專利名稱：一種抗生素新農(nóng)藥——寧南霉素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵工程技術(shù)。
寧南霉素屬堿性水溶性胞嘧啶核苷類抗生素，主要用于防治水稻白葉枯病，也可用于防治水稻小球菌核病、小麥白粉病、蔬菜白粉病、煙草花葉病毒病等。目前國內(nèi)外用于防治水稻白葉枯病的主要藥物是化學(xué)農(nóng)藥，以葉枯寧、葉枯凈為代表。
五十年代以來，由于化學(xué)農(nóng)藥的使用帶來環(huán)境污染，造成公害，因此，無公害農(nóng)藥-農(nóng)用抗生素的研制在國際上受到極大重視，日本是農(nóng)用抗生素研究最有成就的國家之一，為防治稻瘟病、稻紋枯病，先后投產(chǎn)了“滅瘟素s”、“多氧霉素”、“春日霉素”、“有效霉素”、“灰黃霉素”、“放線菌酮”等，但對(duì)水稻白葉枯病等未見大田試驗(yàn)報(bào)導(dǎo)，印度、中國和西方一些國家，也開展了同類研究，報(bào)導(dǎo)了Herbicidin，Azomultin，Crtromycin，Xanthostiu，Nogimycin，Prumycin等十多種對(duì)水稻白葉枯病原菌有較強(qiáng)生理活性的抗生素，但由于藥害和其它一些原因，也未見防治水稻白葉枯病的大田應(yīng)用報(bào)導(dǎo)。
為了控制病害，提高糧食產(chǎn)量，凈化環(huán)境，保證人畜健康，尋找高效、低毒、低殘留，無“三致”和蓄積作用的無公害廣譜抗生素農(nóng)藥，是本發(fā)明的主要目的。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是篩選對(duì)水稻白葉枯病原菌有高生理活性的抗生素產(chǎn)生菌種→對(duì)產(chǎn)生菌進(jìn)行分類鑒定→進(jìn)行發(fā)酵條件試驗(yàn)→對(duì)產(chǎn)生的抗生素進(jìn)行分離和結(jié)構(gòu)鑒定→生產(chǎn)工藝→毒理試驗(yàn)→大田試驗(yàn)。
本發(fā)明的主要內(nèi)容1.產(chǎn)生菌的鑒定寧南霉素產(chǎn)生菌16A-6菌株，根據(jù)形態(tài)特征，生理生化特性，碳源利用，細(xì)胞壁組份分析和拮抗性等試驗(yàn)結(jié)果形態(tài)特征在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，孢子絲為松敞螺旋，電鏡下，孢子呈橢圓形0.9×1.3μm，圓形直徑1.2μm，孢子表面帶細(xì)刺;培養(yǎng)特征在高氏瓊脂培養(yǎng)基上生長豐茂，短絨狀，氣生菌絲體由深蛛網(wǎng)灰轉(zhuǎn)淡紅灰，有白色次生菌絲，基內(nèi)菌絲體淡灰黃，無可溶性色素;生理生化特性在酪氨酸瓊脂上不產(chǎn)生黑色素，淀粉水解，明膠液化，牛奶胨化，硝酸鹽還原，不產(chǎn)生硫化氫，纖維素上不生長碳源利用，可利用D-葡萄糖，D-果糖、蔗糖、甘露醇、肌醇，不利用鼠李糖，棉子糖，對(duì)D-木糖、L-阿拉伯糖利用可疑;細(xì)胞壁組分為I型;拮抗性菌株培養(yǎng)液對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌，少數(shù)革蘭氏陽性細(xì)菌，酵母菌，水稻紋枯病原菌，稻瘟病原菌，油橄欖瘡痂病原菌有抑制作用，對(duì)水稻白葉枯病原菌和小球菌核病原菌抑制作用強(qiáng)。
根據(jù)以上結(jié)果，將此菌株與諾爾斯鏈霉菌比較，認(rèn)為鏈霉菌16A-6菌株是諾爾斯鏈霉菌的一個(gè)新變種，定名為諾爾斯鏈霉菌西昌變種(Streptomycesnourseivar.xichangansisn.var)。
2.抗生素寧南霉素(16A-6I)的分離和鑒定發(fā)酵液過濾后，濾液通過732＃NH+4型陽離子交換樹脂后，用無鹽水洗去上層蛋白質(zhì)沉淀，再用0.3N氨水洗脫，收集磷鎢酸反應(yīng)陽性部分，減壓濃縮至小體積，濃縮液通過D-110大網(wǎng)樹脂，吸附層析，用無鹽水展層，收集磷鎢酸反應(yīng)部分，凍干得白色粗品，粗品經(jīng)中性氧化鋁柱層析，先用10倍體積75%甲醇水溶液洗，再用25%甲醇水溶液洗，收集磷鎢酸反應(yīng)陽性部分，減壓濃縮，凍干得白色無定形粉末，最后再經(jīng)高效液相色譜進(jìn)一步純化，得寧南霉素(16A-6I)色譜純樣品。
將寧南霉素(16A-6I)白色無定形粉末，進(jìn)行理化性質(zhì)檢測，熔點(diǎn)195℃分解，旋光度[a]25D+38°，分子量444[質(zhì)譜法]，分子式C16H25N7O3，易溶于水，難溶于醇、酮、醋酸乙脂、氯仿等一般有機(jī)溶劑，在pH2-8磷酸緩沖液中進(jìn)行紙上電泳，移向負(fù)極，顯堿性。顯色反應(yīng)茚三酮、雙縮脲、高錳酸鉀、磷鎢酸呈陽性、坂口、三氯化鐵、蒽酮、α-萘酚呈陰性。
對(duì)16A-6I進(jìn)行紫外光譜、紅外光譜、核磁共振譜及水解產(chǎn)物等化學(xué)分析，確定寧南霉素16A-6I為谷氏菌素同分異構(gòu)體，差別在于組成結(jié)構(gòu)成分中，前者為L絲氨酸，后者為D絲氨酸，抗菌生理活性有明顯差異，綜上分析，農(nóng)抗16A-6I為首次發(fā)現(xiàn)的胞嘧啶核苷肽型新抗生素，定名為寧南霉素，其結(jié)構(gòu)式為
3.寧南霉素的生產(chǎn)工藝流程斜面菌種→一級(jí)種子→二級(jí)種子→發(fā)酵罐→發(fā)酵液→板框過濾→薄膜濃縮(2-3倍)→濃縮液加0.1-0.3苯甲酸鈉→裝瓶(10000單位/毫升以上)→成品。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1.低毒、低殘留、無“三致”①急性毒性試驗(yàn)寧南霉素發(fā)酵液冷凍干燥品對(duì)小鼠腹腔注射LD50＝103.6mg/kg;口服LD50＝6485mg/kg;經(jīng)皮LD50＞10000mg/kg，大鼠腹腔注射LD50＝126.1mg/kg;口服LD50＝5492mg/kg。
②魚類半數(shù)耐受濃度試驗(yàn)寧南霉素發(fā)酵液冷凍干燥品對(duì)鯽魚半數(shù)耐受濃度為3323mg/L。
③亞急性毒性試驗(yàn)低劑量組(100mg/kg，相當(dāng)于田間用藥量的50倍)及中劑量組(400mg/kg相當(dāng)于田間用藥量的200倍)與對(duì)照組比較，在體重、攝食、活動(dòng)等基本一致，高劑量組中途死亡是因在藥損基礎(chǔ)上伴有感染，存活大鼠的血象、生化指標(biāo)檢查結(jié)果與對(duì)照組比較無明顯差異，據(jù)追加劑量法以1/13LD50(中劑量組)測算蓄積指數(shù)K＞12.8，認(rèn)為該藥基本無蓄積作用。
④致突變?cè)囼?yàn)寧南霉素對(duì)小鼠胸骨髓微核誘變?cè)囼?yàn)和小鼠睪丸細(xì)胞染色體畸變分析均無誘變作用。
⑤采用高壓液相色譜儀和數(shù)據(jù)處理機(jī)等儀器，檢測標(biāo)樣為寧南霉素色譜純;考查方法回收率在98%左右，對(duì)各類農(nóng)作物樣品殘留分析，豆莢為0.0160ppm，稻葉為0.0952ppm，水稻土為0.0003ppm，豇豆土為0.0034ppm，黃瓜土、稻田水未檢出，谷草0.1133ppm，糠0.1113ppm，米0.0350ppm，小麥0.0002ppm，屬低殘留。
2.防效好，增產(chǎn)顯著。據(jù)5省6縣3884畝大田試驗(yàn)證明，寧南霉素對(duì)水稻白葉枯病與葉枯寧、葉枯凈、敵枯雙等比較，寧南霉素相對(duì)防效一般為70%，高的可達(dá)90%以上，平均85.41%，增產(chǎn)效果一般為10～20%，最高達(dá)35%，而葉枯寧、葉枯凈、敵枯雙平均防效為62.14%～75.63%，增產(chǎn)效果為10%左右。
3.原料易得、價(jià)廉、發(fā)酵效價(jià)穩(wěn)定，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，生產(chǎn)設(shè)備可與其他抗生素生產(chǎn)設(shè)備通用。
4.對(duì)光、熱、酸比較穩(wěn)定，濃縮液在常溫下保存2年不失效，對(duì)人、畜無毒害，對(duì)作物無藥害，無特殊臭味，不刺激皮膚，耐雨水沖刷，在病蟲害同時(shí)發(fā)生的田里，可與樂果，溴氰菊脂混用，不但可以達(dá)到防治明顯效果，而且省勞力，省時(shí)間，從而降低了用藥成本。
實(shí)施例11989年，在成都某廠進(jìn)行1噸試驗(yàn)罐和6噸生產(chǎn)罐共20批的生產(chǎn)考察，證明該菌株產(chǎn)生效價(jià)穩(wěn)定在5000單位/毫升，產(chǎn)品寧南霉素在常溫下貯存兩年不失效。用此抗生素在四川某縣被水淹過并普遍發(fā)生白葉枯病的3580畝稻田示范試驗(yàn)，噴藥的雖遇雨，仍未減藥效，防治效果平均為86.48%，而對(duì)比的葉枯寧防效則為77.14%，葉枯凈為66.85%，增產(chǎn)效果寧南霉素為11.77%，葉枯寧為9.09%，葉柘凈為5.35%。
實(shí)施例2將寧南霉素與粉銹寧、硫磺膠懸劑在某二縣對(duì)小麥白粉病進(jìn)行對(duì)比防治試驗(yàn)結(jié)果，寧南霉素防效為80.19%，增產(chǎn)效果為27.73%，而粉銹寧的防治效果在同樣條件下則為66.34%，增產(chǎn)效果為26.05%，硫磺膠懸劑的防治效果為67.54%，增產(chǎn)效果為16.81%。
實(shí)施例3將寧南霉素(濃度50ppm/ml)與濃度15%的粉銹寧4000倍，和濃度70%甲基托布津1000倍進(jìn)行防治黃瓜、豇豆等蔬菜白粉病試驗(yàn)，結(jié)果，寧南霉素防效黃瓜為85.7%，豇豆為92.8%，增產(chǎn)效果黃瓜為37.3%;粉銹寧對(duì)黃瓜防效為81.0%，對(duì)豇豆為90.3%，增產(chǎn)效果為36.6%;甲基托布津，對(duì)黃瓜防效為64.3%，豇豆為78.9%，增產(chǎn)效果為9.2%。
實(shí)施例41990-1991連續(xù)兩年在某地用寧南霉素對(duì)煙草花葉病進(jìn)行防治試驗(yàn)，設(shè)83增抗劑為對(duì)比藥劑，清水為對(duì)照，用常量噴霧，畝用藥量(規(guī)格1%)750毫升，83增抗劑750毫升，兌水75公斤噴霧，施藥共三次，結(jié)果表明，寧南霉素絕對(duì)防效為87.38%，增產(chǎn)效果為23.2%;83增抗劑的防效僅為22.47%，寧南霉素明顯優(yōu)于83增抗劑。
權(quán)利要求
1.用微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)的抗生素農(nóng)藥，其特征是，其產(chǎn)生菌16A-6菌株是諾爾斯鏈霉菌的一個(gè)新變種，定名為諾爾斯鏈霉菌西昌變種(Streptomycesnourseivar·xichangensisn·var)。該菌所產(chǎn)生的抗生素，定名為寧南霉素，其分子量為444[質(zhì)譜法]，分子式為C16H25N7O8，結(jié)構(gòu)式為
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗生素農(nóng)藥-寧南霉素，其特征是水解產(chǎn)物為胞嘧啶核苷肽型抗生素，其絲氨酸為L-絲氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的農(nóng)用抗生素-寧南霉素，其特征是，其熔點(diǎn)為195℃，旋光度為[a]25D+38°。
全文摘要
鏈霉菌16A-6菌株是諾爾斯鏈霉菌的一個(gè)新變種，定名為諾爾斯鏈霉菌西昌變種，其產(chǎn)生的抗生素16A-6I為首次發(fā)現(xiàn)的胞嘧啶核苷肽型新抗生素，定名為寧南霉素。該抗生素是一種低毒、低殘留、無“三致”和蓄積問題，不污染環(huán)境的新農(nóng)藥，對(duì)水稻白葉枯病相對(duì)防效為70％左右，高的可達(dá)90％，增產(chǎn)效果為10～20％，高的可達(dá)35％，另外它對(duì)小麥、蔬菜、花卉等白粉病的防病、增產(chǎn)效果都很顯著，對(duì)水稻小球菌核病、油橄欖孔雀斑病、瘡痂病及煙草花葉病防效也很好。
文檔編號(hào)A01N63/00GK1093869SQ9310428
公開日1994年10月26日 申請(qǐng)日期1993年4月23日 優(yōu)先權(quán)日1993年4月23日
發(fā)明者胡厚芝, 向固西, 陳家任, 陳維新, 吳林森, 徐生林 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院成都生物研究所, 國家醫(yī)藥管理局四川抗菌素工業(yè)研究所