專(zhuān)利名稱(chēng)：：人類(lèi)來(lái)源的乳酸桿菌菌株、它們的組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及乳酸桿菌菌株和含有它們的藥物組合物。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及三種新的人源非嗜酸性乳酸桿菌菌株(鑒定編號(hào)為CNCMI-1390、CNCMI-1391和CNCMI-1392，1994年1月13日保藏于theCNCMCollectionoftheInstitutPasteur)和一種新的人源嗜酸性乳酸桿菌(命名為CNCMI-1447，根據(jù)布達(dá)佩斯條約于1994年7月13日保藏于同一研究所)。乳酸細(xì)菌的治療用途具有悠久和確定的歷史，其可以追朔到本世紀(jì)的初期以及指明使用發(fā)酵乳對(duì)消費(fèi)者健康狀況的有利影響的各種研究(參考文獻(xiàn)1-5)。自從那時(shí)起，乳酸細(xì)菌已廣泛應(yīng)用于制藥工業(yè)，它們構(gòu)成治療病原菌引起的腸內(nèi)疾病的各種制劑的活性成分并用作抗生素治療中的輔藥(參考文獻(xiàn)6-9)。過(guò)去的幾十年中，科學(xué)家們從整體上加深了對(duì)乳酸細(xì)菌的認(rèn)識(shí)，特別是對(duì)乳酸桿菌的認(rèn)識(shí)，獲得了驚人的大量信息。不過(guò)，目前市場(chǎng)上的產(chǎn)品似乎并沒(méi)有考慮到近期科研成果(參考文獻(xiàn)10-11)。應(yīng)該特別指出的是，許多研究已表明-乳酸桿菌在腸內(nèi)微生物菌叢的調(diào)節(jié)中起到獨(dú)特的作用，不僅產(chǎn)生乳酸還產(chǎn)生特殊的抗細(xì)菌物質(zhì)(參考文獻(xiàn)12-16)；-考慮到“宿主特異性”要求，這些細(xì)菌必須來(lái)自腸內(nèi)環(huán)境，細(xì)菌再植入這種環(huán)境中(例如，為了應(yīng)用于人類(lèi)，這些細(xì)菌必須分離自人腸內(nèi)系統(tǒng)，等等)以保證移生(參考文獻(xiàn)17)；-乳酸桿菌與數(shù)種代謝活動(dòng)有關(guān)，這些代謝活動(dòng)與保持良好健康狀態(tài)、防止多種病理狀態(tài)特別相關(guān)；特別值得一提的是亞硝胺降解、細(xì)菌毒素中和以及防癌活性(參考文獻(xiàn)18)；-粘附到腸上皮上的能力是腸內(nèi)細(xì)菌的一個(gè)極為有利的特點(diǎn)(已經(jīng)知道，多種病原菌在失去粘附粘膜的能力時(shí)就喪失其致病力)；因此，對(duì)乳酸桿菌而言，為了提供一種阻礙病原菌移生的屏障，其移生在上皮上的可能性也是特別重要的(參考文獻(xiàn)10，19)-對(duì)分離自腸的菌株的分類(lèi)已作過(guò)重大修正；這種生態(tài)系統(tǒng)中新細(xì)菌種的存在以及每種中特殊生物型的分化已被確認(rèn)(參考文獻(xiàn)20)；-在確定乳酸細(xì)菌菌株的可利用性中，這些菌株的“技術(shù)”性質(zhì)(首先是對(duì)低溫防腐處理的抵抗性)尤為重要；事實(shí)上，目前用于probiotic的目的乳酸桿菌菌株一般只對(duì)凍干條件稍有抗性(參考文獻(xiàn)21)。凍干之后必須保持粘附性質(zhì)(并不是總能達(dá)到的要求)。特別是，在試圖分離出具有很高腸粘膜細(xì)胞粘附能力的乳酸桿菌的過(guò)程中，描述了“同源”分離方法，例如，從健康個(gè)體的糞便中分離。例如，US4839281、EP-A-199535和US5032399描述了分離自成人、特點(diǎn)為強(qiáng)粘附性質(zhì)的嗜酸性乳酸桿菌菌株，粘附性質(zhì)為與參考菌株相比，以粘附到人腸粘膜的一個(gè)細(xì)胞上的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量來(lái)量化。不過(guò)，對(duì)這一菌株的確切分類(lèi)是有疑問(wèn)的，在美國(guó)專(zhuān)利局對(duì)該申請(qǐng)進(jìn)行實(shí)質(zhì)審查時(shí)，作者自己聲稱(chēng)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，所描述的乳酸桿菌屬于非嗜酸性菌種(美國(guó)專(zhuān)利4839281，卷宗，答復(fù)1987年10月30的審查意見(jiàn)，第7頁(yè)，最后一段)。Reniero等(參考文獻(xiàn)27)報(bào)道了從兩個(gè)嬰兒的糞便中分離出干酪乳酸桿菌(Lactobacilluscasei)的兩個(gè)菌株。同樣的菌株能在糞便中存在數(shù)日，這使作者把粘附性質(zhì)歸因于這些菌株。沒(méi)有提到其它象上述那樣的生物學(xué)或技術(shù)上的性質(zhì)，而這些性質(zhì)是本發(fā)明所要求的乳酸桿菌菌株的獨(dú)特性質(zhì)。實(shí)際上，發(fā)現(xiàn)菌株CNCMI-1390、CNCMI-1391、CNCMI-1392和CNCMI-1447(除了對(duì)腸內(nèi)和頰細(xì)胞的粘附力之外，常優(yōu)于參考菌株)，還具有下列特點(diǎn)-抑制人腸內(nèi)病原菌生長(zhǎng)的能力；-在各種條件(需氧和厭氧生活)、不同pH值下生長(zhǎng)的能力；這些性質(zhì)賦予了適應(yīng)經(jīng)過(guò)胃腸道過(guò)程中所要求的生理和病理?xiàng)l件的能力；-產(chǎn)生大量乳酸；-對(duì)膽汁抗性高；-對(duì)凍干的抗性，不會(huì)喪失粘附能力。這些菌株屬于乳酸桿菌屬且以一系列特點(diǎn)為特征，這使它們對(duì)數(shù)種病理狀態(tài)的預(yù)防和治療特別受人關(guān)注。本發(fā)明提供藥物、獸藥或營(yíng)養(yǎng)組合物，其含有菌株CNCMI-1390、CNCMI-1391、CNCMI-1392和CNCMI-1447中的至少一種，優(yōu)選為凍干形式，與適當(dāng)載體混合。這些組合物可以口服施用或者與象乳、酸奶或乳制品這樣的食品混合施用，以治療或預(yù)防需要施用乳酸桿菌的胃腸道病理狀態(tài)，例如，象腸道微生物異常(dismicrobism)、各種原因的腹瀉、潰瘍性結(jié)腸炎以及有關(guān)病理狀態(tài)的情形。本發(fā)明的組合物也可以在抗生素治療時(shí)施用，以保護(hù)非致病性腸道細(xì)菌菌叢。本發(fā)明的菌株的另一個(gè)重要特征是，它們是從健康新生兒和斷奶后的嬰兒的糞便中分離出來(lái)的。實(shí)際上人們已知，哺乳動(dòng)物在出生時(shí)胃腸道是無(wú)菌的；但通常由母體的陰道和肛周菌叢迅速移生。有益微生物的這條自然遷移途徑是剖腹產(chǎn)的嬰兒所缺乏的；實(shí)際上，這種剖腹產(chǎn)的嬰兒易于移生那些不那么有益的微生物。在早產(chǎn)兒中也觀察到腸道由不那么有益的微生物所移生。在這兩種情形中，通過(guò)口服施用本發(fā)明的菌株可以大大減少這種危險(xiǎn)。另外，與母乳喂養(yǎng)的嬰兒相比，瓶喂嬰兒在其腸道中有數(shù)量更多的梭狀芽孢桿菌、大腸桿菌和腸球菌。在這種情況下，用本發(fā)明的乳酸桿菌處理也有助于腸內(nèi)菌叢的再平衡。所述各菌株可配制成只有本發(fā)明各菌株的混合物和/或與具有互補(bǔ)性質(zhì)即不同內(nèi)在特性的其它菌株一起形成的混合物。這種制劑的典型例子有含有至少一種具有高粘附性質(zhì)的菌株與至少一種能產(chǎn)生大量L-乳酸的菌株的混合物。一種優(yōu)選但絕非限制性的組合物可以這樣制備將本發(fā)明的菌株CNCMI-1394和腸球菌EnterococcusfaeciumSF68以適當(dāng)?shù)牧?例如，每種菌株為106～1010個(gè)細(xì)胞)與常用的添加劑或賦形劑混合。通常為膠囊、溶液或可飲用懸浮液、袋裝粉劑和相似形式的每一單一劑量一般含有每一菌株約為106～1010細(xì)胞。還已經(jīng)證明，本發(fā)明的乳酸桿菌在改善食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值方面非常有用。特別優(yōu)選的是得自乳或其衍生物的乳制品。下面介紹菌株的分離及其鑒定。實(shí)施例1菌株的分離和鑒定菌株分離自出生1～6天的新生兒。還從其它的斷奶期嬰兒取樣。在診所里，對(duì)受試者的糞便每天取樣兩次，并在厭氧條件下貯藏于無(wú)菌藥簽中。在LBSTM選擇性培養(yǎng)基(LactobacillusSelectionAgar，Oxoid)中進(jìn)行乳酸桿菌的選擇性初步分離。于37℃在厭氧條件下保溫平板48小時(shí)(GasPacksystem，BBL)。在MRS液體培養(yǎng)基(deMan-Rogosa-Sharpebroth，Oxoid)中分離出所得菌落，進(jìn)行第一系列再分離以獲得純培養(yǎng)物(在選擇性瓊脂培養(yǎng)基上涂片并分離單菌落之后)。這些步驟反映了Sharpe提出的方法(參考文獻(xiàn)22)。對(duì)各菌株進(jìn)行分離和純化之后，對(duì)它們做進(jìn)一步鑒定以便僅選擇出那些屬于乳酸桿菌屬的菌株。接著檢驗(yàn)下列特征形態(tài)學(xué)(用相差顯微鏡進(jìn)行光學(xué)檢測(cè))、對(duì)革蘭氏染色的反應(yīng)(所有乳酸桿菌都是陽(yáng)性的)、過(guò)氧化氫酶的存在(所有乳酸桿菌都是陰性的)、溫育24小時(shí)后檢測(cè)每種菌株的培養(yǎng)基中存在的兩種乳酸立體異構(gòu)體(用Boehringerkit進(jìn)行酶法檢測(cè))。根據(jù)這些檢測(cè)，可能把這些分離物歸入乳酸桿菌屬。接著，對(duì)各菌株進(jìn)行凍干并于4℃貯藏。對(duì)所有這些鑒定為乳酸桿菌的菌株在堿提取后再進(jìn)行質(zhì)粒外形的分析(參考文獻(xiàn)23)。這種分析可以鑒定分離出的菌株(參考文獻(xiàn)24)。還檢驗(yàn)了可溶性脂質(zhì)蛋白的外形(參考文獻(xiàn)25)和抗生素抗性模式(參考文獻(xiàn)26)。然后，用象糖質(zhì)發(fā)酵模式(APICH50galleriessystem，Biomerieux)這樣的標(biāo)準(zhǔn)表型檢測(cè)法對(duì)所有分離物的有代表性的菌株進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析。本發(fā)明菌株的分類(lèi)和特征列于下面各圖表中圖表1-菌種鑒定CNCMI-13901.來(lái)源人年齡斷奶期性別女分娩類(lèi)型自然營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型母乳喂養(yǎng)2.屬乳酸桿菌屬3.形態(tài)學(xué)桿菌短鏈有聚集體無(wú)英膜的存在無(wú)4.乳酸的產(chǎn)生L3.84g/LD0.15g/L5.糖類(lèi)發(fā)酵甘油-赤醇-D-阿拉伯糖-L-阿拉伯糖-D-木糖-L-木糖-核糖醇+β-甲基-木糖苷-半乳糖+D-葡萄糖+D-果糖+D-甘露糖+L-山梨糖+鼠李糖-七葉苷+水楊苷+纖維二糖+麥芽糖+乳糖可變蜜二糖-蔗糖+海藻糖(Trealose)+菊糖+松三糖+D-棉子糖-淀粉-糖原-木糖醇-β-龍膽二糖-半乳糖醇-肌醇-甘露糖醇+山梨糖醇-苦杏仁苷-熊果苷+D-松二糖+D-來(lái)蘇糖-D-塔格糖+D-巖藻糖-D-阿拉伯糖醇-L-阿拉伯糖醇-葡糖酸+α-甲基-D-甘露糖苷-α-甲基-D-葡糖苷-N-乙酰氨基葡糖+2-酮葡糖酸-5-酮葡糖酸-L-巖藻糖-核糖+6.質(zhì)粒圖表2-菌種鑒定CNCMI-13911.來(lái)源人年齡斷奶期性別女分娩類(lèi)型剖腹產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型瓶喂2.屬乳酸桿菌屬3.形態(tài)學(xué)桿菌短鏈有聚集體無(wú)英膜的存在無(wú)4.乳酸的產(chǎn)生L3.14g/LD0.20g/L5.糖類(lèi)發(fā)酵甘油-赤醇-D-阿拉伯糖-L-阿拉伯糖-D-木糖-L-木糖-核糖醇+β-甲基-木糖苷-半乳糖+D-葡萄糖+D-果糖+D-甘露糖+L-山梨糖+鼠李糖-七葉苷+水楊苷+纖維二糖+麥芽糖+乳糖+蜜二糖-蔗糖+海藻糖(Trealose)+菊糖+松三糖+D-棉子糖-淀粉-糖原-木糖醇-β-龍膽二糖+半乳糖醇-肌醇-甘露糖醇+山梨糖醇-苦杏仁苷+熊果苷+D-松二糖+D-來(lái)蘇糖-D-塔格糖+D-巖藻糖-D-阿拉伯糖醇-L-阿拉伯糖醇-葡糖酸+α-甲基-D-甘露糖苷-α-甲基-D-葡糖苷-N-乙酰氨基葡糖+2-酮葡糖酸-5-酮葡糖酸-L-巖藻糖-核糖+6.質(zhì)料5圖表3-菌種鑒定CNCMI-13921.來(lái)源人年齡斷奶期性別女分娩類(lèi)型自然營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型母乳喂養(yǎng)2.屬乳酸桿菌屬3.形態(tài)學(xué)桿菌短鏈有聚集體無(wú)英膜的存在無(wú)4.糖類(lèi)發(fā)酵甘油-赤醇-D-阿拉伯糖-L-阿拉伯糖-D-木糖-L-木糖-核糖醇+β-甲基-木糖苷-半乳糖+D-葡萄糖+D-果糖+D-甘露糖+L-山梨糖+鼠李糖-七葉苷+水楊苷+纖維二糖+麥芽糖+乳糖+蜜二糖-蔗糖+海藻糖(Trealose)+菊糖+松三糖+D-棉子糖-淀粉-糖原-木糖醇-β-龍膽二糖+半乳糖醇-肌醇-甘露糖醇+山梨糖醇-苦杏仁苷-熊果苷+D-松二糖+D-來(lái)蘇糖-D-塔格糖+D-巖藻糖-D-阿拉伯糖醇-L-阿拉伯糖醇-葡糖酸+α-甲基-D-甘露糖苷-α-甲基-D-葡糖苷-N-乙酰氨基葡糖+2-酮葡糖酸-5-酮葡糖酸-L-巖藻糖-核糖+5.質(zhì)粒2圖表4-菌種鑒定CNCMI-14471.來(lái)源人年齡新生兒性別男分娩類(lèi)型自然營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型母乳喂養(yǎng)2.屬乳酸桿菌屬種嗜酸3.形態(tài)學(xué)桿菌短鏈有聚集體無(wú)英膜的存在無(wú)4.乳酸的產(chǎn)生L3.53g/LD3.12g/L5.糖類(lèi)發(fā)酵甘油-赤醇-D-阿拉伯糖-L-阿拉伯糖-D-木糖-L-木糖-核糖醇-β-甲基-木糖苷-半乳糖+D-葡萄糖+D-果糖+D-甘露糖+L-山梨糖-鼠李糖-七葉苷+水楊苷+纖維二糖+麥芽糖+乳糖-蜜二糖-蔗糖+海藻糖(Trealose)+菊糖+松三糖+D-棉子糖-淀粉+糖原-木糖醇-β-龍膽二糖+半乳糖醇-肌醇-甘露糖醇+山梨糖醇+苦杏仁苷+熊果苷+D-松二糖+D-來(lái)蘇糖-D-塔格糖+D-巖藻糖-D-阿拉伯糖醇-L-阿拉伯糖醇-葡糖酸+α-甲基-D-甘露糖苷-α-甲基-D-葡糖苷-N-乙酰氨基葡糖+2-酮葡糖酸-5-酮葡糖酸-L-巖藻糖-核糖-6.質(zhì)粒1實(shí)施例2將本發(fā)明的各菌株與參照菌株相比較，以評(píng)估它們粘附各類(lèi)細(xì)胞的持久力、在各種pH值下生長(zhǎng)的持久力、在不同膽汁濃度下生長(zhǎng)的持久力、以及在各種溫育條件下生長(zhǎng)的持久力、影響腸內(nèi)病原菌生長(zhǎng)的能力。在每一分析之前，將凍干的菌株樣品再水化并于MRS培養(yǎng)基中溫育。參考菌株如下嗜酸性乳酸桿菌ATCC53103嗜酸性乳酸桿菌ATCC4357德氏乳酸桿菌ATCC7994腸炎沙門(mén)氏菌ATCCIMM2大腸埃希氏桿菌ATCC35401對(duì)人上皮細(xì)胞的粘附對(duì)兩類(lèi)上皮細(xì)胞進(jìn)行“體外”粘附試驗(yàn)。-新分離的人頰細(xì)胞，-腸細(xì)胞(收集的細(xì)胞系，Intestine407，得自IstitutoZooprofilatticoSperimentaleinBrescia)。頰細(xì)胞分離自不吸煙的健康受試者。用木制壓舌板刮面頰的內(nèi)表面來(lái)收集細(xì)胞。然后用PBS(磷酸緩沖鹽水)溶液洗滌口腔粘膜細(xì)胞。使腸細(xì)胞生長(zhǎng)于HanksBSS中的Eagle’sBasal培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)中，并于37℃在5％CO2的氣氛中溫育48小時(shí)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(排出生長(zhǎng)培養(yǎng)基，用PBS溶液洗滌基質(zhì)，加入2ml濃度為0.25％的胰蛋白酶-versene)對(duì)所形成的單層(monostrata)進(jìn)行胰蛋白酶處理。再于1700g下將所得懸浮液離心10分鐘。用PBS溶液洗滌細(xì)胞兩次，再用同種溶液稀釋?zhuān)敝吝_(dá)到濃度為100細(xì)胞/ml時(shí)為止。向PBS溶液中的105上皮細(xì)胞(頰細(xì)胞或腸細(xì)胞)中加入107個(gè)已在適宜條件下生長(zhǎng)的細(xì)菌來(lái)進(jìn)行粘附試驗(yàn)。于37℃、連續(xù)攪動(dòng)下將混合物溫育30分鐘。之后，通過(guò)將懸浮液經(jīng)一孔直徑為5μm的聚碳酸酯膜(Sartorius)過(guò)濾，把非粘附細(xì)胞除去。重復(fù)洗滌后，將膜置于一載玻片上、在空氣中干燥、用甲醇固定并用結(jié)晶紫染色，以檢測(cè)粘附細(xì)胞。通過(guò)計(jì)算粘附到100個(gè)細(xì)胞上的細(xì)菌數(shù)目來(lái)確定每個(gè)細(xì)胞上粘附的平均細(xì)菌數(shù)(x)。用下式，把受檢驗(yàn)的菌株的粘附力與用作對(duì)照的菌株ATCC53103的粘附力相比較這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果報(bào)告于表1中。表1.乳酸桿菌菌株對(duì)頰細(xì)胞和人腸細(xì)胞的粘附X＝每個(gè)細(xì)胞的乳酸桿菌數(shù)目；SD＝標(biāo)準(zhǔn)偏差；A.I.＝粘附指數(shù)結(jié)果表明，本發(fā)明的菌株具有極佳的粘附腸細(xì)胞和頰粘膜細(xì)胞的能力；在一些情形中，其結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于參考菌株。在各種pH值下的生長(zhǎng)乳酸桿菌生長(zhǎng)于pH3(加入HCl而達(dá)到)、pH5(培養(yǎng)基的正常pH值)和pH8(加入NaOH而達(dá)到)的MRS(Oxoid)液體培養(yǎng)基中。于37℃、5％CO2氣氛中溫育樣品，在各時(shí)間間隔(12小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí))對(duì)細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果列于表2。表2.各種時(shí)間、各種pH值下細(xì)菌菌株的生長(zhǎng)數(shù)值以logCFU/mL表示。CFU＝菌落形成單位。結(jié)果表明，本發(fā)明的菌株可以在很寬的pH值范圍內(nèi)生長(zhǎng)。特別是，本發(fā)明的菌株表現(xiàn)出對(duì)酸性pH值的抗性，這種抗性相當(dāng)于或優(yōu)于參考菌株。對(duì)膽汁的抗性將本發(fā)明的菌株和參考菌株ATCC53103在MRS液體培養(yǎng)基中溫育48小時(shí)。稀釋內(nèi)湯培養(yǎng)物(107CFU/ml)，使其在添加有1.5g/l或3g/l膽汁(Oxgallpowder，Sigma)的MRS瓊脂上生長(zhǎng)。于37℃在厭氧條件下溫育48小時(shí)后，進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，以證實(shí)對(duì)膽汁的抗性。結(jié)果示于表3。表3.乳酸桿菌菌株對(duì)膽汁的抗性CFU＝菌落形成單位結(jié)果表明，這些新菌株即使對(duì)高濃度的膽汁也具有良好的抗性。特別出乎意料的是，CNCMI-1447即使對(duì)更高濃度值的膽汁也具有抗性。在厭氧和有氧條件下的生長(zhǎng)在厭氧和有氧條件下，于37℃將乳酸桿菌在MRS液體培養(yǎng)基中溫育過(guò)夜，然后計(jì)數(shù)。結(jié)果示于表4。表4.厭氧和有氧條件下乳酸桿菌的生長(zhǎng)CFU＝菌落形成單位結(jié)果表明，本發(fā)明的菌株在厭氧和有氧條件下都能生長(zhǎng)。對(duì)腸內(nèi)病原菌生長(zhǎng)的干擾在與大腸埃希氏桿菌(腸道毒性ATCC35401)和腸炎沙門(mén)氏菌(IMM2)進(jìn)行的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，評(píng)估本發(fā)明的菌株抑制腸內(nèi)病原菌生長(zhǎng)的能力。在第一系列實(shí)驗(yàn)中，讓本發(fā)明的菌株和參考菌株生長(zhǎng)過(guò)夜，然后，于37℃、5％CO2氣氛下，把病原菌與它們?cè)谝环N培養(yǎng)基中接種。該培養(yǎng)基由兩倍濃度的MRS液體培養(yǎng)基與兩倍濃度的Mueller-Hilton液體培養(yǎng)基的1∶1混合物組成。24小時(shí)和48小時(shí)后，對(duì)病原菌和研究中的乳酸桿菌進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。對(duì)照物在于病原菌和作為純培養(yǎng)物生長(zhǎng)的乳酸桿菌菌株。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于表5和表6中。在另一系列實(shí)驗(yàn)中，用本發(fā)明的菌株和參考菌株與病原菌同時(shí)接種，并于上述條件下共同生長(zhǎng)。溫育24小時(shí)和48小時(shí)后，對(duì)病原菌和乳酸桿菌菌株進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。對(duì)照物如前所述。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于表7和表8。病原菌在與乳酸桿菌的共培養(yǎng)中的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果令人驚奇地表明，本發(fā)明的菌株在抑制有害微生物的生長(zhǎng)方面是有效的。實(shí)際上，如表5和表6所示，當(dāng)用埃希氏大腸桿菌和腸炎沙門(mén)氏菌與足量乳酸桿菌同時(shí)接種時(shí)，這兩種病原菌的生長(zhǎng)都受到強(qiáng)烈抑制(在所有情況下發(fā)現(xiàn)，以logCFU/mL表示的數(shù)值＜3)。即使當(dāng)本發(fā)明菌株與病原菌同時(shí)接種時(shí)，也能抑制病原菌的生長(zhǎng)(表7和表8)。特別是在腸炎沙門(mén)氏菌的情形中，當(dāng)乳酸桿菌生長(zhǎng)過(guò)夜再接種時(shí)，可觀察到相同的結(jié)果(對(duì)比表8和表6)。除此之外，令人關(guān)注的是，同時(shí)存在著病原菌并不影響乳酸桿菌菌株的生長(zhǎng)。在所有這些實(shí)驗(yàn)中，有關(guān)乳酸桿菌在共培養(yǎng)中生長(zhǎng)的數(shù)據(jù)可以與其在純培養(yǎng)中生長(zhǎng)的數(shù)據(jù)相比較。表5.腸道毒性的大腸埃希氏桿菌(ATCC35401)和乳酸桿菌在共培養(yǎng)中的生長(zhǎng)1</tables>1乳酸桿菌生長(zhǎng)過(guò)夜，再用大腸埃希氏桿菌接種。24小時(shí)和48小時(shí)后，對(duì)病原菌和乳酸桿菌進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。CFU＝菌落形成單位。表6.腸炎沙門(mén)氏菌(IMM2)和乳酸桿菌在共培養(yǎng)中的生長(zhǎng)11乳酸桿菌生長(zhǎng)過(guò)夜，再用腸炎沙門(mén)氏菌接種。24小時(shí)和48小時(shí)后，對(duì)病原菌和乳酸桿菌進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。CFU＝菌落形成單位。表7</tables>1乳酸桿菌和大腸埃希氏桿菌同時(shí)接種，24小時(shí)和48小時(shí)后，對(duì)病原菌和乳酸桿菌進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。CFU＝菌落形成單位。表8.同時(shí)接種后，腸炎沙門(mén)氏菌(IMM2)和乳酸桿菌在共培養(yǎng)中的生長(zhǎng)1</tables>1乳酸桿菌和腸炎沙門(mén)氏菌同時(shí)接種，24小時(shí)和48小時(shí)后，對(duì)病原菌和乳酸桿菌進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。CFU＝菌落形成單位。在另一系列實(shí)驗(yàn)中，把本發(fā)明乳酸桿菌的混合物與大腸埃希氏桿菌和腸炎沙門(mén)氏菌一起接種，以便評(píng)估這些混合物是否能在抑制病原菌菌株生長(zhǎng)方面具有協(xié)同效果。表9報(bào)道了腸道毒性的大腸埃希氏桿菌菌株35401在與同時(shí)接種的乳酸桿菌的共培養(yǎng)中獲得的一些數(shù)據(jù)。表9.同時(shí)接種后，共培養(yǎng)中各種乳酸桿菌混合物對(duì)腸道毒性的大腸埃希氏桿菌(ATCC35401)的抑制1</tables>1大腸埃希氏桿菌與各種乳酸桿菌混合物同時(shí)接種。24小時(shí)和48小時(shí)后，對(duì)病原菌和乳酸桿菌進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。CFU＝菌落形成單位。數(shù)據(jù)清楚地表明，24小時(shí)和48小時(shí)之后，乳酸桿菌混合物能夠完全抑制病原菌的生長(zhǎng)。而且，在抑制病原菌生長(zhǎng)方面，乳酸桿菌混合物比單一乳酸桿菌菌株更有效(對(duì)比表9和表7)。這些數(shù)據(jù)是對(duì)與乳酸桿菌同時(shí)接種的病原菌得到的。同樣，在這些實(shí)驗(yàn)中，乳酸桿菌的生長(zhǎng)并未受到同時(shí)存在的病原菌和其它乳酸桿菌菌株的影響。對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌，得到了類(lèi)似結(jié)果。從上述數(shù)據(jù)可明顯看出，本發(fā)明的各菌株具有使其特別適合于制備藥物的一系列特征。本發(fā)明的菌株具有粘附人上皮細(xì)胞的能力(移生所需的重要特征)，它們對(duì)膽汁有良好的(即使有時(shí)不是極佳的)抗性。它們?cè)谒嵝詐H值時(shí)有抗性并能生長(zhǎng)，在厭氧和有氧條件下都能生長(zhǎng)。此外，本發(fā)明的單一菌株或各種菌株的混合物顯示出抑制胃腸道中病原菌生長(zhǎng)的驚人能力。在凍干后這些特性仍能保留。于4℃、3個(gè)月后，本發(fā)明的各菌株對(duì)凍干的抗性從35到60％不等。它們還表現(xiàn)出高生長(zhǎng)速率、不出現(xiàn)溶源性。這些特征使這些菌株特別適合于預(yù)防和治療由污染食品或污染水所引起的疾病，以及作為用抗生素治療過(guò)程中或在一般緊張條件下的輔藥。此外，它們的穩(wěn)定性使它們?cè)陬A(yù)防和治療侵染旅客的病原菌的應(yīng)用中特別有前途。在可能發(fā)生不那么有利的微生物的移生的所有情形中，這些菌株也特別適合于治療新生兒(例如，剖腹產(chǎn)嬰兒、早產(chǎn)嬰兒、瓶喂的嬰兒)。最后，它們也可用于生產(chǎn)乳制品和有關(guān)食品。參考文獻(xiàn)1.DrasarB.S.，HillM.J.(1974)，人腸內(nèi)菌群，科學(xué)出版社，倫敦。2.BottazziV.等(1981)，ProbioticaconbatteriLattici，CentroSperimentaleLatte，Milano。3.GillilandS.E.等(1978)，食用含嗜酸乳桿菌的非發(fā)酵乳對(duì)健康男性糞便菌群的影響，乳品科學(xué)雜志，61，1-10。4.Floraintestinalenormalenelbambinoesuemodificazioniincondizionipatologiche，AnalisiIstitutoSuperiorediSanita，Roma，1986。5.BottazziV.(1987)AggiornamentidiMicrobiologiadeibatterilattici，CentroSperimentaleLatte，Milano。6.AlyR.，ShinefieldH.R.(1982)，細(xì)菌干擾，CRC出版社，BocaRaton，美國(guó)。7.ShapiroS.(1960)，用酸奶控制抗生素誘發(fā)的胃腸癥狀，臨床醫(yī)學(xué)，295-299。8.GummaA.等(1972)，適用于用嗜酸乳桿菌進(jìn)行替代治療的蓋侖醫(yī)學(xué)學(xué)說(shuō)的方法的研究，瑞士藥學(xué)學(xué)報(bào)，47，433-437。9.GillilandS.E.(1979)，某些微生物和人之間的有益關(guān)系用作飲食輔助品的候選微生物，食品保護(hù)雜志42，164-167。10.LeeA.(1985)，被忽視的小境胃腸道的微生物生態(tài)學(xué)，微生物生態(tài)學(xué)進(jìn)展，8，115-162，MarshallK.C.-PlenumPressN.Y.。11.ZoppiG.等(1982)，臨床實(shí)踐中的口服細(xì)菌療法，歐洲兒科雜志，139，18-21。12.AkiyoshiH.等(1977)，由嗜酸乳桿菌產(chǎn)生的抑制大腸桿菌的物質(zhì)的分離和鑒定，乳品科學(xué)32，727-730。13.BabelF.J.(1977)，乳酸細(xì)菌培養(yǎng)物的抗菌性，乳品科學(xué)雜志，60，815-821。14.BarefootS.F.，KlaenhammerT.R.(1983)，LactacinB-一種由嗜酸乳桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素-的檢測(cè)和活性，應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)，45，1808-1815。15.TaggJ.R.等(1976)，革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)菌素，細(xì)菌學(xué)綜述，40，722-756。16.SilvaM.等(1987)，得自人乳桿菌屬菌株的抗菌物質(zhì)，抗菌劑化學(xué)療法，31，1231-1233。17.FullerR.，BrookerB.E.(1980)，細(xì)菌在鱗狀上皮細(xì)胞上的粘附及其在腸微生態(tài)學(xué)中的重要性，見(jiàn)微生物在表面上的粘附(BerkeleyR.C.W.，LynchJ.M.，MellingJ.，RutterP.R.，VincentB.，編)，化學(xué)工業(yè)協(xié)會(huì)/EllisHorwoodLtd，倫敦。18.BottazziV.等(1985).Proprietaantitumoralideibatterilatticiedeglialimentifermentaticonbatterilattici.IlLatte10，873-879。19.VanDerWaaijD.(1979)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物消化道的移生抗性及其對(duì)防止傳染的作用，見(jiàn)抗菌治療的新方案(ExcerptaMedica，編)，Utrecht。20.SavageD.C.(1977)，胃腸道的微生物生態(tài)學(xué)，微生物學(xué)年鑒，31，107-133。21.RayB.，JohnsonM.C.(1986)，嗜酸乳桿菌中表層蛋白的凍干損傷及其防護(hù)，Cryo-Lett.7，210。22.SharpeM.E.(1981)，乳桿菌屬，見(jiàn)原核生物(Starr，Stolp，Truper，Balows，Schlegel，編)，pp1653-1679，Springer，N.Y。23.MorelliL.等(1982)，嗜酸乳桿菌菌株D137中質(zhì)粒DNA分子的鑒定，AnnalidiMicrobiologia32，99-105。24.DaviesF.L.等(1982)，質(zhì)粒分布在乳酸鏈球菌菌株鑒定中的價(jià)值以及乳酸鏈球菌712、ML2和C2之間的關(guān)系，應(yīng)用細(xì)菌學(xué)雜志，51，325-337。25.KerstersK.，DeLeyJ.(1980)，對(duì)細(xì)菌蛋白進(jìn)行電泳而進(jìn)行分類(lèi)和鑒定，見(jiàn)微生物分類(lèi)和鑒定(GoodfellowM&amp;BoardR.G.，編)，pp273-297，科學(xué)出版社，倫敦。26.VescovoM.等(1982)，嗜酸乳桿菌和Lactobacillusreuteri中的抗藥性質(zhì)粒，應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)，43，50-56。27.Reniero等，(1991)，斷奶嬰兒‘腸’中持久的干酪乳桿菌亞種干酪菌株的檢測(cè)，應(yīng)用微生物學(xué)快報(bào)，13，3-6。權(quán)利要求1.乳酸桿菌屬菌株，保藏于theCNCMcollectionoftheInstitutPasteur，編號(hào)為I-1390、I-1391、I-1392和I-1447。2.藥物、獸藥或營(yíng)養(yǎng)組合物，含有權(quán)利要求1的乳酸桿菌菌株CNCMI-1390、CNCMI-1391、CNCMI-1392和CNCMI-1447中的至少一種菌株，該組合物為與相容載體的混合物形式。3.藥物、獸藥或營(yíng)養(yǎng)組合物，含有權(quán)利要求2的一種或多種乳酸桿菌菌株，該組合物為與具有互補(bǔ)性質(zhì)的其它菌株的混合物形式。4.根據(jù)權(quán)利要求2和3的藥物、獸藥或營(yíng)養(yǎng)組合物，其中的菌株中至少有一種屬于嗜酸性乳酸桿菌品種，至少有一種屬于非嗜酸性品種。5.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，含有CNCMI-1390、CNCMI-1391、CNCMI-1392和CNCMI-1447所有這些菌株的一種混合物。6.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，其中菌株CNCMI-1390和/或CNCMI-1391和/或CNCMI-1392和/或CNCMI-1447以?xún)龈尚问酱嬖凇?.根據(jù)權(quán)利要求2-6任意權(quán)項(xiàng)的組合物，其為膠囊、溶液或可飲用懸浮液或者袋裝粉劑的形式。8.根據(jù)權(quán)利要求2-7中任一項(xiàng)的組合物，每單一劑量含有每一菌株的細(xì)胞為106～1010。9.乳酸桿菌菌株CNCMI-1390、CNCMI-1391、CNCMI-1392和CNCMI-1447作為制備用于治療或預(yù)防需要施用乳酸桿菌的胃腸病理狀態(tài)的藥物的應(yīng)用。10.根據(jù)權(quán)利要求9的制備用于治療或預(yù)防腸道微生物異常(dysmicrobism)、各種原因的腹瀉或潰瘍性結(jié)腸炎的藥物的應(yīng)用。11.乳酸桿菌菌株CNCMI-1390、CNCMI-1391、CNCMI-1392和CNCMI-1447作為制備用于治療所有不利移生條件下新生兒胃腸道疾病的藥物的應(yīng)用。12.乳酸桿菌菌株CNCMI-1390、CNCMI-1391、CNCMI-1392和CNCMI-1447作為制備乳制品的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及乳酸桿菌菌株及含有它們的藥物組合物。文檔編號(hào)A01N63/00GK1154715SQ95193239公開(kāi)日1997年7月16日申請(qǐng)日期1995年5月18日優(yōu)先權(quán)日1994年5月26日發(fā)明者L·莫哀里,V·波塔茨,L·戈慈尼,C·德漢恩申請(qǐng)人:伯拉考公司