專利名稱：一種豆莢內(nèi)特異表達(dá)毒蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
生物、農(nóng)業(yè)。
現(xiàn)有技術(shù)(與本發(fā)明最接近的技術(shù))早在1991年，荷蘭的植物遺傳系統(tǒng)公司(Plant Genetic Syst.)就專利了用蘇云金毒蛋白(BtToxin)轉(zhuǎn)化植物，進(jìn)行農(nóng)作物防蟲治蟲的技術(shù)(91-339820)，美國的Agracetus公司專利了用轉(zhuǎn)蝎毒和Bt雙價(jià)基因獲得植物抗蟲性的技術(shù)(91-173090)。此后，全世界已有許多家公司或大學(xué)相繼專利了用不同毒蛋白基因轉(zhuǎn)化植物，獲得抗蟲性技術(shù)。澳大利亞的Agric Genetics公司專利了在植物韌皮部中表達(dá)昆蟲毒蛋白或昆蟲代謝產(chǎn)物抑制劑蛋白、獲得抗蟲性的技術(shù)(93-094007)；Mycogen Plant Science公司在1995年專利了用人工合成的Bt基因和高表達(dá)啟動(dòng)子獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲植物的技術(shù)(95-384255)；美國Cornell大學(xué)則專利了傷害特異性表達(dá)啟動(dòng)子指導(dǎo)的抗蟲性(93-134024)。
發(fā)明的目的防止昆蟲毒蛋白在植物可食用部位的累積，提高基因工程抗蟲植物對(duì)人類的安全系數(shù)。
隨著世界人口的不斷增長和對(duì)糧、棉、油的需求日益增加，農(nóng)作物的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)已成為農(nóng)業(yè)發(fā)展的當(dāng)務(wù)之急。蟲害是造成農(nóng)業(yè)減產(chǎn)的重要原因之一，據(jù)估計(jì)，全球范圍內(nèi)蟲害造成的損失約占農(nóng)作物總收獲量的10-15％，每年高達(dá)數(shù)千億美元。大豆食心蟲(Leguminivoraglycinivorella)是我國最主要的大豆害蟲，在全國、尤其是大豆主栽區(qū)——東北及黃淮海流域普遍發(fā)生，危害大豆的豆莢和籽粒，造成蟲口，碎粒等，增加自然脫粒，降低品質(zhì)和產(chǎn)量。該蟲的主要生物學(xué)特性是食性單一，每年一代，只危害大豆和野生大豆，成蟲發(fā)生期短，幼蟲蛀入莢內(nèi)取食豆粒。由于生產(chǎn)上主推品種抗蟲性不強(qiáng)，輪作體制不完善，近年來該蟲已呈蔓延趨勢，嚴(yán)重制約了我國的大豆生產(chǎn)。蟲害發(fā)生較輕時(shí)，蟲食率一般在5-10％左右，嚴(yán)重的年份和地區(qū)可高達(dá)30％以上，有的甚至達(dá)到40-50％！全國常年播種大豆1億畝左右，僅按5％的損失率算，就相當(dāng)于每年減少播種面積500萬畝；若以每畝單產(chǎn)110公斤、每公斤售價(jià)2.30元計(jì)算，直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)12.65億元/年。因此，防治大豆食心蟲已經(jīng)成為我國農(nóng)業(yè)發(fā)展中的一個(gè)重要課題。
回顧害蟲防治方法和策略的演變過程，我們不難發(fā)現(xiàn)全世界都走了彎路。從本世紀(jì)40年代開始，由于化學(xué)農(nóng)藥的問世，許多優(yōu)秀的傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)技術(shù)，如害蟲的天敵、作物內(nèi)在的抗性選擇及栽培措施的利用等均未能得到應(yīng)有的重視。近半個(gè)世紀(jì)的生產(chǎn)實(shí)踐證明，長期、廣泛、大量、連續(xù)施用化學(xué)農(nóng)藥，已經(jīng)帶來了一系列破壞性副作用。第一，由于害蟲產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致用藥量越來越大，用藥次數(shù)越來越頻繁，嚴(yán)重地污染了環(huán)境，影響家禽家畜和野生動(dòng)物的安全性，并威脅人類健康；第二，廣譜殺蟲劑往往導(dǎo)致害蟲的天敵迅速滅亡，害蟲因?yàn)槭ヌ烊桓偁帉?duì)手而繁殖失控，大大降低了防治效果，甚至引起周而復(fù)始的害蟲大爆發(fā)。據(jù)有關(guān)部門統(tǒng)計(jì)，1991至1994年間我國北方及長江流域棉區(qū)棉鈴蟲連續(xù)爆發(fā)，每年直接經(jīng)濟(jì)損失約60億元，其中1992年更高達(dá)100億元。
因此，有效地防治害蟲是增加農(nóng)業(yè)收入的關(guān)鍵措施之一，對(duì)我國國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展有著舉足重輕的影響。但是，常規(guī)育種技術(shù)不僅周期長，效率相對(duì)較低，而且育成的品種往往帶有不良農(nóng)業(yè)性狀，造成不同程度的產(chǎn)量、質(zhì)量下降。用基因工程的手段將抗蟲基因引入農(nóng)作物細(xì)胞中并使其穩(wěn)定表達(dá)和遺傳，從而培育抗蟲作物新品種已經(jīng)成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的方向。首先，抗蟲品種對(duì)作物具有連續(xù)保護(hù)作用，能在任何發(fā)育階段控制害蟲的發(fā)生；其次，抗蟲品種只殺死攝食害蟲，對(duì)非危害生物沒有影響；第三，抗蟲品種不污染環(huán)境，不破壞生態(tài)平衡；第四，與常規(guī)育種或發(fā)展新型殺蟲劑相比，基因工程育種技術(shù)因?yàn)榫哂型顿Y少、成本低、見效快等優(yōu)點(diǎn)而在國內(nèi)外獨(dú)樹一幟。
自從1983年世界上第一例轉(zhuǎn)基因煙草和馬鈴薯同時(shí)獲得成功以來，轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)被廣泛應(yīng)用于提高植物的抗逆性、改良作物品質(zhì)，并不斷被用作生物反應(yīng)器，生產(chǎn)有益于人類的化合物或多肽。有關(guān)轉(zhuǎn)基因植物的研究及其應(yīng)用已經(jīng)受到全世界科學(xué)家、各國政府部門和許多生物公司的關(guān)注。截止94年底，全球已有超過1500例轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)入大田試驗(yàn)，說明基因工程已經(jīng)成為作物品種改良的重要途徑。
最近的統(tǒng)計(jì)表明，蘇云金桿菌毒蛋白基因(Bacillusthuringiensis，insecticidal crystal protein--ICP，又稱Bt-toxin)可能是世界范圍內(nèi)應(yīng)用最廣泛的抗蟲基因。比利時(shí)植物遺傳系統(tǒng)公司、美國孟山都公司和Agracetus公司及中國農(nóng)科院生物中心都先后獲得了轉(zhuǎn)化Bt基因的煙草、番茄和棉花，其中有些已經(jīng)開始在生產(chǎn)上發(fā)揮作用。通常情況下，蘇云金桿菌的ICP蛋白以原毒素的形式進(jìn)入昆蟲幼蟲的中腸道，并被蛋白水解酶水解成為毒性多肽分子?；罨说亩舅啬芘c敏感昆蟲中腸道上皮細(xì)胞表面受體相互作用，形成膜孔道，破壞細(xì)胞的滲透壓和離子平衡，引起細(xì)胞腫脹甚至裂解，幼蟲停止進(jìn)食，饑餓而死。然而，Bt毒蛋白的應(yīng)用也存在不少問題。一是ICP抗蟲譜相對(duì)較窄。雖然目前已分離到眾多的ICP基因，幾乎覆蓋了全部鱗翅目害蟲，但具體而言，每種ICP的抗蟲譜都較窄；二是昆蟲易對(duì)ICP產(chǎn)生耐受性。印度谷螟長期飼喂含有ICP的人工飼料后產(chǎn)生明顯的耐受性，其半致死劑量提高了250倍。其它許多昆蟲也在實(shí)驗(yàn)條件下產(chǎn)生了不同程度的耐受性。研究表明，ICP毒性降低的主要原因是它與幼蟲中腸道上皮細(xì)胞表面受體的親和力降低了。因?yàn)檗D(zhuǎn)基因植物往往使用單一ICP基因，昆蟲產(chǎn)生耐受性的問題將更為突出。
所以，盡快克服害蟲耐受性是當(dāng)前抗蟲植物基因工程面臨的關(guān)鍵問題?？茖W(xué)上一般采用以下三種方法第一，同時(shí)使用兩個(gè)以上的ICP基因轉(zhuǎn)化農(nóng)作物，即使害蟲對(duì)其中一種毒蛋白產(chǎn)生耐受性，也不至于喪失植物的抗蟲能力。這個(gè)方法可能并不好，因?yàn)榍笆鲇《裙让榷际窃陲曃够旌螧t毒蛋白時(shí)產(chǎn)生耐受性的。第二，引入特異表達(dá)機(jī)制，使導(dǎo)入植物的ICP基因只在受害蟲攻擊侵害時(shí)或只在作物易受害蟲攻擊部位高效表達(dá)，減少產(chǎn)生耐受昆蟲種群的環(huán)境選擇壓。這個(gè)方法可能在一定程度上延緩害蟲耐受性的發(fā)生，但并不能從根本上解決問題。防止害蟲耐受性發(fā)生最有效的方法是聯(lián)合使用ICP或其它不同功能的、昆蟲特異性毒蛋白基因，如蝎毒基因、胰蛋白酶抑制劑基因、α-淀粉酶基因等，保證轉(zhuǎn)基因植物同時(shí)表達(dá)數(shù)個(gè)具有不同毒性機(jī)制的蛋白，既拓展了抗蟲譜，又使得昆蟲難以產(chǎn)生耐受性，具有廣闊的應(yīng)用前景。問題在于，如果人類，尤其是嬰兒、小孩和老人，長期食用這些含有毒蛋白的轉(zhuǎn)基因種子，會(huì)不可避免地產(chǎn)生某些不良反應(yīng)。而克隆分離豆莢特異表達(dá)基因的啟動(dòng)子，將這個(gè)(些)啟動(dòng)子插入BmkIT毒蛋白基因上游，導(dǎo)入農(nóng)桿菌中間載體后轉(zhuǎn)化大豆外植體，獲得具有抗蟲性、但種子中沒有任何毒蛋積累的新型工程大豆株系，可能是克服這個(gè)難題的唯一有效方法，肯定會(huì)在生產(chǎn)上發(fā)揮巨大的作用。
內(nèi)容及方案克隆豆莢特異性表達(dá)基因并獲得指導(dǎo)這個(gè)(些)基因特異表達(dá)的啟動(dòng)子，插入東亞鉗蝎昆蟲毒蛋白Bmk IT編碼區(qū)上游，構(gòu)成嵌合基因，通過介體導(dǎo)入植物染色體DNA中，獲得帶有豆莢特異表達(dá)啟動(dòng)子和昆蟲毒蛋白基因Bmk IT的工程植物(見圖1)。該植物具有較強(qiáng)的抗蟲性，但種子內(nèi)不積累或基本不積累(＜大豆總蛋白的0.0001％)昆蟲毒蛋白。
優(yōu)點(diǎn)及效果1).該轉(zhuǎn)基因植物具有顯著的抗蟲性，能在很大程度上減輕蟲害，提高大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)；2).該大豆種子內(nèi)沒有表達(dá)昆蟲毒蛋白，提高了人類食用安全系數(shù)。


圖1.嵌合啟動(dòng)子的構(gòu)建及基因在豆莢內(nèi)的特異表達(dá)示意實(shí)施例本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案為圖權(quán)利要求
1.一種豆莢內(nèi)特異表達(dá)毒蛋白的轉(zhuǎn)基因植物，其特征是(1)克隆得到控制植物豆莢內(nèi)特異表達(dá)基因的啟動(dòng)子；(2)將該啟動(dòng)子克隆到昆蟲毒蛋白編碼區(qū)(基因)的5′上游端；(3)所轉(zhuǎn)化基因只在豆莢內(nèi)表達(dá)，該植物種子內(nèi)沒有或只有極微量昆蟲毒蛋白的累積；(4)能顯著提高食用轉(zhuǎn)基因植物種子的安全性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1(3)所述，其特征在于將僅在豆莢內(nèi)特異表達(dá)的啟動(dòng)子與毒蛋白基因相連，構(gòu)成嵌合基因和表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化植物后獲得豆莢內(nèi)表達(dá)毒蛋白，對(duì)昆蟲有毒殺作用，但種子內(nèi)沒有這種毒蛋白積累的植株。
3.根據(jù)權(quán)利要求1(4)所述，其特征在于這種轉(zhuǎn)基因植物種子食用的安全性，這一設(shè)想可以在玉米、豆類、花生和油菜等農(nóng)作物品種及許多核果類木本植物上實(shí)現(xiàn)。
全文摘要
克隆控制豆莢內(nèi)特異表達(dá)基因的啟動(dòng)子；將該啟動(dòng)子克隆到任何昆蟲毒蛋白編碼區(qū)(基因)的5′上游端；用常規(guī)方法導(dǎo)入植物并獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲株系；所轉(zhuǎn)化基因只在豆莢內(nèi)表達(dá)，該植物種子內(nèi)沒有或只有極微量昆蟲毒蛋白的累積；在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上推廣這一技術(shù)后，能顯著提高食用轉(zhuǎn)基因植物種子的安全性。
文檔編號(hào)A01H1/06GK1143113SQ9610481
公開日1997年2月19日 申請(qǐng)日期1996年4月30日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月30日
發(fā)明者朱玉賢 申請(qǐng)人:北京大學(xué)