專利名稱：轉(zhuǎn)基因棉花抗蟲檢測(cè)法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬檢測(cè)方法。
對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花抗蟲性的檢測(cè)，目前國(guó)內(nèi)外采取兩種方法，即分子檢測(cè)和生物學(xué)測(cè)定。分子檢測(cè)要使用一些精密儀器和同位素，操作復(fù)雜，一般由分子生物學(xué)研究人員完成。生物學(xué)測(cè)定，一方面需要飼養(yǎng)棉鈴蟲，另一方面需種子長(zhǎng)成植株后才能鑒定，另外環(huán)境氣候還造成檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。種子經(jīng)營(yíng)和基層育種單位一般不具備分子檢測(cè)的條件，他們雖然具備生物學(xué)測(cè)定的條件，但種子單位無(wú)法在購(gòu)種時(shí)檢測(cè)種子是否抗蟲，育種單位無(wú)法在選擇單株時(shí)確定所選種子是否抗蟲。因此，目前的方法不能滿足科研生產(chǎn)單位對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花抗蟲的檢測(cè)。
本發(fā)明的目的就是為種子和育種單位提供一套快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因棉花抗蟲檢測(cè)試劑及檢測(cè)方法。
本發(fā)明包括試劑盒、試劑制備方法和檢測(cè)方法。試劑盒由4支5ml離心管、1支10ml離心管和支持膜組成，可以放置在一個(gè)塑料包裝袋內(nèi)，也可以組成一個(gè)盒。這5個(gè)離心管和支持膜的組成成份如下。
1.對(duì)照液，體積1ml，將0.875mg純化毒蛋白溶于0.5mol/L磷酸緩沖液中。毒蛋白通過(guò)蘇云金桿菌HD-1菌株發(fā)酵制備并提純。
2.提取液，體積10ml，使用時(shí)蒸餾水稀釋10倍。其成份內(nèi)含5g聚山梨醇脂20，0.5mol/LTris-HCl，pH值7.9，1.5mol/L NaCl。
3.支持膜，5張，每張82mm2，為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口硝酸纖維素膜。
4.封閉劑，體積5ml，用時(shí)蒸餾水稀釋10倍。其成份跟提取液基本相同。再加入7.5g胎牛血清蛋白。
5.酶標(biāo)抗體，體積0.5ml，使用時(shí)用提取液稀釋500倍。制備方法為，用提純抗原免疫日本大耳白兔，純化高效價(jià)IgG抗體，用過(guò)碘酸法標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶，再加入適量牛血清蛋白作保護(hù)劑制備而成。
6.顯色液，體積5ml，用時(shí)用蒸餾水稀釋10倍，內(nèi)含25mg，3＇3二氨基聯(lián)苯胺、0.5mol/L Tris-HCl，用前加30％雙氧水。
操作方法分為快診膜制備、檢測(cè)和顯色判別三個(gè)步驟。
本方法具有操作方便、檢測(cè)靈敏、成本低廉、重復(fù)性好、不需復(fù)雜儀器等優(yōu)點(diǎn)。最主要的特點(diǎn)是可以在種子期(或幼苗期)取樣，6個(gè)小時(shí)內(nèi)即獲得檢測(cè)結(jié)果。經(jīng)過(guò)對(duì)目前推廣的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉檢測(cè)驗(yàn)證。符合率達(dá)100％。
說(shuō)明書附圖


圖1轉(zhuǎn)基因棉花抗蟲檢測(cè)設(shè)備及試劑。
圖1中，1.對(duì)照液、2.提取液、3.封閉液、4.酶標(biāo)抗體、5.顯色液、6.支持膜圖2轉(zhuǎn)基因棉花抗蟲檢測(cè)操作程序本發(fā)明最佳實(shí)施例實(shí)施本發(fā)明的基本原料均已組配在試劑盒中，實(shí)施過(guò)程中還需要加樣器、蒸餾水和40℃左右的溫水。操作方法分為以下三步(1)快診膜的制備，取1g種子(或葉片)，加1ml提取液，研細(xì)，靜置1小時(shí)。用加樣器取5μl上清液加在支持膜上，并加1μl對(duì)照，自然干燥?？梢粤⒓礄z測(cè)。也可以長(zhǎng)期保存。(2)檢測(cè)。將快診膜放入10ml封閉劑中，在37℃下封閉1小時(shí)，取出后放置在10ml酶標(biāo)抗體的稀釋液中，在37℃溫育1小時(shí)。(3)顯色判別，取出快診膜、置入10ml稀釋顯色液中，待對(duì)照出現(xiàn)黃色斑點(diǎn)時(shí)，取出干燥。凡能顯示黃色斑點(diǎn)的為抗蟲種子，否則不抗蟲。
本方法在種子經(jīng)營(yíng)和育種單位具有較廣闊的使用前途。檢測(cè)結(jié)果靈敏、方法簡(jiǎn)單。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因棉花抗蟲檢測(cè)法，檢測(cè)試劑主要由對(duì)照液、提取液、支持膜、封閉劑、酶標(biāo)抗體和顯色液組成，其特征在于將種子或葉片提取液加在支持膜上，在封閉劑和酶標(biāo)抗體液中溫育后，再由顯色液顯色，以測(cè)定棉花是否抗蟲。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因棉花抗蟲檢測(cè)法，其特征在于支持膜為硝酸纖維素膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因棉花抗蟲檢測(cè)法，其特征在于酶標(biāo)抗體為兔抗Bt抗體。
全文摘要
轉(zhuǎn)基因棉花抗蟲檢測(cè)法,屬檢測(cè)方法。它分為檢測(cè)試劑的制備和操作方法兩部分。試劑由對(duì)照液(B
文檔編號(hào)A01C1/00GK1183558SQ9710614
公開(kāi)日1998年6月3日 申請(qǐng)日期1997年10月16日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月16日
發(fā)明者沈法富, 于元杰, 尹承佾 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)