕩lmin，置于55°C水浴中保溫20min，取出漩渦振蕩20min，以3000rpm離心20min，吸出上清液為留體類激素提取液，并濃縮到濃度為80%以上。
3、將秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)蟲液暴露于留體類激素提取液中
秀麗線蟲采用液體暴露方法進(jìn)行暴露，設(shè)置兩組樣品，第一組為暴露組用無菌的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入獲得的處于秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)的蟲液及E. coli 0P50及液體NGM培養(yǎng)液及留體類激素提取液，并混勻；第二組為空白對照組用無菌的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入獲得的處于秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)的蟲液及E. coli 0P50及液體NGM培養(yǎng)液。將這兩組樣品放入生化培養(yǎng)箱(16°C -25°C )中暴露培養(yǎng)6h后分別用移液槍將樣品取出，置于離心管中。
4、重復(fù)技術(shù)方案一中的步驟4、5、6。
三、利用秀麗線蟲生物模型對飼料中甾體類激素污染物進(jìn)行安全性危害檢測的方法
I、重復(fù)技術(shù)方案一中的步驟I獲得同步化的秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)蟲液。
2、取飼料于具塞離心管中，加入氯仿，劇烈振搖并進(jìn)行自然蒸發(fā)。再加入100%酒精溶解留體化合物(濃縮1000倍)。取出上清溶液，為留體類激素提取液。將所提取的液體放至于通風(fēng)櫥內(nèi)將其風(fēng)干，用體積百分濃度為I %的二甲基亞砜溶解殘留物，并濃縮到濃度為80%以上。
3、將秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)蟲液暴露于留體類激素提取液中
秀麗線蟲采用液體暴露方法進(jìn)行暴露，設(shè)置兩組樣品，第一組為暴露組用無菌的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入獲得的處于秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)的蟲液及E. coli 0P50及液體NGM培養(yǎng)液及留體類激素提取液，并混勻；第二組為空白對照組用無菌的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入獲得的處于秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)的蟲液及E. coli 0P50及液體NGM培養(yǎng)液。將這兩組樣品放入生化培養(yǎng)箱(16°C-25°C)中暴露培養(yǎng)6h后分別用移液槍將樣品取出，置于離心管中。
4、重復(fù)技術(shù)方案一中的步驟4、5、6。
本發(fā)明的有益效果是
I、秀麗線蟲是第一個基因體完全被定序的多細(xì)胞真核生物，有編碼基因19717個，大約35%的基因在人體中具有同系物，可作為研究 人的各種生命活動、生命現(xiàn)象的優(yōu)秀模型生物，敏感性高，對研究留體類激素對人類健康的影響具有重大意義。
2、實驗過程周期短、高效、簡潔、方便、對儀器要求少(體視顯微鏡)，成本低，應(yīng)用價值大；實驗結(jié)果的觀測直觀，暴露在留體類激素中的秀麗線蟲的生理指標(biāo)與沒有暴露在甾體類激素中的秀麗線蟲的生理指標(biāo)具有顯著性差異，從不同側(cè)面真實的反映了留體類激素對秀麗線蟲生殖系統(tǒng)及生長發(fā)育的影響。
3、以往利用秀麗線蟲評價樣品毒性的實驗是對處于幼蟲第四期(L4期)的秀麗線蟲進(jìn)行樣品暴露，本實驗是對處于幼蟲第一期(LI期)的秀麗線蟲進(jìn)行留體類激素的暴露，測定秀麗線蟲從幼蟲第一期(LI期)到開始產(chǎn)卵的這段時間及世代時間，來鑒定在留體類激素影響下的生物早熟現(xiàn)象；測定秀麗線蟲的后代數(shù)目，來鑒定留體類激素對生物體生殖機(jī)能的危害；測定秀麗線蟲其他生理指標(biāo)的變化，來鑒定留體類激素對秀麗線蟲生長發(fā)育的影響。
具體實施方式
實施例I :用秀麗線蟲建立雌二醇純品生物模型
I、獲得同步化的秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)蟲液
將正在產(chǎn)卵期的秀麗線蟲雌雄同體成蟲用M9緩沖液從90mm NGM培養(yǎng)板中洗下，1500rpm離心lmin，棄去上清。如上法再用M9緩沖液清洗一次后將含秀麗線蟲的M9緩沖液定容至500 ii I于I. 5ml EP管內(nèi)。加入裂解液500 U 1，上下顛倒混勻3_5min后1500rpm離心3min,棄去上清,收集底部沉淀。沉淀改用無菌的S-Medium反復(fù)清洗2_3次至pH值至7. 0，此時秀麗線蟲蟲體已被裂解而蟲卵仍然保存完好。將含有秀麗線蟲蟲卵的無菌的S-Medium溶液放于20°C培養(yǎng)8_12h。由于沒有食物，蟲卵孵化以后會全部停止在幼蟲第一期，1500rpm離心3min收集幼蟲。
2、將雌二醇純品溶于體積百分濃度為I %的二甲基亞砜中。
3、將秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)蟲液暴露于雌二醇中
秀麗線蟲采用液體暴露方法進(jìn)行暴露，設(shè)置兩組樣品，第一組為暴露組取96孔板，每孔加入I步驟收集獲得的處于幼蟲第一期(LI期)的蟲液100 yl，E. coli 0P50到0D600 = 0. 250iU，液體NGM培養(yǎng)液49iU，雌二醇溶液liil，并混勻。將幼蟲暴露于四個不同濃度的雌二醇中，雌二醇終濃度分別為0. lng/ml、l. Ong/ml>IOng/ml>20ng/ml共四個樣品，每個樣品設(shè)四個平行，20°C暴露培養(yǎng)6h后分別用移液槍將樣品取出，每個樣品的四個平行置入同一個15ml離心管中，得到四個不同濃度的樣品。第二組為空白對照組取96孔板，每孔加入I步驟收集獲得的處于幼蟲第一期(LI期)的蟲液100 u I E. coli 0P50到0D600 = 0. 250 u 1，液體NGM培養(yǎng)液50 yl。設(shè)四個平行，20°C暴露培養(yǎng)6h后分別用移液槍將四個平行樣品取出，四個平行置入同一個15ml離心管中。[0050]4、分別向離心管中加入4ml M9緩沖液，搖勻后靜置lOmin，去上清液，再加入4mlM9緩沖液，搖勻后靜置lOmin，再去上清液，再加入適量M9緩沖液搖勻。每個樣品中取出100 ill涂布于含有150 ill E.coli 0P50的NGM固體培養(yǎng)基上，20°C培養(yǎng)直到線蟲長到可以挑出的長度為止，將線蟲挑出，放入新的含有150 ill E.coli 0P50的NGM固體培養(yǎng)基上，此時的每個樣品再設(shè)四個平行，每個平行中挑入十只線蟲，20°C培養(yǎng)，每隔一天將線蟲挑出到新的含有150iU E.coli 0P50 NGM固體培養(yǎng)基上，直到產(chǎn)卵期結(jié)束。丟失的線蟲、因爬到培養(yǎng)皿壁而死亡的線蟲以及“蟲袋”(worm bag)應(yīng)從統(tǒng)計數(shù)據(jù)中排除。采用體視顯微鏡所帶的成像軟件對秀麗線蟲進(jìn)行3min的錄像，進(jìn)行如下指標(biāo)的測定
(I)甾體類激素對秀麗線蟲生殖系統(tǒng)的影響
A、從秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)幼蟲到開始產(chǎn)卵時所需要的時間。
B、后代數(shù)目即整個產(chǎn)卵期的所有卵數(shù)。
C、世代時間P0代成蟲產(chǎn)卵到其Fl代成蟲產(chǎn)卵的時間間隔。
(2)甾體類激素對秀麗線蟲運動能力的影響
A、頭部擺動頻率將已發(fā)育為成蟲的線蟲挑入溶液中，經(jīng)過Imin的恢復(fù)，記錄線蟲在Imin內(nèi)頭部擺動的次數(shù)(當(dāng)身體彎曲達(dá)到體長的一半作為I次頭部擺動)。
B、身體彎曲頻率將已發(fā)育為成蟲的線蟲挑到一個沒有0P50的NGM培養(yǎng)基上，記錄下20s內(nèi)身體彎曲的次數(shù)。假定沿著咽泵的方向為y軸，那么線蟲爬行過程中身體沿著相應(yīng)X軸方向上的I次改變定義為I個身體彎曲。
(3)甾體類激素對秀麗線蟲生長發(fā)育的影響
A、壽命以線蟲卵孵化開始記為線蟲生命起始的0天，以用取蟲器末端輕探蟲體無反應(yīng)記為線蟲生命終止。線蟲壽命期記為線蟲從生命起始到生命終止的時間。
B、體長的測定線蟲身體僵直，無彎曲時的體長。
5、重復(fù)1、2、3、4步驟，并將秀麗線蟲的暴露時間分別修改為12h、18h、24h。獲得暴露12h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標(biāo)的影響結(jié)果；暴露18h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標(biāo)的影響結(jié)果；暴露24h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標(biāo)的影響結(jié)果。
6、采用軟件0rigin7. 5對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，如果暴露在留體類激素中的秀麗線蟲的生理指標(biāo)與沒有暴露在留體類激素中的秀麗線蟲的生理指標(biāo)對比具有顯著性差異，則說明甾體類激素對秀麗線蟲有安全性危害；如果沒有顯著性差異，則說明甾體類激素對秀麗線蟲沒有安全性危害。
實施例2 :用秀麗線蟲建立豬肉中甾體類激素生物模型
I、獲得同步化的秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)蟲液
將正在產(chǎn)卵期的秀麗線蟲雌雄同體成蟲用M9緩沖液從90mm NGM培板中洗下，1500rpm離心lmin，棄去上清。如上法再用M9緩沖液清洗一次后將含秀麗線蟲的M9緩沖液定容至500 ii I于I. 5ml EP管內(nèi)。加入裂解液500 U 1，上下顛倒混勻3_5min后1500rpm離心3min,棄去上清,收集底部沉淀。沉淀改用無菌的S-Medium反復(fù)清洗2_3次至pH值至7. 0，此時秀麗線蟲蟲體已被裂解而蟲卵仍然保存完好。將含有秀麗線蟲蟲卵的無菌的S-Medium溶液放于20°C培養(yǎng)8_12h。由于沒有食物，蟲卵孵化以后會全部停止在幼蟲第一期(LI期),1500rpm離心3min收集幼蟲。
2、肉類的處理將新鮮的實驗用肉類清洗干凈，用不銹鋼手術(shù)刀切取可食肌肉部分，用濾紙濾干水分，取適量于均質(zhì)器中絞成肉糜狀，稱取IOg置于離心管中，加入體積百分濃度為1%的二甲基亞砜中，用玻棒攪拌均勻，漩渦振蕩lmin，置于55°C水浴中保溫20min，取出漩渦振蕩20min，以3000rpm離心20min，吸出上清液為甾體類激素提取液，并濃縮到適宜濃度。
3、將秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)蟲液暴露于留體類激素提取液中
秀麗線蟲采用液體暴露方法進(jìn)行暴露，設(shè)置兩組樣品，第一組為暴露組取96孔板，每孔加入I步驟收集獲得的處于幼蟲第一期(LI期)的蟲液100 yl，E. coli 0P50到0D600 = 0. 250 u 1，液體NGM培養(yǎng)液49 yl，留體類激素提取液I U 1，并混勻。共設(shè)四個平行，20°C暴露培養(yǎng)6h后分別用移液槍將平行樣品取出，四個平行置入同一個15ml離心管中。第二組為空白對照組取96孔板，每孔加入I步驟收集獲得的處于幼蟲第一期(LI期)的蟲液IOOii 1，E. coli 0P50到0D600 = 0. 2 50 y 1，液體NGM培養(yǎng)液50 y I。設(shè)四個平行，20°C暴露培養(yǎng)6h后分別用移液槍將四個平行樣品取出，四個平行置入同一個15ml離心管中。4、分別向離心管中加入4ml M9緩沖液，搖勻后靜置lOmin，去上清液，再加入4mlM9緩沖液，搖勻后靜置lOmin，再去上清液，再加入適量M9緩沖液搖勻。每個樣品中取出100 ill涂布于含有150 ill E.coli 0P50的NGM固體培養(yǎng)基上，20°C培養(yǎng)直到線蟲長到可以挑出的長度為止，將線蟲挑出，放入新的含有150 ill E.coli 0P50的NGM固體培養(yǎng)基上，此時的每個樣品再設(shè)四個平行，每個平行中放入十只線蟲，20°C培養(yǎng)，每隔一天將線蟲挑出到新的含有150iU E.coli 0P50 NGM固體培養(yǎng)基上，直到產(chǎn)卵期結(jié)束。丟失的線蟲、因爬到培養(yǎng)皿壁而死亡的線蟲以及“蟲袋”(worm bag)應(yīng)從統(tǒng)計數(shù)據(jù)中排除。采用體視顯微鏡所帶的成像軟件對秀麗線蟲進(jìn)行3min的錄像，進(jìn)行如下指標(biāo)的測定(I)甾體類激素對秀麗線蟲生殖系統(tǒng)的影響
A、從秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)到開始產(chǎn)卵時所需要的時間。
B、后代數(shù)目即整個產(chǎn)卵期的所有卵數(shù)。
C、世代時間P0代成蟲產(chǎn)卵到其Fl代成蟲產(chǎn)卵的時間間隔。
(2)甾體類激素對秀麗線蟲運動能力的影響
A、頭部擺動頻率將已發(fā)育為成蟲的線蟲挑入溶液中，經(jīng)過Imin的恢復(fù)，記錄線蟲在Imin內(nèi)頭部擺動的次數(shù)(當(dāng)身體彎曲達(dá)到體長的一半作為I次頭部擺動)。
B、身體彎曲頻率將已發(fā)育為成蟲的線蟲挑到一個沒有0P50的NGM培養(yǎng)基上，記錄下20 s內(nèi)身體彎曲的次數(shù)。假定沿著咽泵的方向為y軸，那么線蟲爬行過程中身體沿著相應(yīng)X軸方向上的I次改變定義為I個身體彎曲。
(3)甾體類激素對秀麗線蟲生長發(fā)育的影響
A、壽命以線蟲卵孵化開始記為線蟲生命起始的0天，以用取蟲器末端輕探蟲體無反應(yīng)記為線蟲生命終止。線蟲壽命期記為線蟲從生命起始到生命終止的時間。
B、體長的測定線蟲身體僵直，無彎曲時的體長。
5、重復(fù)1、2、3、4步驟，并將秀麗線蟲的暴露時間分別修改為12h、18h、24h。獲得暴露12h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標(biāo)的影響結(jié)果；暴露18h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標(biāo)的影響結(jié)果；暴露24h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標(biāo)的影響結(jié)果。
6、采用軟件0rigin7. 5對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，如果暴露在留體類激素中的秀麗線蟲的生理指標(biāo)與沒有暴露在留體類激素中的秀麗線蟲的生理指標(biāo)對比具有顯著性差異，則說明甾體類激素對秀麗線蟲有安全性危害；如果沒有顯著性差異，則說明甾體類激素對秀麗線蟲沒有安全性危害。
實施例3 :用秀麗線蟲建立奶粉中留體類激素生物模型
I、獲得同步化的秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)蟲液
將正在產(chǎn)卵期的秀麗線蟲雌雄同體成蟲用M9緩沖液從90mmNGM培養(yǎng)板中洗下，1500rpm離心lmin，棄去上清。如上法再用M9緩沖液清洗一次后將含秀麗線蟲的M9緩沖液定容至500 ii I于I. 5ml EP管內(nèi)。加入裂解液500 U 1，上下顛倒混勻3_5min后1500rpm離心3min,棄去上清,收集底部沉淀。沉淀改用無菌的S-Medium反復(fù)清洗2_3次至pH值至7. 0，此時秀麗線蟲蟲體已被裂解而蟲卵仍然保存完好。將含有秀麗線蟲蟲卵的無菌的S-Medium溶液放于20°C培養(yǎng)8_12h。由于沒有食物，蟲卵孵化以后會全部停止在幼蟲第一期(LI期),1500rpm離心3min收集幼蟲。
2、準(zhǔn)確稱取5g(精確到0. Ig)奶粉于50mL具塞離心管中，加入50mL氯仿，劇烈振搖并進(jìn)行自然蒸發(fā)。再加入ImL 100%酒精溶解甾體化合物(濃縮1000倍)。取出上清溶液，為留體類激素提取液。將所提取的液體放至于通風(fēng)櫥內(nèi)將其風(fēng)干，用體積百分濃度為I %的二甲基亞砜溶解殘留物，并濃縮到適宜濃度。
3、將秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)蟲液暴露于留體類激素提取液中
秀麗線蟲采用液體暴露方法進(jìn)行暴露，設(shè)置兩組樣品，第一組為暴露組取96孔板，每孔加入I步驟收集獲得的處于幼蟲第一期(LI期)的蟲液100 yl，E. coli 0P50到 0D600 = 0. 250 u 1，液體NGM培養(yǎng)液49 yl，留體類激素提取液I U 1，共設(shè)四個平行，20°C暴露培養(yǎng)6h后分別用移液槍將樣品取出，四個平行置入同一個15ml離心管中。第二組為空白對照組取96孔板，每孔加入I步驟收集獲得的處于幼蟲第一期(LI期)的蟲液100 yl，E.coli 0P50到0D600 = 0. 2 50 y 1，液體NGM培養(yǎng)液50 y I。設(shè)四個平行，20°C暴露培養(yǎng)6h后分別用移液槍將四個平行樣品取出，四個平行置入同一個15ml離心管中。
4、分別向離心管中加入4ml M9緩沖液，搖勻后靜置lOmin，去上清液，再加入4mlM9緩沖液，搖勻后靜置lOmin，再去上清液，再加入適量M9緩沖液搖勻。每個樣品中取出100 ill涂布于含有150 ill E.coli 0P50的NGM固體培養(yǎng)基上，20°C培養(yǎng)直到線蟲長到可以挑出的長度為止，將線蟲挑出，放入新的含有150 ill E.coli 0P50的NGM固體培養(yǎng)基上，此時的每個樣品再設(shè)四個平行，每個平行中放入十只線蟲，20°C培養(yǎng)，每隔一天將線蟲挑出到新的含有150iU E.coli 0P50 NGM固體培養(yǎng)基上，直到產(chǎn)卵期結(jié)束。丟失的線蟲、因爬到培養(yǎng)皿壁而死亡的線蟲以及“蟲袋”(worm bag)應(yīng)從統(tǒng)計數(shù)據(jù)中排除。采用體視顯微鏡所帶的成像軟件對秀麗線蟲進(jìn)行3min的錄像，進(jìn)行如下指標(biāo)的測定
(I)甾體類激素對秀麗線蟲生殖系統(tǒng)的影響
A、從秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)到開始產(chǎn)卵時所需要的時間。
B、后代數(shù)目即整個產(chǎn)卵期的所有卵數(shù)。
C、世代時間P0代成蟲產(chǎn)卵到其Fl代成蟲產(chǎn)卵的時間間隔。
(2)甾體類激素對秀麗線蟲運動能力的影響
A、頭部擺動頻率將已發(fā)育為成蟲的線蟲挑入溶液中，經(jīng)過Imin的恢復(fù)，記錄線蟲在Imin內(nèi)頭部擺動的次數(shù)(當(dāng)身體彎曲達(dá)到體長的一半作為I次頭部擺動)。
B、身體彎曲頻率將已發(fā)育為成蟲的線蟲挑到一個沒有0P50的NGM培養(yǎng)基上，記錄下20 s內(nèi)身體彎曲的次數(shù)。假定沿著咽泵的方向為y軸，那么線蟲爬行過程中身體沿著相應(yīng)X軸方向上的I次改變定義為I個身體彎曲。
(3)甾體類激素對秀麗線蟲生長發(fā)育的影響
A、壽命以線蟲卵孵化開始記為線蟲 生命起始的0天，以用取蟲器末端輕探蟲體無反應(yīng)記為線蟲生命終止。線蟲壽命期記為線蟲從生命起始到生命終止的時間。
B、體長的測定線蟲身體僵直，無彎曲時的體長。
5、重復(fù)1、2、3、4步驟，并將秀麗線蟲的暴露時間分別修改為12h、18h、24h。獲得暴露12h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標(biāo)的影響結(jié)果；暴露18h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標(biāo)的影響結(jié)果；暴露24h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標(biāo)的影響結(jié)果。
6、采用軟件0rigin7. 5對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，如果暴露在留體類激素中的秀麗線蟲的生理指標(biāo)與沒有暴露在留體類激素中的秀麗線蟲的生理指標(biāo)對比具有顯著性差異，則說明甾體類激素對秀麗線蟲有安全性危害；如果沒有顯著性差異，則說明甾體類激素對秀麗線蟲沒有安全性危害。
實施例4 :用秀麗線蟲建立雞飼料中留體類激素生物模型
I、獲得同步化的秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)蟲液
將正在產(chǎn)卵期的秀麗線蟲雌雄同體成蟲用M9緩沖液從90mm NGM培養(yǎng)板中洗下，1500rpm離心lmin，棄去上清。如上法再用M9緩沖液清洗一次后將含秀麗線蟲的M9緩沖液定容至500 ii I于I. 5ml EP管內(nèi)。加入裂解液500 U 1，上下顛倒混勻3_5min后1500rpm離心3min,棄去上清,收集底部沉淀。沉淀改用無菌的S-Medium反復(fù)清洗2_3次至pH值至7. 0，此時秀麗線蟲蟲體已被裂解而蟲卵仍然保存完好。將含有秀麗線蟲蟲卵的無菌的S-Medium溶液放于20°C培養(yǎng)8_12h。由于沒有食物，蟲卵孵化以后會全部停止在幼蟲第一期(LI期),1500rpm離心3min收集幼蟲。
2、準(zhǔn)確稱取5g(精確到0. Ig)飼料于50mL具塞離心管中，加入50mL氯仿，劇烈振搖并進(jìn)行自然蒸發(fā)。再加入ImL 100%酒精溶解甾體化合物(濃縮1000倍)。取出上清溶液，為留體類激素提取液。將所提取的液體放至于通風(fēng)櫥內(nèi)將其風(fēng)干，用體積百分濃度為I %的二甲基亞砜溶解殘留物，并濃縮到適宜濃度。
3、將秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)蟲液暴露于留體類激素提取液中
秀麗線蟲采用液體暴露方法進(jìn)行暴露，設(shè)置兩組樣品，第一組為暴露組取96孔板，每孔加入I步驟收集獲得的處于幼蟲第一期(LI期)的蟲液100 yl，E. coli 0P50到0D600 = 0. 250 u 1，液體NGM培養(yǎng)液49 yl，留體類激素提取液I U 1，共設(shè)四個平行，20°C暴露培養(yǎng)6h后分別用移液槍將樣品取出，四個平行置入同一個15ml離心管中。第二組為空白對照組取96孔板，每孔加入I步驟收集獲得的處于幼蟲第一期(LI期)的蟲液100 yl，E.coli 0P50到0D600 = 0. 2 50 y 1，液體NGM培養(yǎng)液50 y I。設(shè)四個平行，20°C暴露培養(yǎng)6h后分別用移液槍將四個平行樣品取出，四個平行置入同一個15ml離心管中。
4、分別向離心管中加入4ml M9緩沖液，搖勻后靜置lOmin，去上清液，再加入4mlM9緩沖液，搖勻后靜置lOmin，再去上清液，再加入適量M9緩沖液搖勻。每個樣品中取出100 ill涂布于含有150 ill E.coli 0P50的NGM固體培養(yǎng)基上，20°C培養(yǎng)直到線蟲長到可以挑出的長度為止，將線蟲挑出，放入新的含有150 ill E.coli 0P50的NGM固體培養(yǎng)基上，此時的每個樣品再設(shè)四個平行，每個平行中放入十只線蟲，20°C培養(yǎng)，每隔一天將線蟲挑出到新的含有150iU E.coli 0P50 NGM固體培養(yǎng)基上，直到產(chǎn)卵期結(jié)束。丟失的線蟲、因爬到培養(yǎng)皿壁而死亡的線蟲以及“蟲袋”(worm bag)應(yīng)從統(tǒng)計數(shù)據(jù)中排除。采用體視顯微鏡所帶的成像軟件對秀麗線蟲進(jìn)行3min的錄像，進(jìn)行如下指標(biāo)的測定
(I)甾體類激素對秀麗線蟲生殖系統(tǒng)的影響
A、從秀麗線蟲幼蟲第一期(LI期)到開始產(chǎn)卵時所需要的時間。
B、后代數(shù)目即整個產(chǎn)卵期的所有卵數(shù)。
C、世代時間P0代成蟲產(chǎn)卵到其Fl代成蟲產(chǎn)卵的時間間隔。
(2)甾體類激素對秀麗線蟲運動能力的影響
A、頭部擺動頻率將已發(fā)育為成蟲的線蟲挑入溶液中，經(jīng)過Imin的恢復(fù)，記錄線 蟲在Imin內(nèi)頭部擺動的次數(shù)(當(dāng)身體彎曲達(dá)到體長的一半作為I次頭部擺動)。
B、身體彎曲頻率將已發(fā)育為成蟲的線蟲挑到一個沒有0P50的NGM培養(yǎng)基上，記錄下20s內(nèi)身體彎曲的次數(shù)。假定沿著咽泵的方向為y軸，那么線蟲爬行過程中身體沿著相應(yīng)X軸方向上的I次改變定義為I個身體彎曲。
(3)甾體類激素對秀麗線蟲生長發(fā)育的影響
A、壽命以線蟲卵孵化開始記為線蟲生命起始的0天，以用取蟲器末端輕探蟲體無反應(yīng)記為線蟲生命終止。線蟲壽命期記為線蟲從生命起始到生命終止的時間。
B、體長的測定線蟲身體僵直，無彎曲時的體長。
5、重復(fù)1、2、3、4步驟，并將秀麗線蟲的暴露時間分別修改為12h、18h、24h。獲得暴露12h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標(biāo)的影響結(jié)果；暴露18h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標(biāo)的影響結(jié)果；暴露24h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標(biāo)的影響結(jié)果。
6、采用軟件0rigin7. 5對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，如果暴露在留體類激素中的秀麗線蟲的生理指標(biāo)與沒有暴露在留體類激素中的秀麗線蟲的生理指標(biāo)對比具有顯著性差異，則說明甾體類激素對秀麗線蟲有安全性危害；如果沒有顯著性差異，則說明甾體類激素對秀麗線蟲沒有安全性危害。
權(quán)利要求
1.一種用秀麗線蟲生物模型對留體類激素進(jìn)行檢測的方法，其方法是 A、利用秀麗線蟲生物模型對留體類激素純品進(jìn)行安全性危害檢測的方法 a、獲得同步化的秀麗線蟲幼蟲第一期蟲液，將正在產(chǎn)卵期的秀麗線蟲雌雄同體成蟲用M9緩沖液從NGM培養(yǎng)板中洗下，1500rpm離心Imin，棄去上清；如上法再用M9緩沖液清洗一次后將含秀麗線蟲的M9bufTer溶液定容于容器內(nèi)，并加入等體積裂解液，上下顛倒混勻3-5min后1500rpm離心3min,棄去上清，收集底部沉淀；沉淀改用無菌的S-Medium反復(fù)清洗2-3次至pH值達(dá)到中性，此時秀麗線蟲蟲體已被裂解而蟲卵仍然保存完好；將含有秀麗線蟲蟲卵的無菌的S-Medium溶液放于生化培養(yǎng)箱內(nèi)16°C _25°C培養(yǎng)8_12h ;由于沒有食物，蟲卵孵化以后會全部停止在秀麗線蟲幼蟲第一期，1500rpm離心3min收集幼蟲，備用； b、將留體類激素溶于體積百分濃度為1%的二甲基亞砜中； C、將秀麗線蟲幼蟲第一期蟲液暴露于留體類激素純品中 秀麗線蟲采用液體暴露方法進(jìn)行暴露，設(shè)置兩組樣品，第一組為暴露組，用無菌的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入a步驟收集獲得的處于秀麗線蟲幼蟲第一期的蟲液及E. coli 0P50及液體NGM培養(yǎng)液及留體類激素純品，并混勻，留體類激素的終濃度為0. lng/ml-20ng/ml ;第二組為空白對照組，用無菌的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入a步驟收集獲得的處于秀麗線蟲幼蟲第一期的蟲液及E. coli 0P50及液體NGM培養(yǎng)液；將這兩組樣品放入生化培養(yǎng)箱16°C -25°C中暴露培養(yǎng)6h后分別用移液槍將樣品取出，置于離心管中； d、分別向兩組樣品的離心管中加入M9緩沖液，搖勻后靜置IOmin，去上清液，再加入M9緩沖液，搖勻后靜置lOmin，再去上清液，再加入M9緩沖液搖勻；樣品中取出涂布于含有E.coli 0P50的NGM固體培養(yǎng)基上，在生化培養(yǎng)箱16°C _25°C中培養(yǎng)直到線蟲長到可以挑出的長度為止，將線蟲挑出，放入新的含有E. coli 0P50的NGM固體培養(yǎng)基上，生化培養(yǎng)箱160C _25°C中培養(yǎng)，每隔一天將線蟲挑出到新的含E. coli 0P50NGM固體培養(yǎng)基上，直到產(chǎn)卵期結(jié)束；丟失的線蟲、因爬到培養(yǎng)皿壁而死亡的線蟲以及蟲袋應(yīng)從統(tǒng)計數(shù)據(jù)中排除；采用體視顯微鏡所帶的成像軟件對秀麗線蟲進(jìn)行錄像，進(jìn)行如下指標(biāo)的測定 (1)甾體類激素對秀麗線蟲生殖系統(tǒng)的影響 (A)、從秀麗線蟲幼蟲第一期幼蟲到開始產(chǎn)卵時所需要的時間； (B)、后代數(shù)目，后代數(shù)目即整個產(chǎn)卵期的所有卵數(shù)； (C)、世代時間，PO代成蟲產(chǎn)卵到其Fl代成蟲產(chǎn)卵的時間間隔； (2)甾體類激素對秀麗線蟲運動能力的影響 (A)、頭部擺動頻率，將已發(fā)育為成蟲的線蟲挑入溶液中，經(jīng)過Imin的恢復(fù)，記錄線蟲在Imin內(nèi)頭部擺動的次數(shù)，當(dāng)身體彎曲達(dá)到體長的一半作為I次頭部擺動； (B)、身體彎曲頻率，將已發(fā)育為成蟲的線蟲挑到一個沒有0P50的NGM培養(yǎng)基上，記錄下20s內(nèi)身體彎曲的次數(shù)，假定沿著咽泵的方向為y軸，那么線蟲爬行過程中身體沿著相應(yīng)X軸方向上的I次改變定義為I個身體彎曲； (3)甾體類激素對秀麗線蟲生長發(fā)育的影響 (A)、壽命，以線蟲卵孵化開始記為線蟲生命起始的0天，以用取蟲器末端輕探蟲體無反應(yīng)記為線蟲生命終止；線蟲壽命期記為線蟲從生命起始到生命終止的時間； (B)、體長的測定，線蟲身體僵直，無彎曲時的體長； e、重復(fù)a、b、C、d步驟，并將秀麗線蟲的暴露時間分別修改為12h、18h、24h;獲得暴露12h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標(biāo)的影響結(jié)果；暴露18h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標(biāo)的影響結(jié)果；暴露24h，留體類激素對秀麗線蟲各項生理指標(biāo)的影響結(jié)果； f、采用軟件Origin7. 5對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，如果暴露后秀麗線蟲的生理指標(biāo)與暴露前的生理指標(biāo)具有顯著性差異，則說明甾體類激素對秀麗線蟲有安全性危害；如果沒有顯著性差異，則說明留體類激素對秀麗線蟲沒有安全性危害； B、利用秀麗線蟲生物模型對食品中留體類激素污染物進(jìn)行安全性危害檢測的方法 a、重復(fù)技術(shù)方案A中的步驟a獲得的同步化秀麗線蟲幼蟲第一期蟲液； b、將新鮮的實驗用食品清洗干凈，用手術(shù)刀切片，用濾紙濾干水分，置于均質(zhì)器中絞成泥狀，置于離心管中，加入體積百分濃度為I %的二甲基亞砜中，用玻棒攪拌均勻，漩渦振蕩Imin,置于55°C水浴中保溫20min,取出鏇潤振蕩20min,以3000rpm離心20min,吸出上清液為留體類激素提取液，并濃縮到濃度為80%以上； C、將秀麗線蟲幼蟲第一期蟲液暴露于留體類激素提取液中 秀麗線蟲采用液體暴露方法進(jìn)行暴露，設(shè)置兩組樣品，第一組為暴露組，用無菌的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入獲得的處于秀麗線蟲幼蟲第一期的蟲液及E. coli 0P50及液體NGM培養(yǎng)液及留體類激素提取液，并混勻；第二組為空白對照組，用無菌的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入獲得的處于秀麗線蟲幼蟲第一期的蟲液及E. coli 0P50及液體NGM培養(yǎng)液，將這兩組樣品放入生化培養(yǎng)箱16°C _25°C中暴露培養(yǎng)6h后分別用移液槍將樣品取出，置于離心管中； d、重復(fù)技術(shù)方案A中的步驟d、e、f。
C、利用秀麗線蟲生物模型對飼料中留體類激素污染物進(jìn)行安全性危害檢測的方法 a、重復(fù)技術(shù)方案A中的步驟a獲得同步化的秀麗線蟲幼蟲第一期蟲液； b、取飼料于具塞離心管中，加入氯仿，劇烈振搖并進(jìn)行自然蒸發(fā)，再加入100%酒精溶解留體化合物濃縮1000倍，取出上清溶液，為留體類激素提取液；將所提取的液體放至于通風(fēng)櫥內(nèi)將其風(fēng)干，用體積百分濃度為I %的二甲基亞砜溶解殘留物，并濃縮到濃度為80%以上； C、將秀麗線蟲幼蟲第一期蟲液暴露于留體類激素提取液中 秀麗線蟲采用液體暴露方法進(jìn)行暴露，設(shè)置兩組樣品，第一組為暴露組，用無菌的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入獲得的處于秀麗線蟲幼蟲第一期的蟲液及E. coli0P50及液體NGM培養(yǎng)液及甾體 類激素提取液，并混勻；第二組為空白對照組，用無菌的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入獲得的處于秀麗線蟲幼蟲第一期的蟲液及E. coli 0P50及液體NGM培養(yǎng)液，將這兩組樣品放入生化培養(yǎng)箱16°C _25°C中暴露培養(yǎng)6h后分別用移液槍將樣品取出，置于離心管中； d、重復(fù)技術(shù)方案A中的步驟d、e、f。
專利摘要
一種用秀麗線蟲建立食品與飼料中甾體類激素污染物生物模型及方法，屬于食品、飼料安全檢測技術(shù)領(lǐng)域：
，其模型是用秀麗線蟲建立食品與飼料中甾體類激素污染物生物模型。其方法是用秀麗線蟲建立甾體類激素純品生物模型，用秀麗線蟲建立食品中甾體類激素生物模型，用秀麗線蟲建立飼料中甾體類激素生物模型。有益效果是1、對研究甾體類激素對人類健康的影響具有重大意義。2、實驗過程周期短、高效、簡潔、方便、對儀器要求少，成本低，應(yīng)用價值大。3、對處于幼蟲第一期的秀麗線蟲進(jìn)行甾體類激素的暴露，測定秀麗線蟲從幼蟲第一期到開始產(chǎn)卵的這段時間及世代時間，來鑒定在甾體類激素影響下的生物早熟現(xiàn)象。
文檔編號A01K67/033GKCN101982075 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 201010276272
公開日2012年10月3日 申請日期2010年9月9日
發(fā)明者于化東, 于源華, 姚健, 宋禹, 張昊, 張淑華, 徐任, 李金海, 楊佳新, 林銘燕 申請人:長春理工大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (2),