專利名稱：鮮活單細胞海洋紅酵母生態(tài)餌料及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是經(jīng)濟水產(chǎn)品育苗餌料及生產(chǎn)方法，特別是鮮活單細胞海洋紅酵母生態(tài)餌料及其生產(chǎn)方法。
魚、蝦、貝、蟹等經(jīng)濟水產(chǎn)品的人工飼養(yǎng)中，幼體喂養(yǎng)是一個十分重要的環(huán)節(jié)。在以住常使用的餌料中，蛋黃、豆?jié){的效率很低且又易造成污染水質(zhì)；醫(yī)用或食用的酵母在海水中不能生存造成為死體的懸浮不好；單胞藻有較好的效果，但僅是植物性飼料，特別是大量培養(yǎng)困難而常常供不應(yīng)求。海洋酵母(Marine yeast)在日本已有大量培養(yǎng)的報導(湛江水產(chǎn)?？茖W校主編《海洋餌料生物培養(yǎng)》農(nóng)業(yè)出版社1980年版P21～27)，實際上報導的生產(chǎn)配方僅適于海洋白酵母(Whiteyeast)的規(guī)模生產(chǎn)，而海洋白酵母因產(chǎn)生粘性物較多，高濃度培養(yǎng)易產(chǎn)生“凝集沉淀”現(xiàn)象，顯微鏡下可見十幾個甚至幾十個酵母細胞“聯(lián)合為一體”而無法分開，影響幼體對鮮活菌體的食用效果。其他海洋酵母餌料生產(chǎn)未見有報導。
本發(fā)明的目的是提供一種方法從海洋中分離、純化海洋紅酵母菌種，并能大規(guī)模培養(yǎng)、生產(chǎn)鮮活單細胞海洋紅酵母餌料。
本發(fā)明的海洋紅酵母菌種是從海水中分離、純化而得到的，具體方法是在無菌條件下將海水用超濾膜進行抽濾，濾畢將超濾膜過濾面朝上平放在有抗菌素的平面培養(yǎng)基上，于18～20℃培養(yǎng)3～7天，超濾膜上有海洋紅酵母生長，將紅酵母菌落移至平板培養(yǎng)基上劃線，置18～20℃培養(yǎng)2～3天，如不純則再次用紳線法分離。在顯微鏡下觀察到的純海洋紅酵母接種至斜面培養(yǎng)基上，18～25℃下培養(yǎng)2～5天后，于4℃以下保存。其平面和種子斜面培養(yǎng)基配方為
平板培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基海水 100ml 100ml葡萄糖 1～5g 0.6～2.0g酵母膏 0.3～2.0g 0.1～0.4g多價蛋白胨 0.6～4.0g麥芽汁 1～5g 0.1～0.6gMgSO47H2O0.5～4.0g 0.05～0.15g瓊脂 2～4g氯霉素 1.8～10.0g青霉素 2.0～10.0g(NH4)2SO40.1～0.8gPH 4.2～5.0 4.5～5.4其中PH可用乳酸調(diào)節(jié)(以下同)。菌種在4℃以下保存。根據(jù)菌種活性，必須定期進行復狀。
菌種在使用前需進行活化，即將菌種再接種到活化培養(yǎng)基上，在18～25℃下培養(yǎng)，并接代培養(yǎng)2～3代，使其擴大繁殖并成茁壯菌落。生產(chǎn)時再將菌種經(jīng)A、B兩級擴大培養(yǎng)，種子缶、生產(chǎn)缶擴大培養(yǎng)和產(chǎn)品制備的過程而完成。各階段培養(yǎng)基的配方如下表，菌種活化 擴大A 擴大B 種子缶生產(chǎn)缶海水 100ml 100ml 100ml 100ml 100ml葡葡糖1.2～3.8g 1.8～4.8g 1.6～3.8g 2.8～4.5g 1～5g酵母膏0.3～1.8g 0.2～0.8g 0.3～0.9g 0.2～0.6g 0.1～0.6g蛋白胨 0.6～1.8g 0.1～1.2g多價蛋白胨0.6～2.0g麥芽汁0.6～5.0g 1.0～6.0g 1.3～4.8g 1～6g 2.6～7.8gMgSO4·7H2O0.1～0.8g 0.1～0.7g 0.1～0.6g(NH4)2SO40.4～0.78g0.8～1.8g 1.5～3.5gKH2PO40.5～0.35g 0.3～0.8g 0.1～0.5g 0.1～0.7g尿素 0.1～0.4g谷氨酸鈉 0.3～0.8g0.01～0.06gH3PO40.1～0.4gPH 4.4～5.04.6～5.6 4.6～5.8 4.6～5.84.6～5.8其具體操作方法為(1)擴大培養(yǎng)A在無菌條件下，于20～80ml的培養(yǎng)基中接種兩環(huán)菌落，在20～28℃下振蕩培養(yǎng)2～4天。
(2)擴大培養(yǎng)B培養(yǎng)量為擴大培養(yǎng)A的8～25倍。在無菌條件下，將已完成擴大培養(yǎng)A的培養(yǎng)液移至裝有培養(yǎng)基的B缶中，在22～25℃下進行深層通氣培養(yǎng)2～4天，通氣量為0.008～0.028m3/h。
(3)種子缶培養(yǎng)培養(yǎng)量為擴大培養(yǎng)B的10～40倍。在無菌條件下將已完成擴大培養(yǎng)B的培養(yǎng)液移至裝有培養(yǎng)基的種子缶中，在18～26℃下進行深層通氣培養(yǎng)2～4天，通氣量為0.005～0.016m3/h。
(4)生產(chǎn)缶培養(yǎng)培養(yǎng)量為種子缶培養(yǎng)的15～50倍。在無菌條件下，將已完成種子缶培養(yǎng)的培養(yǎng)液移至裝有培養(yǎng)基的生產(chǎn)缶中，在18～26℃下進行深層通氣培養(yǎng)2～4天，通氣量高于種子缶6～18個百分點。
(5)產(chǎn)品制備將生產(chǎn)缶中已完成培養(yǎng)的培養(yǎng)液進行離心，最好用高速離心過濾(3000～6000r/min)，將過濾固體加消毒海水稀釋成產(chǎn)品。產(chǎn)品含海洋紅酵母為10～100億細胞/ml海水，海洋紅酵母個體為3～×4～6μm。
本發(fā)明產(chǎn)品在對蝦、太平洋牡蠣、海參、扇具以及河蟹育苗中試用，證明對高幼體各階段的變態(tài)、成活率、加快幼體生長速度、凈化水質(zhì)，具有較好的效果。
本發(fā)明就產(chǎn)品及生產(chǎn)方法而言，其突出特點是(1)是一種新的、活的、動物性的經(jīng)濟水產(chǎn)品飼料，具有①是一種單細胞、粒度適中的嗜口性強的飼料；②在水中分散性極好，每毫升100億細胞的菌體懸液自然沉降18h，僅15％沉降；海洋白酵母投入水中即成凝集塊；③極富營養(yǎng)，不僅含有蛋白質(zhì)、糖類、礦物質(zhì)、維生素和生長激素，還含有一般餌料所缺少的不飽和脂肪酸和多種酶，有利于幼體消化吸收；④投入使用后而成為種群優(yōu)勢而能抑制有害雜菌繁殖、分解有害的有機物及氨態(tài)氮、硫化氫等，凈化水質(zhì)而起到對幼體育苗的生態(tài)學保護作用，這是其他餌料所不具備的特點⑤易于保存及運輸，常溫存放10天，冷藏可保存30天，速凍后冷藏可保存6個月。(2)從近海海水中成功地分離、純化海洋紅酵母；提供了包括海洋紅酵母分離、純化、菌種保存、菌種活化和多級培養(yǎng)的條件、培養(yǎng)基的配方等工藝條件，成功地實現(xiàn)了連續(xù)化、高濃度、高效率的工業(yè)化生產(chǎn)。
實例1、超濾膜分離、純化海洋紅酵母。先將超濾膜、濾器等用具無菌處理，用抽濾法過濾新取近海海水100ml，濾畢用無菌鑷子取濾膜面超上平放在滅菌后新加抗菌液的培養(yǎng)基上，18～20℃培養(yǎng)6天，培養(yǎng)皿上長出60個磚紅色紅酵母菌落，將其接種在平面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，兩次劃線分得純種，再接種在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)、保存。其培養(yǎng)基配方為分離 保存海水 100ml 100ml葡萄糖 3g 1.5g酵母膏 0.8g 0.3g多價蛋白胨2g麥芽汁3g0.4MgSO47H2O 0.8g 0.1(NH4)2SO40.5瓊脂 4gPH 4.85.0氯霉素 80萬單位 8g青霉素 80萬單位 8g溶液的PH用乳酸調(diào)節(jié)。
2、菌種活化。使用前將菌種轉(zhuǎn)至平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3代，其配方為海水 100葡萄糖 2.5g酵母膏 1.2g多價蛋白胨 1.5g麥芽汁 2.0gFeSO47·H2O 0.05gNa2HPO412H2O 0.05gKH2PO40.28gPH4.83、擴大培養(yǎng)。分A與B兩階段A、在玻璃三角瓶中裝有50ml(10個角瓶，共500ml)培養(yǎng)基，滅菌后接種兩環(huán)菌種，于23℃、80轉(zhuǎn)/分種搖床上恒溫培養(yǎng)48h，菌種密度可達12，5億細胞/ml。
B、在卡氏缶中加入9升培養(yǎng)基，滅菌處理后將A培養(yǎng)液接入缶中，于22～25℃下，通氣量為0.02m3/h下培養(yǎng)48h，菌密度為15億細胞/ml。A、B培養(yǎng)基培方為
A B海水 100ml 100ml葡萄糖 3.5g4g酵母膏 0.6g0.6g麥芽汁 5g蛋白胨 1.2g尿素 0.3g谷氨酸鈉 0.6g正磷酸 0.3gPH 4.8 5.0(NH4)2SO40.6gKH2PO40.5gMgSO4·7H2O 0.6gFeSO40.02gNa2HPO40.05g3、種子缶擴大培養(yǎng)。在種子缶中裝180升培養(yǎng)基，滅菌處理后將擴大B階段的培養(yǎng)液移入擴大培養(yǎng)缶中，22～25℃下，通氣量為0.007m3/h培養(yǎng)50h，菌密度為12億細胞/ml。
4、生產(chǎn)缶擴大培養(yǎng)。在裝有3600L(3.6噸)培養(yǎng)基的生產(chǎn)缶中進行滅菌處理，然后將種子缶的培養(yǎng)液移至生產(chǎn)缶中，在22～26℃，通氣量為0.009m3/h，攪拌培養(yǎng)60h，菌密度為12億細胞/ml。種子缶與生產(chǎn)缶培養(yǎng)基配方為種子缶生產(chǎn)缶海水 100ml 100ml葡萄糖 3.5g 4.5g酵母膏 0.4g0.4g麥芽汁 6.0g6.0g(NH4)2SO41.0g3.0gKH2PO40.4g0.4gMgSO4·7H2O 0.4g0.4g蛋白胨 0.6g谷氨酸鈉0.05g生物素 8ppmNa2HPO4·12H2O 0.04gPH 5.0 5.25、產(chǎn)品制備。將生產(chǎn)缶培養(yǎng)液進行離心過濾，離心固體物加消毒海水稀釋至100億細胞/ml。
權(quán)利要求
1.一種海洋酵母生態(tài)餌料，其特征為是一種濃縮、鮮活、單細胞海洋紅酵母液態(tài)餌料，海洋紅酵母細胞個體為3～5×4～6μm，含海洋紅酵母為10～100億細胞/ml海水。
2.如權(quán)利要求1海洋酵母生態(tài)餌料的生產(chǎn)方法，其特征為在無菌條件下將海洋紅酵母菌種進行A、B兩級擴大培養(yǎng)，種子缶、生產(chǎn)缶擴大培養(yǎng)及產(chǎn)品制備而完成；各步培養(yǎng)基配方為擴大A 擴大B 種子缶 生產(chǎn)缶海水 100 100 100 100葡萄糖 1.8～4.8g 1.6～3.8g 2.8～4.5g 1～5g酵母膏 0.2～0.8g 0.3～0.8g 0.2～0.6g 0.1～0.6g蛋白胨 0.6～1.8g 0.1～1.2g麥芽汁 1.0～6.0g 1.8～4.8g 1～6g 2.6～7.8gMgSO4·7HO20.1～0.8g 0.1～0.7g 0.1～0.6g生物素 5～10ppmFeSO47H2O0.01～0.08gNa2HPO4·12H2O 0.03～0.08g 0.03～0.08g(NH4)2SO40.4～0.78g 0.8～1.8g 1.5～3.5gKH2PO40.3～0.8g 0.1～0.5g 0.1～0.7g尿素 0.1～0.4g谷氨酸鈉 0.3～0.8g0.01～0.06gH3PO40.1～0.4gPH 4.6～5.64.6～5.84.6～5.84.6～5.8其操作方法為(1)活化培養(yǎng)18～25℃下培養(yǎng)2～3天；(2)擴大培養(yǎng)A無菌條件下，在20～80ml培養(yǎng)基中接種2環(huán)菌落，20～28℃下振蕩培養(yǎng)2～4天；(3)擴大培養(yǎng)B培養(yǎng)量為A的8～25倍，無菌條件下將已完成培的A的培養(yǎng)液移至B的培養(yǎng)基中，22～25℃進行深層通氣培養(yǎng)2～4天，通氣量為0.008～0.028m3/h；(4)種子缶培養(yǎng)培養(yǎng)量為B的10～40倍，無菌條件下將已完成培養(yǎng)的B移至裝有培養(yǎng)基的種子缶中，18～26℃進行深層通氣培養(yǎng)2～4天，通氣量為0.005～0.016m3/h；(5)生產(chǎn)擊培養(yǎng)培養(yǎng)量為種子缶培養(yǎng)的15～50倍，無菌條件下將已完成培養(yǎng)種子缶培養(yǎng)液移至裝有培養(yǎng)基的生產(chǎn)缶中，18～26℃進行深層通氣培養(yǎng)2～4天，通氣量高于種子缶6～18個百分點；(6)產(chǎn)品制備將完成培養(yǎng)的生產(chǎn)缶培養(yǎng)液進行離心，用消毒海水稀釋海洋紅酵母菌體至標準要求。
3.如權(quán)利要求2海洋酵母生態(tài)餌料的生產(chǎn)方法，其特征為所述的海洋紅酵母菌種是從近海海水中分離、純化，再經(jīng)增殖培養(yǎng)，斜面培養(yǎng)成菌種，經(jīng)活化而成，其操作方法為(1)海洋紅酵母菌種的分離、純化將海水用經(jīng)滅菌處理的超濾膜進行抽濾，濾畢將超濾膜面朝上移入平面培養(yǎng)基上，18～20℃培養(yǎng)3～7天，再將濾膜上生長的海洋紅酵母菌種移入平板培養(yǎng)基上劃線，18～20℃培養(yǎng)2～3天，然后將菌種移入斜面培養(yǎng)基上，18～25℃培養(yǎng)2～5天于4℃以下保存；(2)活化，將菌種接種在活化培養(yǎng)基上，18～25℃下培養(yǎng)，2～3代后成為擴大培養(yǎng)所需菌種；各段使用培養(yǎng)基配方為平面 斜面 活化海水 100ml100ml 100ml葡萄糖1～5g0.6～2.0g 1.2～3.8g酵母膏 0.3～2.0g 0.1～0.4g0.3～1.8g多價蛋白胨 0.6～4.0g 0.6～2.0g麥芽汁 1～5g 0.1～0.6g0.6～5.0gMgSO4·7H2O0.5～4.0g 0.05～0.15g瓊脂 2～4g氯霉素 1.8～10.0g青霉素 2.0～10.0g(NH4)2SO40.1～0.8gFeSO4·7H2O 0.01～0.08gNa2HPO4.122H2O 0.03～0.08gKH2PO40.15～0.35gPH 4.2～5.0 4.5～5.4 4.4～5.0
4.如權(quán)利要求2或3海洋酵母生態(tài)餌料的生產(chǎn)方法，其特征為所有培養(yǎng)基的要求PH值均可用乳酸調(diào)節(jié)來達到。
全文摘要
一種鮮活單細胞海洋紅酵母生態(tài)餌料，是從近海海水中用超濾膜抽濾分離、純化，再經(jīng)增殖培養(yǎng)、斜面培養(yǎng)而成菌種，再經(jīng)活化接代培養(yǎng)可用于生產(chǎn)。生產(chǎn)是經(jīng)A、B兩步擴大培養(yǎng)、種子缶擴大培養(yǎng)、生產(chǎn)缶擴大培養(yǎng)和產(chǎn)品制備而得含海洋紅酵母濃縮餌料，其濃度達10～100億細胞/ml海水，海洋紅酵母個體為3～5×4～6μm，產(chǎn)品經(jīng)對蝦、牡蠣、海參、扇貝、河蟹育苗中試用證明這種飼料對提高幼體各階段的變態(tài)、成活率、加快幼體生長速度及凈化水質(zhì)均有較好效果。
文檔編號A23K1/18GK1146290SQ95112038
公開日1997年4月2日 申請日期1995年9月27日 優(yōu)先權(quán)日1995年9月27日
發(fā)明者王世權(quán) 申請人:王世權(quán)