專利名稱:新穎的微生物的制作方法
本發(fā)明是涉及蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thurimgiensis，下文稱B.T)雜交菌株、它們的制備、含有雜交菌株的殺蟲劑成分以及它們的使用。
更明確地說，本發(fā)明涉及帶有蘇云金菌柯氏變種(B.T.Kurs-taki)δ-內毒素編碼基因的一種質粒和蘇云金菌嗜暗變種(B.T.tenebrionis)δ-內毒素編碼基因的一種質粒的雜交細菌細胞;通過產生內毒素晶體的柯氏變種和產生內毒素晶體的嗜暗變種之間的接合作用而獲得這種雜交株，并且雜交株還能夠產生柯氏變種和嗜暗變種各自典型的δ-內毒素晶體?？率献兎N的δ-內毒素晶體具有特有的雙錐形，而嗜暗變種晶體典型的平行六面體(或正方體)外形。本發(fā)明的B.T雜交菌株可以對其親代菌株柯氏變種和嗜暗變種所控制的害蟲進行生物防治。
以常規(guī)方式通過產生δ-內毒素的柯氏變種和產生δ-內毒素的嗜暗變種的接合，以及用完全知道的分離技術分離雜交株，來獲得本發(fā)明的B.T.雜菌菌株。接合技術在遺傳工程領域內也已有很好的了解(如見Gonzatez J.M.and Carlton B.C.，1982.Plasmid transfer in Bacillus thuringiensis，85-95.in Genetic and Cellular Technology一書，L.P.Gape編Genetic Exchange vol.1.U.N.Streips等編，Marcel Dekker，Inc.New York and Basel)。
常規(guī)來說，接合作用是由接合質粒傳遞的。這種接合質粒的一個合適例子是從糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)得到的pAMβ1，一般稱為β-質粒。然后這質粒用已知技術(例如由H.-M.Fisher發(fā)明的技術，1983，Plasmid und Plasmidübertragung bei Bacillus thuringiensis.博士論文ETH Nr.7375，Swiss Federal Institute of Technology，ADAG Administration and Druck AG.共83頁?；虬凑丈鲜龅腉onzalez等一文)引入到B.T.菌株內。這樣獲得的含有β-質粒的B.T菌株在柯氏變種和嗜暗變種菌株之間的接合反應中作為給體株。
為了有利于接合體(如本發(fā)明的雜交菌株)的檢測和分離，給體菌株和受體菌株都作了遺傳標記。這些標記能以完全了解的方式被引入菌內。例如已經知道在格藍氏陰性細菌中，β-質粒給以抗紅霉素。這一特性能用來消除接合反應后不具有此特性的所有菌株。
當另外的接合反應的匹配株也作標記時，例如經過誘導或自發(fā)對四環(huán)素等某個抗菌素有抗性，通過把這微生物培養(yǎng)在含有紅霉素和四環(huán)素的適當培養(yǎng)基上，將有可能除去那些不帶這兩種遺傳標記的所有菌株(即所有非接合菌株)。唯有在這種培養(yǎng)基上能生長的微生物將是攜帶兩種標記(即抗紅霉素和四環(huán)素)的菌株。
然后可以以完全已知的方式，如通過肉眼鑒定含有B.T.柯氏變種和嗜暗變種兩種晶體類型的菌落或者文獻中已知的生物學/生物化學技術，實現(xiàn)最終分離本發(fā)明的B.T.雜交株。制備本發(fā)明雜交株的一個方便步驟是柯氏變種用嗜暗變種進行接合反應，其中給體菌株含有接合質粒，給體和受體菌株都帶有適當?shù)倪z傳選擇標記。一般來說，在本發(fā)明的接合反應過程中更傾向于用柯氏變種作為給體。
接合反應一般是在含有氮源、碳水化合物和生長因子的培養(yǎng)基中，20-40℃范圍的某一溫度下適當?shù)剡M行的。
起始材料可以常規(guī)方式得到，從已知的柯氏變種和嗜暗變種開始。
對液體培養(yǎng)基來說，通常給以通氣或振蕩，因此培養(yǎng)時間一般為4至96小時。
在下面非限定的接合反應實例中，含β-質粒的柯氏變種用作給體，該質粒作為接合質粒，具有紅霉素抗性。受體嗜暗變種是自發(fā)的四環(huán)素抗性實變株。
溫度以攝氏表示。份數(shù)以重量表示。
實例1接合反應含有糞鏈球菌接合片段pAMβ1的柯氏變種HD-73(NRRL B-4488)培養(yǎng)物2.5毫升和嗜暗變種(Deutsch Sammlung für Microorgamismen DSM 2803)一株四環(huán)素抗性的自發(fā)突變體的培養(yǎng)物2.5毫升，每一培養(yǎng)物都處于對數(shù)生長期(約5×107細胞/毫升)、混合。在醋酸纖維素濾膜(O×oid/Nuflow)(0.45微米，25毫米直徑)上過濾。過濾物在Lurla培養(yǎng)基(LA)平板上(1升Luria培養(yǎng)液含有15克瓊脂、10克酪蛋白、5克醇母浸出物、10克NaCl、0.02克胸苷)，在37℃培養(yǎng)16-24小時。
過濾物懸浮在0.5毫升液體LA(沒有瓊脂)中，用力搖勻，它的10°和10-1稀釋度加在含有50微克/毫升紅霉素和5微克/毫升四環(huán)素的LA平板上，選擇接合體。
這樣獲得的紅霉素和四環(huán)素抗性接合體放在允許產生芽孢的培養(yǎng)基上，用顯微鏡檢查δ-內霉素的存在和性質。在雜交株里，裂介之前孢子除了有嗜暗變種典型的平行六面體(立方體)晶體之外，還含有柯氏變種特有的雙錐形晶體。這些晶體的大小約2微米，在相差顯微鏡下很容易看見。
雜交株照例用肉眼鑒定很容易分離。雜交株的菌落(在LA平板上30℃培養(yǎng)16小時后)具有與嗜暗變種相同的菌落形態(tài)，而很容易與柯氏變種的菌落區(qū)分開。
嗜暗變種菌落 或雜交株 柯氏變種形狀 不規(guī)則 圓形高度 凸起 凸面邊緣 波紋形 完整表面 粗糙 光滑瓊脂糖凝膠電泳分析從雜交種提取的DNA。也可以具體地證明質粒從給體株導入到了受體株內。質粒DNA分子經溴化乙啶染色后用紫外光照射可以觀察到，并照相(見Lereclus D.Menou Gand Lecadet M-M.，1983，Mol.Gen.Genet.191，307-313)。
尤其本發(fā)明的大多數(shù)雜交株具有受體株嗜暗變種的典型的10兆道爾頓(Md)的質粒，給體菌柯氏變種具有5.6Md的質粒。攜帶柯氏變種和嗜暗變種的δ-內毒素編碼基因的質粒有大致相同的分子量，因而不容易在雜交株的質粒圖譜(plasmadogram)中區(qū)分開來。
本發(fā)明的B.T.雜交株具有殺昆蟲的有用特性。它們對易受柯氏變種以及嗜暗變種感染的害蟲都具有活性。一般來說，在活性的水平上或活性的范圍，或者兩方面，雜交種的殺蟲性能都超過接合親本菌株簡單混合所能觀察到的性能。
本發(fā)明B.T雜交選擇到的菌株具有十分令人驚奇的殺蟲性能，在下面生物測定中描述了它們對粉紋夜蛾Trichoplusia ni(苷蘭菜的尺蠖蟲)、海灰翅夜蛾Spodoptera Litteralis(埃及棉葉蟲)和辣根猿葉甲Phaedon cochleariae(芥菜甲蟲)等昆蟲幼蟲的活性。
生物測定108孢子/毫升的水懸浮液用微型噴槍噴灑到中國甘蘭的葉子上，直到液珠掉下來的程度。當噴灑液干燥時，每張葉子都攤在直徑9厘米的塑料培養(yǎng)皿中潮濕濾紙上，每皿放進10個昆蟲(處于二齡期的幼蟲)。每種昆蟲各用三個培養(yǎng)皿。
測定在25℃的氣候小室中進行，相對濕度65%，光照時間16小時。
在這種條件下，幼蟲在5天期間喂飼處理過的葉子。然后計算幼蟲的死亡率，用%表示。
所得結果總結于下面的表5天后的死亡率(%)B.T.雜交菌株 海灰翅夜蛾 粉紋夜蛾 辣根猿葉甲L21001 87 100 100L21004 90 100 100L21016 97 100 100L21017 97 100 100L21019 93 100 100
柯氏變種HD73 <1> 3 100 0嗜暗變種 <2> 0 0 100“K+t”混合物<3> 0 100 43注<1>具有β-質粒(在接合反應實例中所使用的)<2>四環(huán)素抗性菌株(在接合反應實例中所使用的)<3>只在噴灑使用之前制備的混合物，即柯氏變種(1)和嗜暗變株(2)以等比例懸浮，調到總濃度為108孢子/毫升。
上述有些雜交株已在1985年10月15日委托給農業(yè)研究培養(yǎng)物收集中心(NRRL)(Peoria，Illinois，61604，美國)保管。菌株L21004，L21017和L21019已分別定名為NRRL編號B-18011，B-18012和B-18013。
前面表中所列數(shù)據(jù)表明，雜交株L21001，L21004，L21016，L21017和L21019不僅僅對它們“親本”菌株敏感的昆蟲種類有活性，而且很奇怪，雜交株的活性一直擴大到對“親本”株不敏感的昆蟲種類，如海灰翅夜蛾。這些結果是特別令人驚訝的，因為“親本”株的簡單混合比單獨使用嗜暗變種對辣根猿葉甲的作用活性要小，并對?；页嵋苟旮緵]有活性。
因而，本發(fā)明也提供了消滅昆蟲的一種方法，包括把殺蟲有效量的本發(fā)明的雜交菌株施加到昆蟲上或它們的環(huán)境中。
本發(fā)明的B.T.雜交株以濃縮的懸浮液或粉末等殺蟲劑混合物的形式常規(guī)地進行使用。這種混合物適當?shù)睾邢♂寗詈糜袣⑾x上可接受的添加劑，如UV保護劑、表面活性劑和乳化劑。它們根據(jù)含有生物殺蟲劑的已知B.T.菌株，用常規(guī)方式制備。
這里所用的稀釋劑一詞是指液體或固體，農業(yè)上可以接受的物質，加到B.T.雜交株里可以使它們分別成為一種更容易或更佳的使用形式，把有活性的制劑稀釋成為通常的或所需要的活性強度。
值得稱贊的是本發(fā)明的B.T.雜交株，一旦用接合反應獲得，就可以在含有氮源(如干魚粉)、碳水化合物(如淀粉)和無機鹽，并調到pH7左右的適當?shù)臓I養(yǎng)培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，將更加經濟地生長和繁殖。
這種發(fā)酵在20-40℃(如30℃)的溫度下常規(guī)地進行。合適的發(fā)酵時間是24到72小時，如36小時。
把發(fā)酵液蒸發(fā)到需濃度，可以得到本發(fā)明的B.T.雜交株適當?shù)膽腋舛取?br>類似地，發(fā)酵液噴霧干燥，得到的固體經過粉碎，獲得可濕性粉末的配方，任意地加乳化劑和UV防護劑之類的東西。
這樣得到的配方里含有相當大一部分營養(yǎng)培養(yǎng)基的成分，成為稀釋劑。
或者，發(fā)酵液可以經過離心把營養(yǎng)培養(yǎng)基的較大顆粒分離開，然后如上面所指出的轉變成適當?shù)膽腋舛群涂蓾裥苑勰┑呐浞?。合適的配方是配制的產品每毫克或每毫升含有1000-40000IU。
可溶濃縮液含水的營養(yǎng)培養(yǎng)基配成含有1.86%左右的甜菜糖蜜，1.4%無油的棉籽胚乳粉，1.7%玉米浸出液的固形物和0.1%碳酸鈣，pH調到7.2-7.6范圍內，在121℃成批滅菌20-30分鐘，然后接種5%培養(yǎng)基體積的B.T.雜交株。培養(yǎng)過程加表壓為5磅/英寸2的反壓進行通氣，培養(yǎng)溫度為30℃。培養(yǎng)液冷卻到18-20℃，pH用濃硫酸調到5.5左右，用每平方英寸150目的篩過濾，過篩的培養(yǎng)液經離心除去一部分不純物質，并蒸發(fā)到具有所需效能的濃縮體積。在這濃縮物里加入按重量計算0.4%的乳化劑(如異辛基苯基聚氧化乙醇(isooctyl phenyl polyoxyethanol)和重量計算的0.8%的UV吸收劑。
可濕性粉末按上面實例獲得的蒸發(fā)了的濃縮體積進行噴霧干燥，這樣得到的技術濃縮物同10%硅膠和90%大豆蛋白構成的“載體混合物”混雜，加入載體混合物的量是根據(jù)可濕性粉末的技術濃縮物的效能和可濕性粉末所需的效能而定。
這可濕性粉末中加入0.4%(重量)的乳化劑和0.8%(重量)的UV吸收劑。
本發(fā)明中較優(yōu)的B.T.雜交株是用嗜暗變種作受體菌，柯氏變種作給體菌進行接合得到的。
權利要求
1.雜交株的蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringie nsis)細胞，含有給體B.T.柯氏變種δ-內毒素編碼的基因和嗜暗變種δ-內毒素編碼的基因。
2.按照權利要求
1的雜交株細菌細胞，能夠產生B.T.柯氏變種各自典型的δ-內毒素晶體。
3.雜交株細菌細胞，是通過產生δ-內毒素晶體的柯氏變種和產生δ-內毒素晶體的嗜暗變種的接合反應產生的，并能產生δ-內毒素，這些內毒素允許對柯氏變種和嗜暗變種親代菌株可以控制的害蟲進行生物學防治。
4.按照權利要求
1至3之一的雜交株細胞的制備方法，包括a)使柯氏變種和嗜暗變種接合，或者b)按a)所獲得的雜交株細胞，在發(fā)酵條件下的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行生長。
5.含有按照權利要求
1-3的B.T.雜交株的殺蟲劑成分。
6.消滅昆蟲的方法，包括把權利要求
1-3中所述的B.T.雜交株的殺蟲有效的量，施于昆蟲或它們的環(huán)境之中。
專利摘要
本發(fā)明提供了新穎的微生物——它們含有蘇云金菌柯氏變種δ-內毒素編碼的基因和嗜暗變種δ-內毒素的編碼基因，并提供了它們的制備方法及含有這種微生物的殺蟲劑組分和應用。
文檔編號C12P1/04GK86107242SQ86107242
公開日1987年5月13日 申請日期1986年10月29日
發(fā)明者迪米特里·卡·拉馬塔, 讓-克里斯托夫·皮奧 申請人:山道士有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan