專利名稱：作為鐵傳遞氧化抑制劑的新的鐵螯合劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明部分地由NIH Grant AI-33790和NIH Grant HL-48177的政府支持而作出。
本發(fā)明涉及以前未鑒定的高親合性，鐵-結(jié)合系列化合物的化學結(jié)構(gòu)，它被以前的研究者稱作為外螯素(exochelins)，它是由分支桿菌釋放的。本發(fā)明也涉及修飾這些新的鑒定了的化合物以改變其生理性質(zhì)以及這些新鑒定的和修飾的化合物的應用。
在急性心肌梗塞中，心臟組織被兩個連續(xù)的事件，局部缺血期中的氧不足和在再灌注期中的氧化損傷所損害。在局部缺血期中損傷的心肌可通過往局部缺血區(qū)再導入血液而搶救。然而，作為在再灌注組織中，由白細胞遷移到組織中以及產(chǎn)生活潑的氧引起的炎癥應答的結(jié)果，再灌注可導致?lián)p傷。最活潑的種類之一是羥基(·OH)，它在鐵存在下產(chǎn)生并導致細胞死亡。防止(·OH)的形成將防止由此引起的致死細胞損害。已知(·OH)的形成依賴于游離鐵的存在，而鐵螯合劑將防止再灌注損傷。例如，鐵螯合劑去鐵胺，當再灌注之前給藥時，在冠狀動脈閉塞和再灌注期間防止損傷并減少心肌梗塞規(guī)模。然而，在流到局部缺血心肌的血重建之后，再灌注損傷迅速發(fā)生。
(·OH)基的形成依賴于游離鐵的存在；鐵螯合劑可以清除游離鐵，因而使得鐵不能催化羥基形成。然而，這些已知的鐵螯合材料不能由Fenton反應(即EDTA)防止(·OH)產(chǎn)生，而且，進入細胞太慢(即去鐵胺)以致于不能達到足夠的量以迅速作用，而螯合足夠的鐵以防止(·OH)的形成和隨后的細胞破壞。去鐵胺已被證明如果在心肌梗塞發(fā)生之前給藥是有效的，但如果在再灌注開始時或之后給藥是無效的。
類似的心臟組織損傷可在心臟分流術過程中，如在開心手術期間發(fā)生，或在由于手術或損傷而缺乏帶氧血液的其它器官上發(fā)生。
Macham，Ratledge和Barclay在England的University of Hull討論(Lionel P.Macham，Colin Ratledge和Jennifer C.Nocton，“Extracellular Iron Acquisition byMycobacteriaRole of the Exochelinsand Evidence Against the Participation of Mycobactin”，Infection and Immunity，Vol，12，No.6，P1242-1251，Dec.1975；Raymond Baclay和Colin Ratledge，“Mycobactins and Exochelins of Mycobacterium tuberculosis，M.bovis，M.africanum and Other Related Species”，Journal of General Microbiology，134，771-776，(1988)；L.P.Macham和C.Ratledge，“A New Group of water-soluble Iron-binding Compounds from My cobacteriaThe Exochelins”，Journal of General Microbiology，89，379-382，(1975))簡要描述了外螯素，并討論了它們在分支桿菌內(nèi)產(chǎn)生的功能。Macham確定了在細胞外流體中發(fā)現(xiàn)的一種物質(zhì)的存在，他稱之為外螯素。他描述外螯素為可溶于水和氯仿的化合物，該化合物具有螯合游離鐵的能力。據(jù)Macham所言，此物與分布在細胞壁并使鐵轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)的分支桿菌素具有相似性。然而，與此相反，分支桿菌素是親脂的，不溶于水的分子，它不能擴散入，并從細胞外環(huán)境吸收游離鐵。Macham等人認識到，外螯素在生理PH下的功能是使鐵與血清中的其它帶鐵化合物，如轉(zhuǎn)鐵蛋白或鐵蛋白分開，并使鐵以可被分支桿菌素轉(zhuǎn)移的形式存在。Macham等人沒有分離或純化外螯素，但確定它們?yōu)槲?或六肽，具有分子量750至800，含有3mol ε-N-羥基賴氨酸，εN-乙?；?εN-羥基賴氨酸，或εN-羥基賴氨酸和1mol蘇氨酸。而且，取決于外螯素的細菌源，他揭示分子也可包括β-丙氨酸或水楊酸。
Barclay(同上)描述了從結(jié)核分支桿菌和相關種的二十二個不同菌株生產(chǎn)外螯素。然而，這些原研究者沒有確定外螯素的具體結(jié)構(gòu)或確定外螯素除其作為鐵與分布于細胞壁內(nèi)的分支桿菌素的傳送介質(zhì)的之外的任何應用。
因而需要一種在再灌注時可以容易地給藥的物質(zhì)，它將在其形成時螯合游離鐵或使得能防止(·OH)基的形成。進一步地，需要確定外螯素的具體結(jié)構(gòu)以使其功能可被更充分地了解，且其作為診斷，治療和預防藥征的應用可被闡明。
這些需要由本發(fā)明滿足，它包括用外螯素防止由于(·OH)基的形成或存在引起的活組織的損傷。具體地，本發(fā)明涉及在再灌注之前或同時給梗塞的心肌施用外螯素，防止由鐵介導的自由基形成引起的心肌損傷。并且介紹了外螯素的化學結(jié)構(gòu)和修飾的外螯素，以及這些物質(zhì)在治療和診斷哺乳動物疾病方面的其它應用。


本發(fā)明的這些和其它特征，概況和優(yōu)點參考下面的敘述，權(quán)利要求，和附圖而變得更好理解，其中圖1示出了外螯素鐵螯合物(鐵外螯素)和去鐵外螯素(無鐵)分子的化學結(jié)構(gòu)。
圖2示出了在220nm和450nm檢測的結(jié)核分支桿菌培養(yǎng)物濾液的洗脫圖。
圖3示出了在450nm檢測的同樣濾液的洗脫圖和所示各峰的分子量。
圖4示出了在m/z＝720.3的主要含絲氨酸的外螯素的質(zhì)譜和從其確定的結(jié)構(gòu)。
圖5是顯示外螯素混合物用于心肌細胞結(jié)果的細胞損傷抑制的曲線。
圖6是顯示外螯素758C用于心肌細胞結(jié)果的細胞損傷抑制的曲線。
圖7、8，和9是比較外螯素758C，772A和772C用于心肌細胞結(jié)果的細胞損傷抑制圖。
圖10示出了外螯素的鐵螯合物(鐵外螯素)和去鐵外螯素(無鐵)分子的化學結(jié)構(gòu)及引用確定的修飾。本發(fā)明的詳細敘述已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，外螯素可以阻斷，或明顯降低由鐵介導的催化組織/自由基反應，如羥基(·OH)，尤其是在Fenton反應中產(chǎn)生的羥基引起的氧化性傷害，一般稱為再灌注損傷。進一步已發(fā)現(xiàn)外螯素在再灌注開始時或同時給藥時，有效地延緩或防止再灌注損傷。另外，已發(fā)現(xiàn)外螯素包含廣泛得多的類型物質(zhì)，并且與由Macham等人和Barclay等人原推斷的不同的化學結(jié)構(gòu)。
也已發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)可螯合廣泛的金屬產(chǎn)生原先未知的物質(zhì)。除了防止再灌注損傷之外，適當修飾的外螯素可被用于治療某些疾病，攻擊某些細胞，如癌細胞，和被用于監(jiān)視藥物治療的效果并檢測藥物治療的效果并檢測某些病態(tài)的存在。特別是，已知成神經(jīng)細胞瘤細胞的生長可通過用鐵螯合化合物去鐵胺除去鐵而被負影響但對正常細胞的生長沒有類似影響。外螯素的其它應用包括治療由輸液或癌癥化療，尤其是對白血病，引起的鐵過載。
作為分離和純化外螯素的結(jié)果，已發(fā)現(xiàn)外螯素是具有一個分子量范圍和各種不同側(cè)鏈的一族分子。進一步地，純化的外螯素已被制備，且它們作為游離鐵清除劑的應用，如它們在防止傷害組織的羥基(·OH)的形成方面有效，被第一次證明。特別地，純化的結(jié)核分支桿菌的外螯素已被分離，并已顯示在生理pH下可有效地從轉(zhuǎn)鐵蛋白，乳鐵蛋白和鐵蛋白中除去鐵，而不傳送衍生它們的細菌的任何傳染性質(zhì)。也已第一次證明，這些外螯素阻斷通過Fenton反應的羥基形成，并且基于心臟心肌細胞的反應，在進攻發(fā)生之后以及發(fā)作后幾小時給藥，在心肌梗塞或血管損傷之后，可以有效防止對其它組織的再灌注損傷。
在分支桿菌素被廣泛研究的同時，單個外螯素還沒有被分離或純化過，其結(jié)構(gòu)和組成以前一直未被確定過。進一步地，我們已發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有參考文獻錯誤地表征了外螯素，因而未能確定這些化合物的結(jié)構(gòu)。特別是，Macham(同上)認為它們是五-或六肽，具有750至800的分子量，含3mol ε-N-羥基賴氨酸，εN-乙?；?εN-羥基賴氨酸，或εN-羥基鳥氨酸和1mol蘇氨酸。我們發(fā)現(xiàn)外螯素具有更寬得多的分子量范圍，由幾個化合物系列組成，在分子量上具有可確定的差別，只包括2molε-N-羥基賴氨酸并且不是肽。肽是由第一分子的羰基與另一分子的氨基縮合形成酰胺鍵(-CO-NH-)形成的氨基酸(NH2-CHR-COOH)的聚合物。外螯素不能被認為是肽。代替的是，它們含有3個氨基酸和由酰胺(-NH-CO-)，羥基酰胺(-NH(OH)-CO-)和酯縮合(-CO-O-)形成的其它結(jié)構(gòu)部分(水楊酸，二羧酸或單酯同系物，和羥基羧酸)。其鐵-和去鐵形式示于圖1中。
制備-外螯素從結(jié)核分支桿菌的有毒(Erdman)和無毒(H37Ra)菌株產(chǎn)生和純化。為了促進結(jié)核分支桿菌外螯素的產(chǎn)生，該菌在缺鐵介質(zhì)中培養(yǎng)。特別地，結(jié)核分支桿菌的Erdman菌株(美國典型培養(yǎng)物保藏中心35801)和H37Ra(ATCC25177)在37℃在5％CO2中在Middlebrook 7H11瓊脂平板上生長。14天后，細菌被收獲，在培養(yǎng)瓶中懸浮于150ml改良的Sauton’s培養(yǎng)基中并溫育3至8周。改良的Sauton’s培養(yǎng)基含0.12mg/l檸檬酸鐵銨而不加表面活性劑。
富鐵外螯素(鐵外螯素)然后通過過濾回收，用鐵飽和，并用氯仿提取，通過高壓液相色譜(HPLC)純化。具體地，從上述懸浮液得到的上層清液連續(xù)濾過0.8μm和0.2μm低蛋白結(jié)合濾紙。外螯素然后通過與氯化鐵(每升培養(yǎng)物濾液150mg)接觸使過濾的上層清液飽和而載鐵。鐵外螯素與氯仿(每1.5體積的氯仿1體積培養(yǎng)物濾液)混合，分開各層后，富外螯素的氯仿層被取出并在無水硫酸鎂(2g/l)中貯存。氯仿提取液然后通過燒結(jié)玻璃過濾器，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)而蒸發(fā)，留下一褐色殘余物。
此褐色殘余物通過懸浮于5ml第一緩沖溶液(0.1％三氟乙酸)中，并引入液相色譜柱(C-18 Sep-Pak柱體)而進一步純化。接近柱頂形成的褐色帶用第二緩沖液(0.1％TFA，5 0％乙腈)洗脫。部分純化物然后在0.1％三氟乙酸中稀釋三倍并在1ml/min進行逆相高壓液相色譜分離，接著暴露于C-18柱。在HPLC洗脫液中富鐵外螯素的存在通過同時監(jiān)測指示酰胺和芳香基的450nm峰(鐵化合物)和220nm峰的UV吸收而檢測。大約5個主峰和10個小峰，示于圖2，從最后的C-18柱洗出，顯示了高的450/220nm的吸收比。這些被質(zhì)譜確證為外螯素。主峰通過在一烷基苯基柱上第二次逆相HPLC進一步純化。從結(jié)核分支桿菌的Erdman菌株回收的外螯素與從H37Ra菌株回收的外螯素完全相同。
表征-基于以其鐵-(Fe3+)形式，從柱子洗出的多個峰的LSIMS和ESI-MS分析，鐵-外螯素不限于上面詳細說明的兩個具體分子，但包括質(zhì)量在716至828道爾頓范圍內(nèi)的種族。該族的各個成員表現(xiàn)為與其鄰物相差14道爾頓，反映出在R1烷基側(cè)鏈中CH2的值，和/或2道爾頓，反映出在R1烷基側(cè)鏈中雙鍵的存在。因此，外螯素看起來形成兩個系列，每個系列的隨后成員在質(zhì)量上差14道爾頓，飽和的系列具有質(zhì)量約716，730，744，758，772，786，800，814和828道爾頓，而不飽和系列具有質(zhì)量742，756，784，798，812和826。另外，在R3上存在或不存在甲基(即H或CH3)進一步定義了另外的兩個系列分子，稱作絲氨酸(R＝H)和蘇氨酸系列(R3＝CH3)，由氨基酸分析確證。最極性的化合物在圖的左邊(早洗出)，而最小極性(最易溶于脂)的在右邊。然而所有峰都是水溶性的。其中多于一個峰被發(fā)現(xiàn)具有同樣的分子量，各個峰進一步被標為A，B或C(即758A，B和C)以指示極性水平，A代表極性更大的化合物，而C代表極性較小形式。極性更大的形式據(jù)信是由甲基連接在分子的不同位置上引起的。
外螯素的結(jié)構(gòu)-圖4示出了在主要飽和的含絲氨酸的去鐵外螯素的誘導離解(He在2kev漂浮，碰撞能量6keV)條件下串聯(lián)質(zhì)譜計分析的結(jié)果，(M+H)+為m/z720.3。碎片離子被歸結(jié)于從由酰胺或酯鍵產(chǎn)生的破裂產(chǎn)物產(chǎn)生的六個結(jié)構(gòu)片斷之一，相對于中性分子的氫轉(zhuǎn)移，與示于附圖4中的譜標明的各個峰關聯(lián)。外螯素的酸水解和甲基化導致水楊酸和庚二酸的形成。質(zhì)譜圖解分析表明庚二酸作為甲基酯存在于外螯素內(nèi)。
基于這一分析，鐵外螯素和去鐵外螯素的一般結(jié)構(gòu)示于圖1中。顯示在R4位的甲基(如圖10中定義的)可以在R5位。鐵-外螯素芯分子圍繞中心的鐵。它含有3個氨基酸部分(兩個N-羥基賴氨酸和1個絲氨酸或蘇氨酸，取決于R3是氫還是甲基)。外螯素和結(jié)核分支桿菌的分支桿菌素之間的主要差別是外螯素中的R1要么以飽和烷基甲基酯((CH2)NCOOCH3)要么以單個不飽和烷基甲基酯(CH2)xCH＝CH(CH2)yCOOCH3存在，且外螯素比分支桿菌具有短得多的烷基側(cè)鏈，這些側(cè)鏈終止于甲基酯部分。這些差別提供了外螯素的水溶性和其在細胞外環(huán)境中發(fā)揮功能的能力。
臨床應用-外螯素給藥防止再灌注損傷的臨床應用通過用于成年大鼠心肌細胞而被證明。
在下面的實施例中，以去鐵-和鐵-形式的不同外螯素，將由在圖3的洗脫曲線中所示的分子量確認。實施例1在大鼠被麻醉后，將雄性大鼠的心臟切除，實施開胸術，心臟就地冷凍。切除的心臟然后放在Langendorff上，并用膠原酶和透明質(zhì)酸酶以50μM鈣，在改良的Krebs Ringer緩沖溶液中灌注。然后將組織細分，并分散在膠原酶/胰蛋白酶溶液中，過濾到冷的胰蛋白酶抑制劑溶液中，并暴露以升高鈣濃度。除去損壞的細胞后，保留的細胞懸浮液被放入幾個涂有昆布氨酸的塑料培養(yǎng)皿中，其中裝有含5％胎牛血清的培養(yǎng)基。
培養(yǎng)物被放置48小時后，往每個皿中加入過氧化氫，在不同的時間間隔測量指示細胞損傷的乳酸脫氫酶活性(LDH)。用于比較的細胞損傷指數(shù)(CII)通過測量LDH獲得，LDH的測量是在非暴露的細胞培養(yǎng)物中，在條件(0指數(shù))，和暴露于溶解100％心肌細胞的去污劑(1％Triton X-100)(代表CII為100)中進行。然后在不同時期在特定處理條件下測定LDH，測定的相應CII值和單個結(jié)果針對時間標繪圖(圖5)。
用上述操作，外螯素772C和784去鐵形式的混合物(772C峰和784峰5050混合物)，-一個相對無極性的物質(zhì)-，被分離并用于處理細胞培養(yǎng)物。外螯素通過在pH6用50毫摩爾EDTA溫育幾天而轉(zhuǎn)化為去鐵外螯素形式。去鐵形式然后通過氯仿萃取再純化。
三個細胞樣品被暴露于a)H2O2，b)同時加入的H2O2和50μM去鐵外螯素(無鐵外螯素)，或者c)在往細胞培養(yǎng)物(預溫育)中加入100μM去鐵外螯素2小時之后加入的H2O2。在4小時后，未處理的細胞培養(yǎng)物顯示幾乎62％的細胞損傷。相對地，在過氧化物加入的同時，或2小時之前加入外螯素基本防止或明顯降低了細胞損害，細胞損傷為大約2至9％。實施例2用比外螯素772C和784相對更具極性的去鐵外螯素758C重復實施例1的過程。當去鐵外螯素758C在輸送H2O2同時或15分鐘之內(nèi)被輸送時，在效果上只有很小的差別或沒有差別。對于兩種物質(zhì)，2小時后，細胞損傷基本上與對照相同。然而，在H2O2導入之前2小時輸送去鐵外螯素758C，使細胞破壞削減到CII約20。結(jié)果示于圖6中。實施例3用去鐵外螯素772A，772C和758C重復上述過程。標繪于圖7-9的是提前2小時，同時和延遲20分鐘輸送外螯素的結(jié)果。在所有條件下只有外螯素772C顯示阻止損傷，而外螯素772A在任何條件下都無效。另一方面，外螯素758C只有如果在過氧化物導入前2小時被輸送才顯示保護作用。因而概括出，當在(·OH)基形成時或形成后，即損傷發(fā)生后給藥時，相對非極性的更脂溶性的外螯素是有效的；更極性的外螯素必須在自由基產(chǎn)生前1至2小時給藥才防止或降低細胞破壞。實施例4
外螯素與主體鐵-結(jié)合性蛋白質(zhì)爭奪鐵的容量通過將去鐵外螯素與轉(zhuǎn)鐵蛋白，乳鐵蛋白，或鐵蛋白溶液以鐵與外螯素4∶1和1∶1的摩爾比溫育測定。外螯素從其去鐵形式向鐵形式的轉(zhuǎn)化然后通過反相HPLC測定。將去鐵外螯素暴露于95％鐵-飽和的轉(zhuǎn)鐵蛋白1分鐘內(nèi)，外螯素開始從轉(zhuǎn)鐵蛋白吸收鐵，1小時內(nèi)，外螯素完全被鐵飽和。鐵也容易從40％鐵-飽和的轉(zhuǎn)鐵蛋白除去，接近于存在于血清中轉(zhuǎn)鐵蛋白中的鐵濃度。當去鐵外螯素被暴露于鐵-飽和的乳鐵蛋白時，得到類似的結(jié)果。類似地，鐵蛋白向外螯素釋放鐵，但與其它鐵結(jié)合性蛋白質(zhì)相比，速度較慢。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，外螯素在生理系統(tǒng)中在清除游離鐵方面非常有效，并從帶鐵蛋白質(zhì)中吸走鐵。特別是已發(fā)現(xiàn)外螯素能有效地阻斷羥基自由基(·OH)的形成，因而明顯降低或防止損傷，當血液循環(huán)到該組織時，局部缺血組織被重建，更高分子量更小極性的外螯素在防止細胞破壞方面更有效。在對心組織的益處已被證明的同時，循流向血液中斷的其它身體器官，包括但不限于腦、腎，肝、腸和骨骼肌肉的外螯素應用的益處現(xiàn)在也明顯了。
實驗顯示，外螯素的親合性不限于鐵，其它金屬也可被螯合，如Na，K，Mn，Mg，Al和Zn。因此，外螯素可被用于往體內(nèi)輸送各種需要的金屬或在體內(nèi)螯合各種不需要的金屬。另外，某些細胞，包括某些癌細胞已知需要或親合某些金屬。這可被用于輸送連接在外螯素上的細胞活潑的化合物以破壞該細胞(化療)或?qū)⑦B接在外螯素上的有用藥物瞄準患病器官。相反地，由于某些癌細胞需要很多鐵，去鐵外螯素可被用于結(jié)合游離鐵，因此防止鐵輸送到癌細胞，導致癌細胞的破壞。
在從結(jié)核分支桿菌回收的外螯素的結(jié)構(gòu)被示于圖1的同時，已知其它分支桿菌可產(chǎn)生外螯素，依賴于衍生它們的分支桿菌，這些外螯素可具有不同結(jié)構(gòu)并包括不同的氨基酸。然而，所有外螯素的行為相似，并以相似的系列存在，其相鄰的成員具有相似的分子量級數(shù)。系列不同成員的效果也取決于分子的相對極性。因此，本發(fā)明預期外螯素從其它分枝桿菌產(chǎn)生，包括，但不限于，結(jié)核分枝桿菌，田鼠分枝桿菌，牛分枝桿菌，非洲分枝桿菌，堪薩斯代分枝桿菌，海分枝桿菌，胃分枝桿菌，無色分枝桿菌，土分枝桿菌，次要分枝桿菌，M.malmoense，M.shimoidei，戈特氏分枝桿菌，M.asiaticum，M.szulgai，猿分枝桿菌，M.scrofulaceum，鳥分枝桿菌，胞內(nèi)分枝桿菌，蟾分枝桿菌，潰瘍分枝桿菌，M.hacmophilum，M.farcinogenes，鼠麻瘋分枝桿菌，副結(jié)核分枝桿菌，M.chelonae subsp.chelonae，M.chelonae subsp.abscessus，偶發(fā)分枝桿菌，M.chitae，M.senegalense，M.agri，恥垢分枝桿菌，草分枝桿菌，M.thermoresistibile，M.aichiense，M.aurum，M.chubuense，M.duvalii，淡黃分枝桿菌，M.gadium，M.givum，M.komossense，M.neoaurum，M.obuense，M.parafortuitum，M.rhodesiac，M.sphagni，M.tokaiense或牝牛分枝桿菌。
也預期外螯素可被修飾以實現(xiàn)其溶解性，金屬螯合能力或細胞吸收速率。另外，修飾的外螯素或外螯素以其金屬螯合狀態(tài)的檢測，用單克隆抗體或化學分析作為診斷工具，通過血液分析，尿分析或非侵入性器械技術，以監(jiān)測病態(tài)進展或治療效果。特別地，對于示于圖10中的含金屬和無金屬化合物的結(jié)構(gòu)，下列取代基被提出R1＝(CH2)nCH3為直鏈或支鏈；(CH2)nCOOH，一個脂肪酸；(CH2)nCOOR，一個脂肪酸酯，其中R為烷基；(CH2)nCONH2；R2＝在烷基的4個開環(huán)位的任何一個的取代基，磺酰胺，羥基，鹵素，乙?；?，氨甲酰基，胺，NO2或其任何組合；R3-H(絲氨酸)或CH3(蘇氨酸)可被在可以形成環(huán)狀噁唑啉結(jié)構(gòu)的β-羥基氨基酸上發(fā)現(xiàn)的側(cè)鏈置換。
R4a和R4b＝H，CH3或其它烷基或取代的烷基；R5a和R5b＝H，CH3或其它烷基或取代的烷基；X＝O，NH，S，CH2；M＝單，二，或三價金屬如Pb，Al，Cd，Ni，Ag，Au，As，Mg，Mn，Zn，Cu，Ru，Nb，Zr，Ta，V，Ga，Pt，Cr，Sc，Y，Co，Ti，Na，K；*代表手性中心，可以是R或S；
在螯合金屬時涉及的各種羥基(OH)可被各種官能團如H或鹵素置換，以改變用于螯合金屬的化合物的親合性，或?qū)⒎肿愚D(zhuǎn)化為金屬拮抗劑。
盡管本發(fā)明已經(jīng)用某些優(yōu)選的方案和其應用相當詳細地描述過了，但其它方案和應用也是可能的。例如，外螯素可以通過封閉分枝桿菌的鐵入口，從體內(nèi)除去毒性水平的金屬，或?qū)⑿枰慕饘佥斔偷襟w內(nèi)而用于攻擊傳染性細菌，如結(jié)核分枝桿菌。進一步地，修飾過的含金屬的外螯素可在體內(nèi)輸送附加的活性藥物或化學藥物到優(yōu)先吸收螯合的金屬和優(yōu)選吸收外螯素的位置，而螯合金屬可被用作由其它藥征，如用于癌細胞低溫治療的微波能，治療的靶。因此，權(quán)利要求的精神和范圍不應限于包含于本文中優(yōu)選方案的敘述。
權(quán)利要求書按照條約第19條的修改1、用于保護哺乳動物的活組織不受由于暴露于羥基自由基引起的損傷的組合物，所述自由基在限制血液流向某一身體器官之后，隨著重建流體流向該身體器官而形成，所說組合物包括有效量的去鐵外螯素，所說的有效量隨著流體流向組織的重建而給予活組織。
2、權(quán)利要求1的組合物，其中去鐵外螯素在流體給藥之前施用。
3、如權(quán)利要求1的組合物，其中去鐵外螯素至少在流體給藥開始時施用。
4、如權(quán)利要求1的組合物，其中去鐵外螯素在流體給藥開始約15分鐘內(nèi)施用。
5、如權(quán)利要求1的組合物，其中活組織是心肌，而流體選自由再灌注溶液和心臟麻痹溶液組成的一組。
6、如權(quán)利要求1的組合物，所說的組合物含有有效量的至少一種去鐵外螯素。它具有下式 其中R1選自由(CH2)NCOOCH3和(CH2)xCH＝CH(CH2)yCOOCH3組成的一組，N為1至7，x+y為1至5，而R3選自由H和CH3組成的一組，所說的去鐵外螯素具有約716至約826道爾頓的分子量。
7、如權(quán)利要求6的組合物，所說的組合物包括具有772和784道爾頓分子量的去鐵外螯素的混合物。
8、如權(quán)利要求6的組合物，所說的組合物包括特征為N是5至7的整數(shù)的相對非極性的去鐵外螯素的混合物。
9、如權(quán)利要求6的組合物，所說的組合物包括特征為x+y是4或5的相對非極性去鐵外螯素的混合物。
10、一種用于防止哺乳動物的活組織由于鐵存在介導的羥基形成產(chǎn)生的損傷的組合物，包括有效量的至少一種去鐵外螯素，它具有下式 其中R1選自由(CH2)NCOOCH3和(CH2)xCH＝CH(CH2)yCOOCH3組成的一組，N為1至7、x+y為1至5，R3選自由H和CH3組成的一組，所說的去鐵外螯素具有約716至約826道爾頓的分子量。
11、一種用于輸送有效量的活性化合物到哺乳動物以治療疾病的組合物，所說的組合物具有下式 其中R1為選自由(CH2)nCH3，(CH2)nCOOH，(CH2)nCOOR組成的小類，其中R為烷基和(CH2)nCONH2組成的一組的化學部分R2為在環(huán)的4個開環(huán)位置的任何一個取代的化學部分，所說的化學部分選自由烷基，磺酰胺，羥基，鹵素，乙酰基，氨基甲?；?，胺和NO2和其組合；R3為選自由在可以形成環(huán)狀惡唑啉結(jié)構(gòu)的β-羥基氨基酸上發(fā)現(xiàn)的側(cè)鏈組成的一組的化學部分；R4a、R4b、R5a、R5b是選自由H，烷基和取代的烷基組成的一組的化學部分，且*代表可以是R或S的手性中心。
12、如權(quán)利要求11的組合物，其中所說的組合物選自由飽和的和不飽和的化合物組成的一組，飽和的化合物具有716，730，744，758，772，786，800，814和828道爾頓的質(zhì)量，而不飽和的化合物具有742，756，770，784，798，812和826的質(zhì)量。
13、如權(quán)利要求11的組合物，所說的組合物當暴露于金屬離子溶液時，形成具有下式的金屬螯合物； 其中M選自由鐵，鉛，鋁，鎘，鎳，銀，金，砷，鎂，錳，鋅，銅，釕，鈮，鋯，鉭，釩，鎵，鉑，鉻，鈧，釔，鈷，鈦，鈉和鉀組成的一組。
14、如權(quán)利要求13的金屬螯合物，其中M是鐵。
權(quán)利要求
1.一種保護哺乳動物活組織不受由于暴露于羥基自由基而引起的損傷的方法，所述自由基由在限制血液流向某一身體器官之后，隨著重建流體流向該身體器官而形成，所述方法包括與重建流體流向組織連同對哺乳動物施用含有效量的去鐵外螯素的組合物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中去鐵外螯素在流體給藥之前施用。
3.權(quán)利要求1的方法，其中去鐵外螯素至少在流體給藥開始時施用。
4.權(quán)利要求1的方法，其中去鐵外螯素在流體給藥開始約15分鐘內(nèi)施用。
5.權(quán)利要求1的方法，其中活組織是心肌，而流體選自由再灌注溶液和心臟麻痹溶液組成的一組。
6.權(quán)利要求1的方法，其中組合物含有有效量的至少一種去鐵外螯素，它具有下式 其中R1選自由(CH2)NCOOCH3和(CH2)xCH＝CH(CH2)yCOOCH3組成的一組，N為1至7，x+y為1至5，而R3選自由H和CH3組成的一組，所說的去鐵外螯素具有約716至約826道爾頓的分子量。
7.權(quán)利要求6的方法，其中組合物包括具有772和784道爾頓分子量的去鐵外螯素的混合物。
8.權(quán)利要求6的方法，其中組合物包括特征為N是5至7的整數(shù)的相對非極性的去鐵外螯素的混合物。
9.權(quán)利要求6的方法，其中組合物包括特征為x+y是4或5的相對非極性去鐵外螯素的混合物。
10.一種用于防止哺乳動物活組織由于鐵存在介導的羥基形成產(chǎn)生的損傷的組合物，包括有效量的至少一種去鐵外螯素，它具有下式 其中R1選自由(CH2)NCOOCH3和(CH2)xCH＝CH(CH2)yCOOCH3組成的一組，N為1至7，x+y為1至5，而R3選自由H和CH3組成的一組，所說的去鐵外螯素具有約716至約826道爾頓的分子量。
11.一種用于輸送有效量的活性化合物到哺乳動物以治療疾病的組合物，所說的組合物具有下式 其中R1選自由(CH2)nCH3，(CH2)nCOOH，(CH2)nCOOR，其中R為烷基和(CH2)nCONH2組成的一組的化學部分；R2為在環(huán)的4個開環(huán)位置的任何一個取代的化學部分，所說的化學部分選自由烷基，磺酰胺，羥基，鹵素，乙?；?，氨基甲?；?，胺和NO2和其組合；
全文摘要
外螯素可被用于防止由于(·OH)基的形成或存在造成的對活組織的損害。特別地，本發(fā)明涉及在再灌注之前或同時對梗塞的心肌施用外螯素以防止由于鐵介導的自由基形成引起的心肌損傷。還涉及外螯素和修飾的外螯素的化學結(jié)構(gòu)，以及這些物質(zhì)在治療和診斷哺乳動物疾病方面的其它應用。
文檔編號A01N1/02GK1145588SQ96190073
公開日1997年3月19日 申請日期1996年1月26日 優(yōu)先權(quán)日1995年2月3日
發(fā)明者羅倫斯·霍維茨, 馬庫斯·A·霍維茨, 布拉德福德·W·吉布森, 約瑟夫·里夫 申請人:加利福尼亞大學董事會