專利名稱：編碼反芻微生物肌醇六磷酸酶的dna序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及源于反芻微生物的肌醇六磷酸酶。
背景技術(shù)：
盡管家畜飼料中的植物成分富含磷，為了使單胃動(dòng)物生長(zhǎng)良好，飼料中必需添加無(wú)機(jī)磷。植酸(肌醇六磷酸)通常與鈣、鎂和鉀鹽和/或蛋白質(zhì)形成復(fù)合物存在，并且是谷物、油質(zhì)種子、豆科植物中磷的主要形式，占種子干重的1-3％及種子總磷的60-90％(Graf,1986)。然而，單胃動(dòng)物(如豬、家禽及魚)利用肌醇六磷酸鹽的能力很差或根本不利用肌醇六磷酸鹽，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈δ軌蛩饧〈剂姿猁}的胃腸道酶。肌醇六磷酸經(jīng)過(guò)上消化道時(shí)基本上沒(méi)有變化，在此它可通過(guò)螯合礦物質(zhì)(如鈣和鋅)，結(jié)合氨基酸和蛋白質(zhì)(Graf,1986)及抑制酶活性降低營(yíng)養(yǎng)成分的生物有效性。糞便中的肌醇六磷酸磷造成嚴(yán)重的污染問(wèn)題，有助于世界上家畜生產(chǎn)密集地區(qū)表面水的加富過(guò)程。
生產(chǎn)低效性及由肌醇六磷酸引發(fā)的磷污染問(wèn)題可通過(guò)在單胃動(dòng)物飼料中補(bǔ)充肌醇六磷酸酶得到有效改善。肌醇六磷酸酶可催化肌醇六磷酸鹽水解成肌醇和無(wú)機(jī)磷酸鹽，后者可被小腸吸收。除了降低磷補(bǔ)充及減少肌醇六磷酸污染物釋放量，肌醇六磷酸酶可減少肌醇六磷酸的抗?fàn)I養(yǎng)效應(yīng)。
肌醇六磷酸酶可在動(dòng)物及植物組織(主要是種子)及多種微生物中產(chǎn)生(美國(guó)專利No.3,297,548；Shieh and Ware,1968；Ware andShieh,1967)，盡管潛在的肌醇六磷酸酶源很多，只有土壤霉菌(黑曲霉(Aspergillus niger)或無(wú)花果曲霉(Aspergillus ficuum))用于商業(yè)生產(chǎn)肌醇六磷酸酶。無(wú)花果曲霉產(chǎn)生的肌醇六磷酸酶與已確定的由其他微生物(歐洲專利申請(qǐng)No.0,420,358(van Gorcum等，1991)和美國(guó)專利No.5,436,156(van Gorcum等，1995年7月25日發(fā)布))產(chǎn)生的肌醇六磷酸酶相比，前者具有更大的特異性活性(100單位/毫克蛋白(其中的單位定義為每分鐘釋放的磷酸鹽的微摩爾數(shù)))和熱穩(wěn)定性。此無(wú)花果曲霉肌醇六磷酸酶是酸性肌醇六磷酸酶，當(dāng)pH大于5.5時(shí)，其活性很小(Howson和Davis,1983；van Gorcum等，1991)。所以，其活性局限于單胃動(dòng)物消化道這樣一個(gè)相對(duì)小的區(qū)域，其中的pH為2-3(胃)-4-7(小腸)。
盡管在單胃動(dòng)物飼料中補(bǔ)充肌醇六磷酸酶的想法在25年以前就被提出(美國(guó)專利No.3,297,548,Ware和Shieh,1967)，生產(chǎn)此酶的高成本使得肌醇六磷酸酶的應(yīng)用僅局限于家畜工業(yè)。在北美，補(bǔ)充肌醇六磷酸酶比補(bǔ)充磷的成本更高。在某些情況下，使用肌醇六磷酸酶的成本通過(guò)由于使用此酶而降低了如鈣這樣的第二種營(yíng)養(yǎng)成分的補(bǔ)充得以抵消。在北美，隨著豬和家禽數(shù)量增加及公共要求降低由家畜生產(chǎn)引起的污染，肌醇六磷酸酶的應(yīng)用在增加。補(bǔ)充磷成本高以及法律要求使用肌醇六磷酸酶使得此酶在歐洲及東方某些國(guó)家的應(yīng)用比北美還普遍。荷蘭、德國(guó)、南朝鮮及臺(tái)灣政府已經(jīng)頒布或正在頒布法律以降低由于單胃家畜生產(chǎn)引起的磷污染。
增加肌醇六磷酸酶應(yīng)用的有效方法是降低成本。可通過(guò)降低生產(chǎn)成本和/或生產(chǎn)具有更優(yōu)質(zhì)活性的酶來(lái)降低肌醇六磷酸酶的成本。生物技術(shù)的新進(jìn)展可通過(guò)提供可選擇的、經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)此酶的方法以徹底改革商業(yè)酶工業(yè)。重組DNA技術(shù)的應(yīng)用使生產(chǎn)者提高生產(chǎn)酶的產(chǎn)量和效率并開發(fā)出新產(chǎn)品。原初微生物的要求不再限制商業(yè)化酶的生產(chǎn)。編碼優(yōu)質(zhì)酶的基因可從不適于商業(yè)生產(chǎn)的典型微生物如厭氧細(xì)菌和真菌中轉(zhuǎn)移到典型的工業(yè)微生物宿主中(如曲霉和芽孢桿菌類)。同樣，這些基因可被轉(zhuǎn)移到新型植物和動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中。
不同于向單胃動(dòng)物，反芻動(dòng)物(如牛，羊)很容易利用植酸中的磷。已經(jīng)證明，肌醇六磷酸酶存在于瘤胃，人們推斷以谷物為食(富含肌醇六磷酸)的反芻動(dòng)物由于反芻肌醇六磷酸酶的存在不需要在其飼料中補(bǔ)充磷。一例報(bào)道將此肌醇六磷酸酶的產(chǎn)生歸功于反芻微生物(Raun等，1956)，但總的來(lái)說(shuō)，反芻動(dòng)物利用肌醇六磷酸的獨(dú)特能力基本上被忽視了。Ruan等(1956)通過(guò)離心沉淀(Cheng等，1955)制備微生物懸液。這些微生物懸液肯定污染有植物材料的微顆粒。由于植物產(chǎn)生肌醇六磷酸酶，此研究不能確定是植物肌醇六磷酸酶還是微生物肌醇六磷酸酶產(chǎn)生了觀察到的活性。盡管Raun等人提出反芻肌醇六磷酸酶的產(chǎn)生可能是反芻微生物，沒(méi)有人進(jìn)一步探索這種可能性。
縱觀前述，需要一種具有適于用作動(dòng)物飼料補(bǔ)充劑的生化特征的低成本的肌醇六磷酸酶。
發(fā)明概述本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)瘤胃是產(chǎn)生肌醇六磷酸酶微生物的豐富源泉，此肌醇六磷酸酶具有適于動(dòng)物飼料和肌醇生產(chǎn)等工業(yè)應(yīng)用的生物化學(xué)特征(如溫度和pH穩(wěn)定性，低金屬離子敏感性及高特異性活性)。反芻微生物能忍受厭氧條件因此既可是兼性厭氧微生物也可是專性厭氧微生物。反芻微生物可以是原核生物(即細(xì)菌)或真核生物(即真菌，原生動(dòng)物)。在此所用的術(shù)語(yǔ)“反芻微生物”包括從一種反芻動(dòng)物的消化物或糞便中分離出的微生物。
已被確定的能夠提供特定活性的肌醇六磷酸酶的反芻細(xì)菌包括反芻月形單胞菌(Selenomonas ruminantium)，普雷沃氏菌(Prevotellasp.)，布氏密螺旋體(Treponema bryantii)和埃氏巨球形菌(Megaphaera elsdenii)。普雷沃氏菌屬和月形單胞菌屬是Bacteriodaceae科的革蘭氏陰性厭氧桿菌。
根據(jù)本發(fā)明，提供源于反芻微生物的編碼新型有用的肌醇六磷酸酶的DNA序列。
源自反芻月形單胞菌株JY35的肌醇六磷酸酶基因(phyA)已被克隆和測(cè)序，提供了phyA的核苷酸序列。本發(fā)明延伸至編碼肌醇六磷酸酶及能夠在嚴(yán)格條件下與phyA基因序列雜交的DNA序列。在此所謂的“能夠在嚴(yán)格條件下雜交”指與一個(gè)有關(guān)核苷酸序列或其互補(bǔ)鏈在標(biāo)準(zhǔn)條件下退火，標(biāo)準(zhǔn)條件即指高溫和/或低鹽，此條件對(duì)于無(wú)關(guān)序列的退火不利。此處所謂“低嚴(yán)格條件”指40-50℃,6×SSC及0.1％SDS的雜交和洗滌條件(顯示約50-80％同源性)。此處所謂“中等嚴(yán)格條件”指50-65℃,1×SSC及0.1％SDS的雜交和洗滌條件(顯示約80-95％同源性)。此處所謂“高嚴(yán)格條件”指65-68℃,0.1×SSC及0.1％SDS的雜交和洗滌條件(顯示約95-100％同源性)。
此處所謂的“肌醇六磷酸酶”指能夠催化從肌醇磷酸鹽中移去掉無(wú)機(jī)磷的酶。
此處所謂的“肌醇磷酸鹽”包括但不局限于，肌醇六磷酸鹽，肌醇戊磷酸鹽，肌醇四磷酸鹽，肌醇三磷酸鹽，肌醇二磷酸鹽和肌醇磷酸鹽。
此處所謂的“肌醇六磷酸鹽”指肌醇六磷酸的鹽。
本發(fā)明延伸至反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)，以及鑒定和分離此菌及其他具有肌醇六磷酸酶活性的反芻微生物的方法，以及以全部或部分phyA基因序列為探針，從具有肌醇六磷酸酶活性的反芻微生物中分離、克隆，表達(dá)肌醇六磷酸酶基因的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步包括測(cè)定由一種微生物產(chǎn)生的肌醇六磷酸酶活性的方法，此方法消除了由于微生物產(chǎn)酸導(dǎo)致的假陽(yáng)性。微生物克隆在包含有肌醇六磷酸鹽的生長(zhǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。此培養(yǎng)基與氯化鈷的水溶液接觸，然后在培養(yǎng)基上檢查透明區(qū)。優(yōu)選地，不是直接檢查培養(yǎng)基，首先移掉氯化鈷，培養(yǎng)基與鉬酸銨及礬酸銨接觸后檢測(cè)透明區(qū)。產(chǎn)酸微生物產(chǎn)生透明區(qū)導(dǎo)致的假陽(yáng)性可被避免。
本發(fā)明延伸至表達(dá)構(gòu)建體，此構(gòu)建體包含由本發(fā)明的編碼肌醇六磷酸酶的DNA，此DNA與一段可在合適的宿主細(xì)胞內(nèi)指導(dǎo)此肌醇六磷酸酶表達(dá)的調(diào)控序列可操作地連在一起。
本發(fā)明進(jìn)一步延伸至宿主細(xì)胞，它已轉(zhuǎn)化并表達(dá)本發(fā)明的編碼肌醇六磷酸酶的DNA序列，及生產(chǎn)這樣的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法。此處所謂的“宿主細(xì)胞”包括動(dòng)物、植物、酵母、真菌、原生動(dòng)物及原核宿主細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步延伸至轉(zhuǎn)基因植物，此植物已轉(zhuǎn)化了本發(fā)明的編碼一種肌醇六磷酸酶的DNA以致轉(zhuǎn)化的植物能夠表達(dá)此肌醇六磷酸酶以及生產(chǎn)這樣的轉(zhuǎn)化植物的方法。此處所謂的“轉(zhuǎn)基因植物”包括轉(zhuǎn)基因植物、組織和細(xì)胞。
本發(fā)明的肌醇六磷酸酶可用于廣泛的涉及肌醇六磷酸鹽脫磷酸作用的應(yīng)用。這樣的應(yīng)用包括應(yīng)用于動(dòng)物飼料添加劑，飼料調(diào)節(jié)，人類營(yíng)養(yǎng)以及從肌醇六磷酸中生產(chǎn)肌醇。本發(fā)明的肌醇六磷酸酶也可用于將肌醇六磷酸鹽的螯合金屬的副作用降至最低。富含肌醇六磷酸鹽的某些飼料如豆粉會(huì)降低其對(duì)于魚、單胃動(dòng)物、幼小反芻動(dòng)物及嬰兒做為蛋白源的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，因?yàn)榧〈剂姿猁}可螯合礦物質(zhì)，與氨基酸和蛋白質(zhì)結(jié)合降低營(yíng)養(yǎng)成分的生物可用性。用本發(fā)明的肌醇六磷酸酶處理飼料可通過(guò)此酶介導(dǎo)的去磷酸化作用降低飼料中肌醇六磷酸鹽的含量，使得飼料更適于用作蛋白源。相應(yīng)地，本發(fā)明延伸至一種新型飼料組合物，它包含有本發(fā)明的肌醇六磷酸酶處理的飼料以及包含有本發(fā)明一種肌醇六磷酸酶的飼料添加劑。這樣的飼料組合物及添加劑也可包含其他酶如蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶和酸性磷酸酶。此肌醇六磷酸酶也可直接添加于未被處理的、做成球狀的或用其他方式加工的飼料中，或它可與飼料分開提供，如以礦物塊，片劑，凝膠形式，液體形式或?qū)⒅砑佑陲嬘盟?。本發(fā)明延伸至飼料接種制劑，它包含有在正常生長(zhǎng)條件下可表達(dá)本發(fā)明肌醇六磷酸酶冷凍干燥的微生物。至于飼料接種制劑，“正常生長(zhǎng)條件”指收獲及冷凍干燥微生物前的培養(yǎng)條件。在大規(guī)模發(fā)酵罐中，在微生物培養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程中這些微生物表達(dá)肌醇六磷酸酶。微生物中肌醇六磷酸酶活性可通過(guò)將包含有此肌醇六磷酸酶的收獲的微生物濃縮物冷凍干燥得以保存。
本發(fā)明進(jìn)一步延伸至提高動(dòng)物飼料磷酸鹽利用率的方法，它是通過(guò)飼喂動(dòng)物有效量的本發(fā)明中肌醇六磷酸酶實(shí)現(xiàn)的。此處所謂肌醇六磷酸酶的有效量指的是可引起統(tǒng)計(jì)學(xué)上動(dòng)物利用磷有明顯改善的量。肌醇六磷酸酶的利用可以動(dòng)物生長(zhǎng)狀況的改善和動(dòng)物糞便中肌醇六磷酸鹽的降低水平為證據(jù)。
附圖簡(jiǎn)述


圖1示復(fù)染含有肌醇六磷酸鹽的瓊脂培養(yǎng)基對(duì)由產(chǎn)酸或肌醇六磷酸酶活性產(chǎn)生的透明區(qū)的效應(yīng)。以牛鏈球菌(S.bovis)(左側(cè)平皿上部)和反芻月形單胞菌JY35(左側(cè)平面下部)接種肌醇六磷酸鹽瓊脂并于37℃孵育5天。克隆被刮掉后，培養(yǎng)基以氯化鈷和鉬酸銨/礬酸銨溶液進(jìn)行復(fù)染(右側(cè)平皿)。
圖2圖示反芻月形單胞菌JY35在改良的Scott和Dehority(1965)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)(蛋白)和肌醇六磷酸酶的產(chǎn)生。
圖3A,3B和C展示了反芻月形單胞菌JY35中對(duì)數(shù)中期培養(yǎng)物細(xì)胞的透射電鏡照片，培養(yǎng)此菌是為了觀察以肌醇六磷酸鈉為底物時(shí)肌醇六磷酸酶作用產(chǎn)物的積累。未被處理的對(duì)照細(xì)胞列于圖3D,3E和3F以作比較。
圖4為洗滌后的反芻月形單胞菌JY35細(xì)胞在5種不同緩沖液中的pH曲線圖。
圖5為反芻月形單胞菌JY35 MgCl2細(xì)胞提取物在5種不同緩沖液中的pH曲線圖。
圖6為反芻月形單胞菌JY35 MgCl2細(xì)胞提取物的溫度曲線圖。
圖7示離子(10mM)對(duì)反芻月形單胞菌JY35肌醇六磷酸酶活性的影響(Ctr=對(duì)照)。
圖8示肌醇六磷酸鈉濃度對(duì)反芻月形單胞菌JY35肌醇六磷酸酶活性的影響。
圖9為證實(shí)肌醇六磷酸酶活性的酶譜。反芻月形單胞菌JY35 MgCl2提取物(B-E泳道)的濃縮液(10×)，低分子量標(biāo)準(zhǔn)(F泳道，BioRad Laboratories Canada Ltd,Mississauga,Ontario)和無(wú)花果曲霉肌醇六磷酸酶(Sigma,1.6U,A泳道)在10％聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE分析。泳道A-E染色以確定肌醇六磷酸酶活性同時(shí)F泳道以考馬斯亮藍(lán)染色。
圖10為測(cè)定轉(zhuǎn)化了pSrP.2(上部)，pSrP.2ΔSph1(下部左側(cè))及pSrPf6(下部右側(cè))的大腸桿菌DH5α的肌醇六磷酸酶活性的肌醇六磷酸鹽水解板。平板在37℃孵育48小時(shí)后可見透明區(qū)。
圖11為Southem印跡分析Sph1消化的pSrp.2 DNA(B泳道)及HindⅢ消化的反芻月形單胞菌JY35基因組DNA(C泳道)，探針為源自pSrP.2的2.7kb片段。A泳道為地高辛標(biāo)記的HindⅢ/入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖12為pSrP.2的物理圖譜。源自由Sau3A部分消化反芻月形單胞菌JY35基因組DNA得到的2.7kb片段克隆到pUC18的BamHⅠ位點(diǎn)。此片段包括編碼反芻月形單胞菌JY35肌醇六磷酸酶的全基因。由于連接導(dǎo)致的BamHⅠ位點(diǎn)的丟失以方括號(hào)標(biāo)出。
圖13為反芻月形單胞菌肌醇六磷酸酶基因缺失分析簡(jiǎn)圖。phyA的位置以水平箭頭標(biāo)出。影線盒代表由不同質(zhì)粒衍生物攜帶的2.7kb的Sau3A片段。肌醇六磷酸酶活性在右側(cè)的一列中標(biāo)出。
圖14為肌醇六磷酸酶活性的酶譜。大腸桿菌DH5α(pSrP.2)細(xì)胞(A泳道)，大腸桿菌DH5α(pSrP.2ΔSph1)細(xì)胞(B泳道)，及低分子量標(biāo)準(zhǔn)(C泳道，BioRad Laboratories)在10％聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE分析。A和B泳道染色以測(cè)肌醇六磷酸酶活性同時(shí)C泳道以考馬斯亮藍(lán)染色。
圖15為反芻月形單胞菌JY35肌醇六磷酸酶基因(phyA)(SEQ IDNO.1)的核苷酸序列及推測(cè)的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)。核苷酸1相當(dāng)于pSrP.2中2.7kb片段的第1232個(gè)核苷酸。推斷的核糖體結(jié)合序列被下劃線并且在序列上方標(biāo)有R.B.S.。信號(hào)肽酶切割位點(diǎn)以↑標(biāo)出。它是通過(guò)von Heijne(1986)的方法推測(cè)出的。由大腸桿菌(pSrPf6)分泌的肌醇六磷酸酶的N末端氨基酸序列被下劃線。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述瘤胃是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，其中生存著300多種細(xì)菌、真菌和原生動(dòng)物。篩選這些生物的肌醇六磷酸酶活性需要區(qū)別單個(gè)分離物的肌醇六磷酸酶活性的能力。這可通過(guò)估價(jià)源自貯存收集物的純培養(yǎng)物或分離并培養(yǎng)通過(guò)培養(yǎng)技術(shù)得到的單個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)技術(shù)例如劃線平板，稀釋和顯微操作。針對(duì)細(xì)菌、真菌和原生動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)的無(wú)菌、厭氧技術(shù)也可用以達(dá)到這個(gè)目的。
對(duì)于從反芻流體樣品和從培養(yǎng)收集物中篩選微生物分離物及克隆肌醇六磷酸酶基因而言，合適的酶測(cè)定是必需的。文獻(xiàn)中已有有關(guān)測(cè)量溶液中肌醇六磷酸酶活性的測(cè)定方法。典型的測(cè)定樣品溶液中肌醇六磷酸酶活性的方法是通過(guò)測(cè)量由肌醇六磷酸中釋放的無(wú)機(jī)磷Pi(Raun等，1956；van Hartingsveldt等，1993)。肌醇六磷酸酶活性也可在固體培養(yǎng)基上測(cè)定。表達(dá)肌醇六磷酸酶的微生物在包含有肌醇六磷酸鈉或肌醇六磷酸鈣的瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明區(qū)(Shieh和Ware,1968；Howson和Davis,1983)。然而文獻(xiàn)中描述的固體培養(yǎng)基測(cè)定法在用以測(cè)定肌醇六磷酸酶活性以篩選反芻細(xì)菌時(shí)不適用，因?yàn)橄笈ｆ溓蚓@樣的產(chǎn)酸細(xì)菌會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性產(chǎn)生。為了解決這個(gè)問(wèn)題，發(fā)展了一種兩步復(fù)染方法，其中含有固體培養(yǎng)基的平皿先覆以氯化鈷溶液然后以鉬酸銨/礬酸銨溶液覆蓋培養(yǎng)基。處理后，只有由酶活性產(chǎn)生的透明區(qū)明顯(
圖1)。
用上述溶液和固體培養(yǎng)基測(cè)定345份來(lái)自Lethbridge研究中心(Lethbridge,Alberta,Canada)的培養(yǎng)收集物，通過(guò)測(cè)定肌醇六磷酸酶活性篩選之(表1)?？偣茶b定出29份有較大肌醇六磷酸酶活性的分離物，其中包括24份月形單胞菌屬的和5份普雷沃氏菌屬的培養(yǎng)物。12份培養(yǎng)物(11份為月形單胞菌分離物，1份為普雷沃氏菌分離物)具有比其他陽(yáng)性培養(yǎng)物明顯高的肌醇六磷酸酶活性(表2)。
反芻月形單胞菌JY35(于1996.5.24保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852-1776，保藏號(hào)ATCC 55785)被選作進(jìn)一步檢測(cè)并與源自無(wú)花果曲霉NRRL 3135(vanGorcum等，1991和1995)的商品化的肌醇六磷酸酶比較(Gist-brocades nv,Delft,The Netherlands)。反芻月形單胞菌JY35(ATCC55785)的肌醇六磷酸酶組成型表達(dá)，從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái)并與細(xì)胞表面相關(guān)聯(lián)。反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)肌醇六磷酸酶的pH值(圖5)和溫度(圖6)曲線圖表明它比源自商業(yè)化的無(wú)花果曲霉NRRL 3135肌醇六磷酸酶更適應(yīng)商業(yè)生產(chǎn)。以上結(jié)果表明反芻和厭氧微生物做為肌醇六磷酸酶源產(chǎn)生的酶比當(dāng)前工業(yè)生產(chǎn)出的肌醇六磷酸酶更優(yōu)質(zhì)。
編碼所選酶的微生物基因可以多種方法克隆。用標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等，1989；Ausubel等，1990)構(gòu)建的基因文庫(kù)(基因組DNA和/或cDNA)用以篩選目的基因。篩選的一套方法可利用異源探針，酶活或基因純化過(guò)程中產(chǎn)生的結(jié)果，如N-末端和中間氨基酸序列數(shù)據(jù)及抗體。
利用發(fā)展的檢測(cè)由反芻微生物產(chǎn)生的肌醇六磷酸酶活性的固體培養(yǎng)基肌醇六磷酸酶測(cè)定方法，反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)的一個(gè)基因文庫(kù)被用作篩選陽(yáng)性克隆。6000個(gè)克隆被檢測(cè)，通過(guò)克隆周圍形成的巨大透明區(qū)確定了一個(gè)菌落為肌醇六磷酸酶陽(yáng)性克隆。此克隆攜帶有5.5kb的質(zhì)粒，此質(zhì)粒包含有插入pUC18的一個(gè)2.7kb的Sau3A DNA片段。此新分離到的2.7kb Sau3A DNA片段用作Southern印跡雜交的探針。在高嚴(yán)格條件下，可在反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)中檢測(cè)到一條分離的條帶，而在普雷沃氏菌46/52，大腸桿菌和無(wú)花果曲霉NRRL 3135中卻檢測(cè)不到這一條帶。
從新近分離到克隆中分離質(zhì)粒并通過(guò)轉(zhuǎn)化將之轉(zhuǎn)到大腸桿菌中產(chǎn)生出了氨芐抗性的、肌醇六磷酸酶陽(yáng)性的CFU。攜帶有反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)的2.7kb Sau3A DNA片段的大腸桿菌細(xì)胞提取物的酶譜分析表明一條分子量約為37kDa的單一活性條帶。刪除和DNA序列分析用以確定編碼重組大腸桿菌克隆中具有肌醇六磷酸酶活性的基因(phyA)。具phyA基因的大腸桿菌表達(dá)的純化的37kDa肌醇六磷酸酶的N-末端氨基酸序列與從克隆的phyA序列預(yù)測(cè)的成熟肌醇六磷酸酶的N-末端氨基酸序列一致。這可以確定編碼肌醇六磷酸酶的核苷酸序列已被分離。核苷酸序列及推斷的氨基酸序列列于
圖15。
同其他基因一樣，用肌醇六磷酸酶的編碼區(qū)在多種表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行商品酶生產(chǎn)是可能的。重組DNA技術(shù)使酶制造商增加酶生產(chǎn)的體積和效率并可制造出新產(chǎn)品。對(duì)最初微生物源的需求不再限制商品酶的生產(chǎn)。編碼優(yōu)質(zhì)酶基因可從不適于商業(yè)生產(chǎn)的微生物如厭氧細(xì)菌和真菌轉(zhuǎn)至典型的工業(yè)微生物生產(chǎn)宿主中(如曲霉屬、畢赤酵母屬、木霉屬、芽孢桿菌屬)。同樣的，這些基因可被導(dǎo)入新型植物和動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中。
工業(yè)微生物株((如黑曲霉，無(wú)花果曲霉，泡盛曲霉(Aspergillusawamori)，米曲霉(Aspergillus oryzae),Trichoderma reesei，米赫毛霉(Mucor miehei)，乳克魯維氏酵母(Kluyveromyces lactis)，巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)，啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)，大腸桿菌，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis))或植物宿主(如canola，大豆，玉米，土豆)可用以生產(chǎn)肌醇六磷酸酶。所有的系統(tǒng)利用相似的方法進(jìn)行基因表達(dá)。表達(dá)構(gòu)建體組裝包括目的蛋白編碼序列和控制序列如啟動(dòng)子，增強(qiáng)子和終止子。也可包括其他序列如信號(hào)序列和選擇標(biāo)記。為了使肌醇六磷酸酶表達(dá)于胞外，本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體利用一個(gè)分泌信號(hào)序列。如果胞漿表達(dá)可取，則信號(hào)序列不包含在表達(dá)構(gòu)建體上。啟動(dòng)子和信號(hào)序列在宿主細(xì)胞內(nèi)有功能且是為了編碼序列產(chǎn)物表達(dá)和分泌提供的。轉(zhuǎn)錄終止子保證有效轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)表達(dá)和蛋白純化的輔助序列也可包含于表達(dá)構(gòu)建體中。
具肌醇六磷酸酶活性的蛋白質(zhì)編碼序列是從反芻微生物中得到的。此DNA對(duì)于表達(dá)宿主來(lái)說(shuō)既可是同源的也可以是異源的。同源DNA在此指源自相同種的DNA。如，源自反芻月形單胞菌的DNA可以轉(zhuǎn)化反芻月形單胞菌以提高原有特征而不引入原來(lái)此種不存在的特性。異源DNA指源自不同種的DNA。如，反芻月形單胞菌的phyA可被克隆至大腸桿菌并在其中表達(dá)。
在生物領(lǐng)域中眾所周知，某此蛋白的氨基酸替換不會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能。通常，保守氨基酸替換不影響蛋白功能。相似氨基酸指大小或電荷相似的氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸及異亮氨酸和纈氨酸為相似氨基酸對(duì)。本領(lǐng)域的多種方法可估價(jià)氨基酸對(duì)間的相似性。例如在參考文獻(xiàn)《蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖集》，第5卷增補(bǔ)3，第22章345-352頁(yè)中，Dayhoff等(1978)提供了用于估價(jià)氨基酸相似性的氨基酸替換頻率表。Dayoff等的頻率表是以比較進(jìn)化上不同，而功能相同蛋白的氨基酸序列為基礎(chǔ)的。
眾所周知，小于全長(zhǎng)的蛋白具有全蛋白的功能，如，缺少N-末端、中間或C-末端的截短的蛋白通常具有完整天然蛋白的生物和/或酶學(xué)活性。涉及phyA基因截短實(shí)驗(yàn)已證實(shí)截短蛋白具有全蛋白的功能。缺少N-末端氨基酸1-37或1058(SEQ ID NO.2)的表達(dá)PhyA的大腸桿菌克隆表現(xiàn)出肌醇六磷酸酶陽(yáng)性表型。相反，表達(dá)缺失307-346氨基(SEQ ID NO.2)PhyA的克隆檢測(cè)不到肌醇六磷酸酶活性。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員懂得如何制得截短蛋白或具有內(nèi)部缺失的蛋白。利用下面描述的測(cè)定方法和本領(lǐng)域眾所周知的知識(shí)，本發(fā)明中的截短的肌醇六磷酸酶蛋白或內(nèi)部缺失的肌醇六磷酸酶很容易被檢測(cè)。
基本上保持與此處特別描述的肌醇六磷酸酶相同酶活性的替換、內(nèi)部缺失或截短的反芻肌醇六磷酸酶衍生物都被看做是例證中肌醇六磷酸酶的等價(jià)物并在本發(fā)明范圍之內(nèi)，特別是替換的、內(nèi)部缺失的或截短的肌醇六磷酸酶衍生物具有特定例證中肌醇六磷酸酶的10％以上活性。利用此處講述的測(cè)定方法和本領(lǐng)域內(nèi)熟知的知識(shí)，熟練技術(shù)人員很容易測(cè)定一個(gè)反芻肌醇六磷酸酶、截短的、內(nèi)部缺失的或替換肌醇六磷酸酶的活性。
本發(fā)明包括源自反芻微生物肌醇六磷酸酶的結(jié)構(gòu)變異的肌醇六磷酸酶，特別是源自于此文特別描述的肌醇六磷酸酶，其功能與借助本領(lǐng)域已知知識(shí)利用此處描述的方法測(cè)定的肌醇六磷酸酶基本一致。本發(fā)明中肌醇六磷酸酶的結(jié)構(gòu)變異體，功能相似物包括反芻微生物的肌醇六磷酸酶，它們具有如同此處描述的肌醇六磷酸酶氨基酸序列(SEQ ID NO.2)的連續(xù)的氨基酸序列，特別是那些具有反芻微生物肌醇六磷酸酶至少連續(xù)25個(gè)氨基酸序列的肌醇六磷酸酶變異體。
本發(fā)明也提供了用于構(gòu)建與此處分離到酶具有不同特性的肌醇六磷酸酶的起始材料。這些基因可用已知方法很容易突變(如，化學(xué)突變、定點(diǎn)突變、隨機(jī)聚合酶鏈反應(yīng)突變)以產(chǎn)生具有改變了特性的基因產(chǎn)物(如，最適溫度或最適pH，比活性或底物特異性)。
根據(jù)本發(fā)明，可使用多種啟動(dòng)子(轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)區(qū))。合適啟動(dòng)子的選擇依賴于假定的表達(dá)宿主?？晒┻x擇的啟動(dòng)子可包括與克隆蛋白編碼序列相關(guān)的啟動(dòng)子，或在選擇宿主中有功能的異源啟動(dòng)子。異源啟動(dòng)子的例子包括大腸桿菌tac和tn啟動(dòng)子(Brosius等，1985)，枯草桿菌sacB啟動(dòng)子和信號(hào)序列(Wong,1989)，源自巴斯德畢赤酵母(Ellis等，1985)的aox1和aox2啟動(dòng)子，及源自歐洲油菜(Brassicanapus)或擬南芥菜(Arabidopsis thaliana)的油質(zhì)蛋白種子特異的啟動(dòng)子(van Rooijen和Moloney,1994)。啟動(dòng)子的選擇也依賴于需要的多肽或蛋白生產(chǎn)效率和生產(chǎn)水平。象tac和aox1這樣的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子經(jīng)常被用以大幅度提高蛋白表達(dá)水平。蛋白的過(guò)表達(dá)對(duì)宿主細(xì)胞有害。結(jié)果，宿主細(xì)胞生長(zhǎng)受到限制。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的應(yīng)用使得誘導(dǎo)基因表達(dá)前宿主細(xì)胞能夠培養(yǎng)至可接受的密度，以此促進(jìn)較高產(chǎn)品產(chǎn)量。如果蛋白編碼序列通過(guò)基因替換(omega插入)整合至一個(gè)目的座位，啟動(dòng)子的選擇受到與目的座位啟動(dòng)子同源程度的影響。
根據(jù)本發(fā)明，多種信號(hào)序列也可使用。與要表達(dá)的蛋白編碼序列同源的信號(hào)序列可被使用。另外，選擇或設(shè)計(jì)用于提高表達(dá)宿主分泌的信號(hào)序列也可應(yīng)用。例如，枯草芽孢桿菌sacB信號(hào)序列用以枯草芽孢桿菌分泌，啤酒糖酵母α-交配因子或巴斯德畢赤酵母用以巴斯德畢赤酵母分泌的酸性磷酸酶phol信號(hào)序列可被應(yīng)用。如果蛋白編碼序列要通過(guò)omega插入整合，與目的座位高度同源的信號(hào)序列是必需的。信號(hào)序列可通過(guò)編碼信號(hào)肽酶切割位點(diǎn)的序列直接加入，或由十個(gè)以下密碼子組成的短核苷酸橋連入。
已確定了對(duì)真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)適用的增強(qiáng)表達(dá)轉(zhuǎn)錄(啟動(dòng)子活性)和翻譯的元件。例如，將花椰菜花葉病毒(CaMV)啟動(dòng)子置于異源啟動(dòng)子的任意一側(cè)可提高轉(zhuǎn)錄水平10-400倍。表達(dá)構(gòu)建體也應(yīng)該包括合適的翻譯起始序列。通過(guò)將Kozak共有序列作為合適的翻譯起始點(diǎn)包括在改良的表達(dá)構(gòu)建體中可將翻譯水平提高10倍。
提高蛋白純化的元件也可包含于表達(dá)構(gòu)建體中。油質(zhì)蛋白基因融合體產(chǎn)物是包含有與油質(zhì)蛋白基因相連的目的基因的雜合蛋白。此融合蛋白保留有油質(zhì)蛋白的親脂性從而摻入到油體膜中(van Rooijen和Moloney,1994)。與油體相連這一性質(zhì)易于重組油質(zhì)蛋白融合蛋白的純化(van Rooijen和Woloney,1994)。
選擇標(biāo)記通常被應(yīng)用，它可是表達(dá)構(gòu)建體的一部分或與它分開(如，被表達(dá)載體攜帶)，因此這個(gè)標(biāo)記可在與目的基因不同的位點(diǎn)整合。本發(fā)明重組DNA分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可通過(guò)使用選擇標(biāo)記進(jìn)行監(jiān)控。這些標(biāo)記的例子包括對(duì)抗生素的抗性(如bla使大腸桿菌宿主細(xì)胞對(duì)氨芐青霉素有抗性，nptll使歐洲油菜細(xì)胞對(duì)卡那霉素有抗性)或使宿主能在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(如，HIS4使馬斯德畢赤酵母GS115 His-在缺少組氨酸時(shí)生長(zhǎng))。選擇標(biāo)記應(yīng)有自己的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始點(diǎn)及終止調(diào)節(jié)區(qū)域以使標(biāo)記自主表達(dá)。當(dāng)抗生素用作選擇標(biāo)記時(shí)，用以選擇的抗生素濃度依抗生素種類不同而異，通常為10-600μg抗生素/ml培養(yǎng)基。
利用已知的重組DNA技術(shù)裝配表達(dá)構(gòu)建體。限制性酶消化和連接是將兩個(gè)DNA片段連在一起的基本步驟。DNA末端在連接需要修飾，這可通過(guò)補(bǔ)平突出端或用核酸酶(如，ExoⅢ)刪除片段的末端部分，定點(diǎn)突變和用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)增加新堿基對(duì)來(lái)完成。可用多接頭和銜接子加速所選片段的加入。典型表達(dá)載體的組裝需要多輪限制性酶切、連接及轉(zhuǎn)化大腸桿菌。有多種克隆載體用以構(gòu)建表達(dá)構(gòu)建物而特定的選擇對(duì)本發(fā)明則無(wú)關(guān)緊要。用于將表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)影響克隆載體的選擇。在每一輪結(jié)束時(shí)，構(gòu)建體可通過(guò)限制性酶切、DNA序列測(cè)定、雜交和PCR分析進(jìn)行鑒定。
表達(dá)構(gòu)建體可以線性或環(huán)形的克隆載體構(gòu)建體或從克隆載體中卸下來(lái)并用作或在運(yùn)送載體上導(dǎo)入宿主細(xì)胞運(yùn)送載體易于表達(dá)構(gòu)建體在所選宿主細(xì)胞類型的導(dǎo)入和維持。通過(guò)很多基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中的任何一種可將表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞(如天然感受態(tài)，化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，電穿孔，biolistic轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)染，接合作用)?；蜣D(zhuǎn)移系統(tǒng)依宿主細(xì)胞和所用的載體系統(tǒng)而定。
例如，可用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化或電穿孔法將表達(dá)構(gòu)建體引入巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。巴斯德畢赤酵母的電穿孔很容易完成并且轉(zhuǎn)化效率可與原生質(zhì)球法相比。用滅菌水洗滌巴斯德畢赤酵母并以低電導(dǎo)率溶液(如1M山梨聚糖溶液)。細(xì)胞懸液接受高壓休克后會(huì)在細(xì)胞膜上產(chǎn)生瞬時(shí)孔，通過(guò)這些孔，轉(zhuǎn)化的DNA(如，表達(dá)構(gòu)建體)進(jìn)入細(xì)胞。表達(dá)構(gòu)建體通過(guò)同源重組整合到aox1(酒精氧化酶)座位而穩(wěn)定維持在宿主中。
另外地，包含有與蛋白編碼序列可控連接sacB啟動(dòng)子及信號(hào)序列的表達(dá)構(gòu)建體攜帶于pUB110,pUB110為可在枯草桿菌中自主復(fù)制的質(zhì)粒。得到的質(zhì)粒通過(guò)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入枯草桿菌細(xì)胞?？莶輻U菌在低營(yíng)養(yǎng)條件下自發(fā)產(chǎn)生天然感受態(tài)。
第三個(gè)例子，歐洲油菜細(xì)胞通過(guò)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法被轉(zhuǎn)化。此表達(dá)構(gòu)建體被插入到一個(gè)二元載體，它既可在根癌土壤桿菌中復(fù)制又可轉(zhuǎn)移入植物細(xì)胞。產(chǎn)生的重組體被轉(zhuǎn)化入具有減弱的Ti或“輔助質(zhì)?！钡母┩寥罈U菌細(xì)胞中。當(dāng)葉片感染了重組根癌土壤桿菌細(xì)胞時(shí)，通過(guò)雙重質(zhì)粒與表達(dá)構(gòu)建體的接合轉(zhuǎn)移作用，表達(dá)重組體被轉(zhuǎn)移至歐洲油菜葉細(xì)胞中。表達(dá)構(gòu)建體隨機(jī)整合到植物細(xì)胞基因組中。
通過(guò)使用由表達(dá)載體或載體攜帶的選擇標(biāo)記及用包括雜交、PCR和抗體在內(nèi)的多種技術(shù)證實(shí)目的基因的存在，鑒定攜定攜帶表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞(即轉(zhuǎn)化的細(xì)胞)。
轉(zhuǎn)化的微生物細(xì)胞可通過(guò)多種技術(shù)培養(yǎng)，包括在液體或半固體培養(yǎng)基上分批或連續(xù)發(fā)酵。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在最大生產(chǎn)-成本比率的優(yōu)化條件下增殖。通過(guò)控制培養(yǎng)參數(shù)如溫度，pH，通氣及培養(yǎng)基組成，產(chǎn)量會(huì)有大幅度的提高。精心控制和調(diào)節(jié)重組過(guò)表達(dá)大腸桿菌細(xì)胞的生長(zhǎng)條件會(huì)產(chǎn)生培養(yǎng)物生物量和蛋白產(chǎn)量分別為150g細(xì)胞/L培養(yǎng)物(濕重)和5g不溶蛋白/L。低濃度的蛋白酶抑制劑(如苯甲基磺酰氟或抑胃酶肽)可用以減少過(guò)表達(dá)多肽或蛋白的蛋白酶水解作用。另外，可用蛋白酶缺失的宿主細(xì)胞以減少或消除目的蛋白的降解。
選擇和篩選后，轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可被重新導(dǎo)入整個(gè)植物體，用已知方法已培育并養(yǎng)殖了多株轉(zhuǎn)基因植物品系。此處所謂的“轉(zhuǎn)基因植物”包括轉(zhuǎn)基因植物，植物組織和植物細(xì)胞。
發(fā)酵后，微生物細(xì)胞可通過(guò)離心和過(guò)濾一類的下游程序從培養(yǎng)基中分離出來(lái)。如果目的產(chǎn)品被分泌，它可從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中提取出來(lái)。如果產(chǎn)品在細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞先被收獲然后通過(guò)使用機(jī)械力、超聲、酶學(xué)、化學(xué)和/或高壓破裂細(xì)胞使產(chǎn)品釋放出來(lái)。如在高表達(dá)細(xì)胞系統(tǒng)中不溶性產(chǎn)品的產(chǎn)生可用于加速產(chǎn)品純化。產(chǎn)品包含體可通過(guò)離心方法從破裂細(xì)胞中提取出來(lái)，用含有低濃度去污劑(如0.5-6M尿素，0.1-1％十二烷基磺酸鈉或0.5-4.0M鹽酸胍)緩沖液洗滌沉淀可去掉雜蛋白。洗滌后的包涵體在含有6-8M尿素，1-2％十二烷基磺酸鈉或4-6M鹽酸胍的溶液中溶解。溶解的產(chǎn)品可在透析過(guò)程中除掉變異性得以復(fù)性。
可通過(guò)研磨、勻漿、和/或化學(xué)處理方法從收獲部分或植物整體中提取肌醇六磷酸酶。通過(guò)將油質(zhì)融合蛋白分配于榨過(guò)的canola種子的油相從而與水相蛋白分開，種子特異的親脂油質(zhì)融合蛋白純化加速(vanRooijen和Moloney,1994)。
如果必需，純化產(chǎn)品的多種方法包括微生物的，發(fā)酵和植物萃取都可應(yīng)用。這些方法包括沉淀(如，硫酸銨沉淀)，層析(凝膠過(guò)濾，離子交換，親和液相層析)，超濾，電泳，溶劑-溶劑萃取(如丙酮沉淀)，及其組合，等。
全部或部分微生物培養(yǎng)物和植物可直接用于需要肌醇六磷酸酶的應(yīng)用。也需要制備多種肌醇六磷酸酶的粗制品或純化品制劑。這些酶中可加入其他蛋白(如明膠、脫脂奶粉)或化學(xué)試劑(如甘油、聚乙二醇、還原劑和乙醛)得以穩(wěn)定。酶懸液可被濃縮(如切向流過(guò)濾)或干燥(噴霧鼓干燥、冷凍干燥)并通過(guò)已知的方法制成流體，粉狀，顆粒，丸，礦物塊和凝膠狀。向明膠，藻膠，膠原，瓊脂，果膠及角叉菜聚糖一類的凝膠劑可應(yīng)用于此。
進(jìn)一步，單獨(dú)肌醇六磷酸酶不能完成肌醇六磷酸酶的脫磷酸作用。肌醇六磷酸酶不能夠使低級(jí)肌醇磷酸鹽脫磷酸。例如，在美國(guó)專利No.5,536,156(van Gorcum等，1995年，7月25日發(fā)布)中描述的無(wú)花果曲霉肌醇六磷酸酶對(duì)肌醇二磷酸或肌醇單磷酸具有低的或沒(méi)有磷酸酶活性。在本發(fā)明的含有肌醇六磷酸酶的食物添加劑中加入如酸性磷酸酶一類的另一種磷酸酶有助于肌醇二磷酸和肌醇單磷酸脫磷酸。
目的產(chǎn)品的制劑可直接用于需要肌醇六磷酸酶的應(yīng)用中。流體濃縮物、粉末和顆?？芍苯蛹尤氲椒磻?yīng)混合物、發(fā)酵物、谷物浸出液及磨碎的廢品中。配制成的肌醇六磷酸酶可各種形式使動(dòng)物服用，包括以飲用水、礦物塊、作為一種鹽、或作為粉末灑于飼料槽中或與食物混勻等多種形式。也可以已知的方法與其他飼料混勻、噴灑其他飼料或與其他飼料形成小丸。另外，具有合適啟動(dòng)子-增強(qiáng)子序列的肌醇六磷酸酶基因可整合到動(dòng)物基因組中并且只是在一種器官或組織中(如唾液腺、胰或上皮細(xì)胞)，后者將肌醇六磷酸酶基因分泌到消化道內(nèi)，由此不需要另外補(bǔ)充肌醇六磷酸酶。
在一個(gè)優(yōu)選制劑中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶是以微生物飼料接種物形式出現(xiàn)的。具有天然肌醇六磷酸酶的微生物，如反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)或表達(dá)異源肌醇六磷酸酶基因的重組微生物在發(fā)酵罐中培養(yǎng)到一個(gè)高濃度然后收獲并通過(guò)離心濃縮。食品級(jí)乳清和/或其他低溫保護(hù)劑與細(xì)胞濃縮物混勻。按標(biāo)準(zhǔn)冷凍方法，最終的混合物低溫冷凍并冷凍干燥以保持肌醇六磷酸酶活性。冷凍干燥培養(yǎng)物可進(jìn)一步加工成成品，進(jìn)一步的方法包括將培養(yǎng)物與懶性攜帶物混合以調(diào)整產(chǎn)品的活力。
本發(fā)明生產(chǎn)的全部或部分微生物培養(yǎng)物和植物可用于多種需要肌醇六磷酸酶的工業(yè)方法。這樣的應(yīng)用包括但不局限于以肌醇磷酸和肌醇為終產(chǎn)品的生產(chǎn)，飼料成分和非反芻動(dòng)物(如豬、家禽、魚、寵物食品)飼料添加劑，人類營(yíng)養(yǎng)、及涉及包含有肌醇六磷酸酶飼料的其他工業(yè)(大豆和玉米加工，淀粉及發(fā)酵)。肌醇六磷酸鹽的降解使動(dòng)物和微生物利用無(wú)機(jī)磷和螯合的金屬。肌醇六磷酸酶的作用提高了富含肌醇六磷酸鹽的飼料成分和/或發(fā)酵底物的質(zhì)量、價(jià)值及可用性。肌醇六磷酸酶的作用能夠加速涉及玉米濕磨碎物的浸出過(guò)程和分離過(guò)程。
本發(fā)明的肌醇六磷酸酶基因可用于異源雜交和多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)，指導(dǎo)從其他微生物中分離肌醇六磷酸酶編碼基因。此處的實(shí)施例是以舉例形式給出的，完全不是限制本發(fā)明的范圍。已盡努力保證所用數(shù)字的準(zhǔn)確性(如，溫度、pH、數(shù)量)但應(yīng)該認(rèn)識(shí)到某些實(shí)驗(yàn)中可能出現(xiàn)的變化和偏差。
實(shí)施例1反芻細(xì)菌的分離從插有套管的Holstein牛中收集反芻流體至一個(gè)滅菌的WhirlpakTM袋中。也可通過(guò)一根口胃(orogastric)管從瘤胃中抽取流體。在合適的厭氧氣中(如，90％CO2和10％H2)，制備10倍稀釋的瘤胃流體稀釋液并將之分散于固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基的表面(如，Scott和Dehority,1955)，平板在39℃孵育18-72小時(shí)。用滅菌環(huán)挑起分離的克隆并將之涂到新鮮的瓊脂培養(yǎng)基上以分離克隆。來(lái)自單個(gè)克隆的細(xì)胞通過(guò)形態(tài)學(xué)進(jìn)行證實(shí)以代表一個(gè)純的培養(yǎng)物并被培養(yǎng)且貯存于Lethbridge研究中心(“LRC”)培養(yǎng)收藏處或酶活性或遺傳材料的源泉。
實(shí)施例2篩選具肌醇六磷酸酶活性的反芻細(xì)菌A．肌醇六磷酸酶活性測(cè)定150μl樣品溶液(培養(yǎng)物濾液，細(xì)胞懸液，裂解液洗液或滅菌水空白)與600μl底物液
37℃孵育30分鐘以測(cè)定肌醇六磷酸酶活性。加以750μl 5％(w/v)三氯乙酸終止反應(yīng)。反應(yīng)混合物中釋放的正磷酸以Fiske和Subbarow方法(1925)進(jìn)行測(cè)定。新鮮制備的顯色劑[750μl溶液中含有4體積溶于5.5％(w/v)硫酸溶液的1.5％(w/v)鉬酸銨及1體積2.7％(w/v)硫酸亞鐵]加入反應(yīng)混合物，產(chǎn)生的鉬酸磷在700nm處以分光光度計(jì)測(cè)定。結(jié)果與由無(wú)機(jī)磷測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線相比。1個(gè)單位(“單位”)的肌醇六磷酸酶定義為在測(cè)定條件下每分鐘釋放1微摩爾無(wú)機(jī)磷(Pi)所需的酶量。
發(fā)展了一種改良的肌醇六磷酸酶平板測(cè)定法，它可以消除由于微生物產(chǎn)生酸導(dǎo)致的假陽(yáng)性。細(xì)菌分離物于無(wú)氧條件下在改良的Scott和Dehority(1965)瓊脂培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)5天，此培養(yǎng)基含有5％(v/v)瘤胃流體，1.8％(w/v)瓊脂和2.0％(w/v)肌醇六磷酸鈉?？寺沫傊砻姹幌吹?，平皿以2％(w/v)氯化鈷水溶液覆蓋。室溫下孵育5分鐘后，氯化鈷溶液被新鮮制備的溶液替代，此溶液包含有等體積的6.25％(w/v)鉬酸銨水溶液和0.42％(w/v)礬酸銨溶液。孵育5分鐘后，鉬酸銨溶液/礬酸銨溶液被移掉，在平板上檢測(cè)透明區(qū)。這種復(fù)染技術(shù)的效果示于
圖1。染色前含有肌醇六磷酸鹽的瓊脂培養(yǎng)基上，在產(chǎn)生肌醇六磷酸酶的反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)和產(chǎn)生乳酸的牛鏈球菌菌落周圍有明顯的透明區(qū)(
圖1，左側(cè)平板)。由牛鏈球菌產(chǎn)酸形成的假陽(yáng)性透明區(qū)通過(guò)以氯化鈷和鉬酸銨/礬酸銨溶液復(fù)染得以消除(
圖1，右側(cè)平板)。B．反芻細(xì)菌的肌醇六磷酸酶活性測(cè)定了源于LRC培養(yǎng)物收藏處的345株反芻細(xì)菌的肌醇六磷酸酶活性(表1)。由Bryant和Burkey(1953)改良的Hungate(1950)的厭氧技術(shù)，或在含90％CO2和10％H2的缺氧盒中培養(yǎng)LRC培養(yǎng)物收藏處的微生物。在含有5ml改良的Scott和Dehority培養(yǎng)基(1965)的Hungate管中，篩選無(wú)氧生長(zhǎng)(100％CO2)的分離物的肌醇六磷酸酶活性，此培養(yǎng)基含有5％(v/v)瘤胃流體，0.2％(w/v)葡萄糖，0.2％(w/v)纖維二糖及0.3％(w/v)淀粉。39℃孵育12-24小時(shí)后，檢測(cè)全細(xì)胞或培養(yǎng)物上清中肌醇六磷酸酶活性。月形單胞菌是主要的肌醇六磷酸酶產(chǎn)生者(93％的分離物具有肌醇六磷酸酶活性，表1)。其他的能夠檢測(cè)到較大數(shù)量陽(yáng)性培養(yǎng)物的屬只有普雷沃氏菌(40個(gè)檢測(cè)物中有11個(gè)肌醇六磷酸酶陽(yáng)性)?？偣泊_定了29個(gè)基本上有肌醇六磷酸酶活性的培養(yǎng)物。其中24個(gè)為月形單胞菌屬，5個(gè)為普雷沃氏菌屬。其中11個(gè)培養(yǎng)物(11個(gè)屬于月形單胞菌屬，1個(gè)為普雷沃氏菌屬)的肌醇六磷酸酶比其他陽(yáng)性培養(yǎng)物高(表2)。在所有情況下，肌醇六磷酸酶活性主要與細(xì)胞相關(guān)。
實(shí)施例3反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)的肌醇六磷酸酶活性A．生長(zhǎng)及肌醇六磷酸酶的生產(chǎn)在反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)生長(zhǎng)過(guò)程中檢測(cè)了肌醇六磷酸酶的產(chǎn)生。此菌在含5ml具5％(v/v)反芻流體的改良Scott和Dehority培養(yǎng)基(1965)的Hungate管中于39℃生長(zhǎng)。生長(zhǎng)(蛋白濃度)與肌醇六磷酸酶活性(與細(xì)胞相關(guān)的)在24小時(shí)內(nèi)隔一定時(shí)間間隔監(jiān)測(cè)。反芻月形單胞菌在接種后8-10小時(shí)時(shí)，其生長(zhǎng)和肌醇六磷酸酶活性達(dá)到最大(圖2)。肌醇六磷酸酶活性升高反映了細(xì)胞生長(zhǎng)情況。B．肌醇六磷酸酶活性定位據(jù)測(cè)定，反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)的肌醇六磷酸酶活性主要是細(xì)胞相關(guān)的。在培養(yǎng)上清及細(xì)胞洗液中幾乎檢測(cè)不到肌醇六磷酸酶活性。根據(jù)Cheng和Costerton的描述(1973)，反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)的肌醇六磷酸酶活性通過(guò)電子顯微鏡定位。通過(guò)離心收集細(xì)胞，以緩沖液洗滌之；包埋于4％(w/v)瓊脂中，以0.5％戊二醛溶液預(yù)固定30分鐘，然后于5％(v/v)戊二醛溶液中固定2小時(shí)。用二甲胂酸緩沖液(0.1M,pH7.2)洗滌樣品5次并用2％(w/v)的四氧化鋨處理樣品，以二甲胂酸緩沖液洗樣品5次，然后以梯度酒精脫水，然后包埋于Spurr′s樹脂中(J.B.EM Services公司)。以Reichertmodel OM U3超薄切片機(jī)切成超薄切片并以2％(w/v)乙酸雙氧鈾和檸檬酸鋁染色。用Hitachi H-500 TEM在75kV加速電壓下觀察標(biāo)本。與未處理樣品相比，與底物孵育以使反應(yīng)產(chǎn)物沉積的反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)清楚地表明，肌醇六磷酸酶活性與細(xì)胞外膜表面相關(guān)(圖3)。電子密度物質(zhì)在經(jīng)處理的細(xì)胞外膜表面的沉積是肌醇六磷酸酶活性的結(jié)果(圖3A、B和C)。C．肌醇六磷酸酶的最佳pH最初的確定反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)肌醇六磷酸酶最佳pH的實(shí)驗(yàn)是整體細(xì)胞進(jìn)行的。在pH4.0-5.5之間，肌醇六磷酸酶活性最佳。第二個(gè)pH曲線是以MgCl2細(xì)胞提取液繪制的(圖5)。用無(wú)菌水洗兩次100ml過(guò)夜培養(yǎng)物細(xì)胞，以0.3體積的0.2M MgCl2水溶液重懸細(xì)胞并在0℃孵育過(guò)夜。離心澄清溶液，得到的提取物用于肌醇六磷酸酶測(cè)定。四種不同的緩沖系統(tǒng)用以覆蓋以下pH范圍甘氨酸(pH1.5-3.0)，甲酸(pH3.0-4.0)，乙酸(pH4.0-5.5)和琥珀酸(pH5.5-6.5)。D．肌醇六磷酸酶最適溫度在pH5.0(0.1M乙酸鈉緩沖液)下，用MgCl2細(xì)胞提取液測(cè)定反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)的最適溫度。在37-55℃范圍內(nèi)，此酶保留50％的活性(圖6)。E．離子和底物濃度對(duì)肌醇六磷酸酶活性的影響在pH5.0(0.1M乙酸鈉緩沖液)時(shí)，測(cè)定了各種離子(10mM)和底物濃度對(duì)全細(xì)胞肌醇六磷酸酶活性的影響。Ca++,Na+,K+和Mg++可刺激肌醇六磷酸酶活性，而Fe++,Zn++和Mn++抑制其活性，Co++和Ni++對(duì)其活性無(wú)影響(圖7)。底物濃度對(duì)反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)MgCl2細(xì)胞提取液的影響列于圖8。F．分子量通過(guò)酶譜分析測(cè)定了反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)的肌醇六磷酸酶分子大小。10倍濃縮的粗MgCl2提取物粗制品與20μl上樣緩沖液(Laemmli,1970)在微量離心管中混合，此離心管于沸水浴中放置5分鐘。變性的MgCl2抽提液在10％分離膠上進(jìn)行分析，分離膠上方為4％堆積膠(Laemmli,1970)電泳后，將凝膠浸入1％Triton X-100中室溫下放置1小時(shí)并在0.1M乙酸鈉緩沖液(pH5.0)中4℃放置1小時(shí)以復(fù)性肌醇六磷酸酶。將凝膠在含有4％肌醇六磷酸鈉的0.1M乙酸鈉緩沖液中(pH5.0)中孵育16小時(shí)以檢測(cè)肌醇六磷酸酶的活性。用實(shí)施例2中描述的肌醇六磷酸酶平板測(cè)定法，以氯化鈷和鉬酸銨/礬酸銨染色程序處理凝膠。觀察到一條明顯的活性條帶，相當(dāng)于分子量約35-45kDa。
實(shí)施例4從反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)中克隆肌醇六磷酸酶基因(phyA)A．分離肌醇六磷酸酶陽(yáng)性大腸桿菌克隆根據(jù)發(fā)表的程序(Hu等，1991；Sambrook等，1989)，制備了反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)的基因組文庫(kù)。利用改良的Priefer等(1984)描述的方法，從反芻月形單胞菌JY35(ATCC55785)過(guò)夜培養(yǎng)物中提取基因組DNA。反芻月形單胞菌JY35(ATCC55785)的基因組被Sau3A部分消化并用凝膠純化以產(chǎn)生2-10kb的DNA片段。將BamHⅠ切割的、去磷酸化的pUC18與反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)Sau3A基因組DNA片段相連以構(gòu)建基因組文庫(kù)。將連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(Gibco BRL,Mississauga,ON)并且在含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB篩選瓊脂上篩選6000個(gè)帶有插入克隆的肌醇六磷酸酶活性(透明區(qū))，LB篩選瓊脂包含有LB培養(yǎng)基，1.0％肌醇六磷酸鈉(過(guò)濾除菌)，100mM HEPES(pH6.0-6.5)，及0.2％CaCl2。肌醇六磷酸酶陽(yáng)性的SrP.2被分離到并且其肌醇六磷酸酶通過(guò)酶測(cè)定得以證實(shí)(
圖10)。在培養(yǎng)基和大腸桿菌細(xì)胞相關(guān)部分都檢測(cè)到了很高的肌醇六磷酸酶活性(表3)。從克隆SrP.2分離到的質(zhì)粒DNA帶有一個(gè)5.5kb的質(zhì)粒，命名為pSrP.2，包含有2.7kbSau3A插入片段的pUC18組成。B．源于反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)2.7kb插入片段的確證pSrP.2中的源于反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)的2.7kb的插入通過(guò)Southern印跡雜交(Sambrook等，1989)得以證實(shí)。從反芻月形單胞菌分離的基因組DNA用EcoRⅠ或HindⅢ酶切后，在0.8％瓊脂糖凝膠上分開。轉(zhuǎn)移到Zeta-probe膜上后(BioRad Laboratones)，在嚴(yán)格條件下(2×SSC,65℃)與地高辛標(biāo)記的pSrP.2中的2.7kb片段雜交過(guò)夜。(DIG DNA標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒，Boehringer MannheimCanada Ltd.,Laval,PQ)。印跡以2×SSC在室溫下洗兩次；0.1％SDS中放置5分鐘以0.1×SSC洗兩次；0.1％SDS在65℃作用20分鐘。根據(jù)DIG DNA標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒提供的方法對(duì)印跡顯色(BoehringerMannheim Canada Ltd)。
探針與一個(gè)14kb HindⅢ(
圖11)和一個(gè)23kb EcoRⅠ(數(shù)據(jù)未顯示)的基因組DNA片段反應(yīng)并且證明2.7kb片段源自反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)及基因組只存在有一個(gè)同源序列。與反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)的2.7kb片段同源的拷貝也存在于反芻月形單胞菌HD86,HD141和HD4的基因組中(數(shù)據(jù)未顯示)。然而反芻月形單胞菌HD86(9-和23-kb EcoRⅠ片段)和反芻月形單胞菌HD4(3-kb EcoRⅠ片段和一個(gè)20kb HindⅢ片段)中存在著限制性酶切片段多態(tài)性。來(lái)自pSrP.2的2.7kb的標(biāo)記片段不能與從普雷氏菌46/52；大腸桿菌DH5α或無(wú)花果曲霉NRRL 3135的基因組DNA雜交(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例5反芻月形單胞菌肌醇六磷酸酶基因的特征描述A．肌醇六磷酸酶基因克隆證據(jù)以質(zhì)粒pUC18和pSrP.2分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(Gibco BRL Mississauga,ON)。產(chǎn)生的氨芐青霉素轉(zhuǎn)化子用于在LB肌醇六磷酸酶檢測(cè)瓊脂上測(cè)定肌醇六磷酸酶活性。只有轉(zhuǎn)化了pSrP.2的大腸桿菌DH5α細(xì)胞能夠在LB肌醇六磷酸酶篩選瓊脂上產(chǎn)生透明區(qū)。B．pSrP.2的限制性和刪除分析限制性酶和刪除分析表明肌醇六磷酸酶基因位于2.7kb的Sau3A插入片段上(Ausubel等，1990；Sambrook等，1989)。攜帶有質(zhì)粒pSrP.2ΔSph1，是通過(guò)從pSrP.2上刪除1.4kb的Sph1片段得到的，它缺乏肌醇六磷酸酶活性(
圖12和
圖13，表3)。C．酶譜分析酶譜分析確定大腸桿菌DH5α(pSrP.2)表達(dá)的肌醇六磷酸酶的分子量。1ml的過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至一個(gè)1.5ml微量離心管中。離心收獲細(xì)胞并用0.1M乙酸鈉(pH5.5)洗滌細(xì)胞。細(xì)胞沉淀重懸于80μl上樣緩沖液中(Laemmli,1970)，并且微量離心管在沸水浴中放置5分鐘。得到的細(xì)胞抽提物在10％分離凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE分離，分離膠上層為4％堆積膠(Laemmli,1970)并以實(shí)施例3F描述的方法，染膠以測(cè)定肌醇六磷酸酶活性。觀察到單一的明顯活性帶，相當(dāng)于分子量約37kDa(
圖14,A泳道)。在大腸桿菌DH5α(pSrP.2ΔSph1)細(xì)胞未觀察到相應(yīng)的活性帶(
圖14,B泳道)。D.pSrP.2的DNA序列分析pSrP.2中的2.7kb片段的全序列被測(cè)定。制備的用于DNA測(cè)序的樣品通過(guò)用Taq DyeDeoxyTM終止于循環(huán)測(cè)序試劑盒(AppliedBiosystems)在Applied Biosystems的Model 373A DNA測(cè)序系統(tǒng)(Applied Biosystems,Inc.,Mississauga,ON)上進(jìn)行分析。用WizardTMminipreps DNA純化系統(tǒng)(Promega Corp.,Madison,WI)從過(guò)夜培養(yǎng)的大腸桿菌DH5α(pSrP.2)中提取模板DNA。引物步行法產(chǎn)出了互相重疊的序列。用MacDNASIS DNA軟件(HitachiSoftware Engineering Co,Ltd,San Bruno,CA)分析DNA序列數(shù)據(jù)。
測(cè)定了2.7kb插入片段的序列，DNA結(jié)構(gòu)分析確定了一個(gè)讀碼框架(ORF2,1493-2503堿基)與2.7kb Sau3A插入片段的Sphl位點(diǎn)重疊而足以編碼37kDa的肌醇六磷酸酶。缺失1518堿基至2.7kb Sau3A片段末端序列(pSrPr6，表3，
圖13)則失去肌醇六磷酸酶活性。這是通過(guò)將測(cè)序引物SrPr6(CGG GAT GCT TCT GCC AGT AT,SEQID NO.3,1518-1538堿基的反向互補(bǔ)序列)與M13正向引物(CGCCAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC)之間的來(lái)自pSrP.2的PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-T載體(Promega Corp)完成的。pSrP.2的PCR產(chǎn)物亞克隆，引物SrPf6(1232-1252堿基，CGT CCA CGG AGTCAC CCT AC)SEQ ID NO.4和M13反向引物(AGC GGA TAA CAATTT CAC ACA GGA)之間的序列包括ORF2及Sphl切割上游的252個(gè)堿基仍具有肌醇六磷酸酶活性(表3，
圖13)。
反芻月形單胞菌肌醇六磷酸酶基因(phyA)的序列和翻譯示于
圖15。ORF2的翻譯將導(dǎo)致一個(gè)346氨基酸多肽的表達(dá)，預(yù)測(cè)其分子量為39.6kDa(
圖15)。起始的31個(gè)殘基為典型的原核信號(hào)序列，包含a堿性N-末端和中間疏水核心(von Heijne,1986)。運(yùn)用von Heijne(1986)方法預(yù)測(cè)的信號(hào)肽酶切割位點(diǎn)很可能發(fā)生在Ala28或Pro31之前。通過(guò)測(cè)定凝膠純化的源于DH5α(pSrPf6)培養(yǎng)上清的N-末端氨基酸序列得以證實(shí)(
圖15)。分泌型的成熟蛋白可能的質(zhì)量為36.5kDa。
與MasDNASIS SWISSPROT數(shù)據(jù)庫(kù)中已知蛋白序列相比，PhyA氨基酸與已發(fā)表的序列無(wú)明顯的相似性，包括黑曲霉肌醇六磷酸酶基因phyA和phyB。
實(shí)施例6大腸桿菌表達(dá)的phyA產(chǎn)品的部分純化和特征描述從大腸桿菌(pSrPf6)過(guò)夜培養(yǎng)物中制備的無(wú)細(xì)胞上清以3∶1(v/v)與Ni++-NTA瓊脂糖混合，后者以0.1M Tris(pH7.9),0.3M NaCl緩沖液預(yù)平衡過(guò)?；旌衔镌谑覝叵路跤?.5小時(shí)并以0.1MTris(pH7.9),0.3M NaCl緩沖液洗3次。以1體積的0.1M乙酸鈉(pH5.0),0.3M NaCl洗滌樹脂以洗脫肌醇六磷酸酶。當(dāng)在SDS-PAGE凝膠上分離并以考馬斯亮藍(lán)染色時(shí)，70％以上的洗脫蛋白形成一條37kDa的蛋白帶。酶譜及N端氨基酸序列分析證實(shí)了37-kDa條帶與克隆的反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)phyA編碼的肌醇六磷酸酶一致。Ni++-NTA瓊脂糖純化的肌醇六磷酸酶特異性活性為200-400μmol釋放的磷酸/分鐘/mg蛋白。它比報(bào)道的純化的無(wú)花果曲霉NRRL 3135肌醇六磷酸酶特異性活性高2-4倍(van Gorcum等，1991,1995；van Hartingsveldt等，1993)。
實(shí)施例7反芻月形單胞菌phyA基因的過(guò)表達(dá)從反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)中分離和定性phyA基因使得可用已知的方法在任一原核(如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌)或真核(如真菌-畢赤酵母屬，糖酵母屬，曲霉屬，木霉屬，植物-芥屬，玉米(茄屬)，或動(dòng)物-家禽，豬或魚)表達(dá)系統(tǒng)中大規(guī)模生產(chǎn)蛋白PhyA。下面將提供在大腸桿菌、巴斯德畢赤酵母和歐洲油菜中構(gòu)建和表達(dá)phyA的方法。相似的方法可用于在其他原核和真核生物中表達(dá)反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)肌醇六磷酸酶。A．反芻月形單胞菌phyA在大腸桿菌中的克隆-特定的表達(dá)構(gòu)建體一個(gè)表達(dá)構(gòu)建體被構(gòu)建，其中編碼成熟PhyA的區(qū)域與tac啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄上融合在一起(Brosius等，1985)。此啟動(dòng)子序列可被在大腸桿菌中提供高效表達(dá)的其他啟動(dòng)子替代。此表達(dá)構(gòu)建體通過(guò)轉(zhuǎn)化被導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞。
?。竽c桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建很多以tac或相關(guān)啟動(dòng)子為基礎(chǔ)的大腸桿菌表達(dá)載體都商品化了。此實(shí)施例中，構(gòu)建體從Pharmacia生物公司的pKK 223-3(Uppsala,Sweden)制備而來(lái)。編碼成熟PhyA的phyA區(qū)域(除掉信號(hào)肽后多肽被分泌)被寡核苷酸引物MATE2(GC GAA TTC ATG GCC AAG GCGCCG GAG CAG AC)(SEQ ID NO.5)和M13反向引物擴(kuò)增。寡核苷酸MATE2(SEQ ID NO.5)的末端設(shè)計(jì)有合適的限制性位點(diǎn)使擴(kuò)增產(chǎn)物直接裝配入pKK 223-3。以MATE2(SEQ ID NO.5)和M13反向引物擴(kuò)增的phyA區(qū)域被EcoRⅠ和SmaⅠ消化并與被同樣切割的pKK223-3相連接。
ⅱ．大腸桿菌的轉(zhuǎn)化和PhyA的表達(dá)pKK 223-3∷phyA連接混合物用以轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。適于高水平表達(dá)蛋白的菌株如SG 13009,CAG 926或CAG 929(如pREP4一類質(zhì)粒上攜帶lacl基因)被利用。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂于含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB瓊脂上并在37℃孵育過(guò)夜。通過(guò)提取pDNA并將pDNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和限制性酶切分析，篩選氨芐抗性克隆以得到所要的pKK 223-3∷phyA構(gòu)建體。陽(yáng)性克隆可進(jìn)一步通過(guò)PCR和DNA序列分析驗(yàn)證。
反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)肌醇六磷酸酶在轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的表達(dá)可以下述方法檢測(cè)，首先在含有適當(dāng)?shù)目股剡x擇物的合適的液體培養(yǎng)基(如LB或2×YT)中37℃劇烈通氣狀況下培養(yǎng)細(xì)菌直至光密度(600nm處)為0.5-1.0。通過(guò)將終濃度為0.1-2mM的IPTG加入到培養(yǎng)基中以誘導(dǎo)tac啟動(dòng)子。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)2-4小時(shí)并離心收集之。蛋白的表達(dá)通過(guò)SDS-PAGE,Western印跡/免疫檢測(cè)技術(shù)被監(jiān)測(cè)。通過(guò)破碎(如超聲處理或機(jī)械破碎)大腸桿菌細(xì)胞以提取表達(dá)的PhyA。PhyA包涵體可通過(guò)離心收獲并溶于1-2％SDS。SDS可通過(guò)透析、電洗脫或超濾除掉。制備的細(xì)胞裂解物中的肌醇六磷酸酶活性可以實(shí)施例2中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測(cè)定。B．反芻月形單胞菌phyA在巴斯德畢赤酵母中的克隆-特定的表達(dá)構(gòu)建體一個(gè)表達(dá)構(gòu)建體的構(gòu)建，其中的編碼成熟PhyA的區(qū)域與巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體的分泌信號(hào)序列轉(zhuǎn)錄上融合(Pichia Expression KitInstruction Manual,Invitrogen Corporation,San Diego,CA)以使表達(dá)的反芻月形單胞菌肌醇六磷酸酶為分泌形式。啟動(dòng)子和分泌信號(hào)序列可被在畢赤酵母屬中提供高效表達(dá)的其他啟動(dòng)子替代。此表達(dá)構(gòu)建體通過(guò)轉(zhuǎn)化被導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。
?。退沟庐叧嘟湍副磉_(dá)載體的構(gòu)建很多以aox1啟動(dòng)子和α-因子或phol信號(hào)序列為基礎(chǔ)的巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體都商品化了。在此實(shí)施例中，構(gòu)建體是從Invitrogen公司的pPIC9制備而來(lái)。編碼成熟PhyA的phyA區(qū)域被寡核苷酸引物MATE(GC GAA TTC GCC AAG GCG CCG GAG CAG AC)(SEQ ID NO.6)和M13反向引物擴(kuò)增。寡核苷酸MATE(SEQ ID NO.6)的末端設(shè)計(jì)有合適的限制性酶切位點(diǎn)以使擴(kuò)增產(chǎn)物直接裝配到pPIC9。以MATE(SEQ ID NO.6)和M13反向引物擴(kuò)增的phyA區(qū)被EcoRⅠ消化并與相似切割的pPIC9相連接。
ⅱ．巴斯德畢赤酵母的轉(zhuǎn)化和PhyA表達(dá)pPIC9∷phyA連接混合物用以轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂于含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB瓊脂上并與37℃孵育過(guò)夜。通過(guò)提取pDNA并將pDNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和限制性酶切分析，篩選氨芐陽(yáng)性克隆以得到所要的pPIC9∷phyA構(gòu)建體。陽(yáng)性克隆進(jìn)一步通過(guò)PCR和DNA序列分析驗(yàn)證。從1L攜帶所要的pPIC9∷phyA構(gòu)建體的大腸桿菌克隆過(guò)夜培養(yǎng)物中制備質(zhì)粒DNA。以BglⅡ消化pDNA并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析以證實(shí)載體消化完全。消化的pDNA經(jīng)過(guò)酚氯仿抽提，乙醇沉淀后，以1μg/ml的終濃度重懸于無(wú)菌蒸餾水中。為了轉(zhuǎn)化，巴斯德畢赤酵母GS115或KM71細(xì)胞在YPD培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)24小時(shí)。離心收集100μl培養(yǎng)物中的細(xì)胞并將之懸于100μl轉(zhuǎn)化緩沖液中(0.1M LiCl,0.1M DTT,45％聚乙二醇4000),100μl轉(zhuǎn)化緩沖液中含有10μg鮭精DNA和10μg線性化的pPIC9∷phyA。此混合物于37℃孵育1小時(shí)，涂于巴斯德畢赤酵母基本瓊脂培養(yǎng)基上并孵育2-5天。將在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的克隆劃線純化并用PCR和Southern印跡雜交的方法分析整合phyA是否存在。
反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)肌醇六磷酸酶在轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母細(xì)胞中的表達(dá)可以下列方法檢測(cè)，在合適培養(yǎng)基中(如緩沖性復(fù)合甘油培養(yǎng)基如BMGY)在劇烈通氣狀況下于30℃培養(yǎng)直至培養(yǎng)物的光密度(600nm)達(dá)到2-6。收獲細(xì)胞并將之以O(shè)D600=1.0重懸于誘導(dǎo)培養(yǎng)基(如緩沖性復(fù)合甲醇培養(yǎng)基，BMMY)并進(jìn)一步孵育3-5天。分別收集細(xì)胞和無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)上清，并以酶測(cè)定，SDS-PAGE和Western印跡/免疫檢測(cè)等技術(shù)監(jiān)控蛋白表達(dá)情況。C．反芻月形單胞菌phyA在巴斯德畢赤酵母中的克隆-特定表達(dá)載體-一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施例一個(gè)表達(dá)載體的構(gòu)建，其中編碼成熟PhyA的區(qū)域與巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體(如，Pichia Expression Kit Instruction Manual,Invitrogen公司，San Diego,CA)上的分泌信號(hào)序列在轉(zhuǎn)錄上融合以使表達(dá)的反芻月形單胞菌肌醇六磷酸酶為分泌形式。啟動(dòng)子和分泌信號(hào)序列可被能在畢赤酵母屬中提供高效表達(dá)的其他啟動(dòng)子替代。此表達(dá)構(gòu)建體通過(guò)轉(zhuǎn)化被導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。
?。退沟庐叧嘟湍副磉_(dá)載體的構(gòu)建很多以aox1啟動(dòng)子和α-因子或pho1信號(hào)序列為基礎(chǔ)的巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體都已商品化。在此實(shí)施例中的構(gòu)建體是以Invitrogen公司的pPICZαA制備而來(lái)。編碼成熟phyA的phyA區(qū)域(即，信號(hào)肽去除后的分泌多肽)被寡核苷酸引物MATE(GC GAA TTC GCC AAGGCG CCG GAG CAG AC SEQ ID NO.6)和M13反向引物擴(kuò)增。寡核苷酸MATE(SEQ ID NO.6)的末端設(shè)計(jì)有EcoRⅠ限制性位點(diǎn)以使擴(kuò)增產(chǎn)物直接裝配到pPICZαA中。以MATE(SEQ ID NO.6)和M13反向引物擴(kuò)增的phyA區(qū)域被EcoRⅠ消化與相似相割的pPICZαA相連接。
ⅱ．巴斯德畢赤酵母的轉(zhuǎn)化pPICZαA∷phyA連接混合物用以轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的細(xì)菌涂于含有Zeocin(25mg/ml)的LB瓊脂上并于37℃孵育過(guò)夜。通過(guò)pDNA并將之進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和限制性分析篩選Zeocin抗性的克隆以獲得所要的pPICZαA∷phyA構(gòu)建體。陽(yáng)性克隆進(jìn)一步進(jìn)行PCR和DNA序列分析驗(yàn)證。從1L攜帶有所要pPICZαA∷phyA構(gòu)建體的大腸桿菌過(guò)夜培養(yǎng)物中制備質(zhì)粒DNA。以BglⅡ消化pDNA并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)載體消化完全。消化的pDNA經(jīng)酚氯仿抽提，乙醇沉淀后以1μg/μl終濃度重懸于無(wú)菌蒸餾水中。
為了轉(zhuǎn)化，接種有巴斯德畢赤酵母GS115細(xì)胞的50ml YPD肉湯在28℃250RPM孵育1天。隨后，將5ml的1天培養(yǎng)物接種到50ml新鮮YPD肉湯中。培養(yǎng)物于28℃,250RPM擴(kuò)增過(guò)夜。次日早上，將5ml培養(yǎng)物接種50ml新鮮的YPD肉湯。培養(yǎng)物繼續(xù)在28℃250RPM孵育直至OD600值達(dá)到約1.2(約6小時(shí))。離心收集20ml新鮮培養(yǎng)物中的酵母細(xì)胞，以室溫下含10mM Tris,1mM EDTA,0.1M LiCl,0.1M dTT的緩沖液(pH7.4)洗滌細(xì)胞并用1ml同樣的緩沖液重懸細(xì)胞。在30℃孵育1小時(shí)后，用1ml冰冷的水和1ml冰冷的1M山梨醇分別洗滌細(xì)胞1次。細(xì)胞重懸于160μl冰冷的1M山梨醇(細(xì)胞濃度約為1010細(xì)胞/ml)。線性化的pPICZαA∷phyA(5-10μg)與80μl細(xì)胞混合，加于預(yù)冷的電穿孔杯中(電極間距離0.2cm)并在冰上孵育5分鐘。以Bio-Rad Gene PulserTM對(duì)小杯使以高壓脈沖(1.5kV,25μF,200 Ohms)。脈沖后立即向小杯中加入1ml冰冷的1M山梨醇，隨后將之在30℃孵育2小時(shí)。細(xì)胞懸液(100-200μl/平板)涂于含Zeocin(100μg/ml)YPD瓊脂培養(yǎng)基上并于30℃孵育2-4天。在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的克隆劃線純化并以PCR和/或Southern印跡雜交檢測(cè)整合的phyA是否存在。
ⅲ．反芻月形單胞菌JY35肌醇六磷酸酶基因在巴斯德畢赤酵母的表達(dá)反芻月形單胞菌JY35肌醇六磷酸酶基因在轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母細(xì)胞中表達(dá)的檢測(cè)可以下述方法進(jìn)行，轉(zhuǎn)化細(xì)胞在緩沖性復(fù)合甘油培養(yǎng)基中(如緩沖性復(fù)合甘油培養(yǎng)基BMGY,Pichia Expression KitInstruction Manual)于28℃,250 RPM培養(yǎng)過(guò)夜后被轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)培養(yǎng)基(如緩沖性復(fù)合甘油培養(yǎng)基，BMMY)中。從BMGY中收獲的細(xì)胞以BMMY培養(yǎng)基洗滌1次，并以O(shè)D600=1.0重懸于BMMY且在28℃,250RPM繼續(xù)培養(yǎng)3-5天。每隔24小時(shí)加1次甲醇(0.005體積)。分別收集細(xì)胞和無(wú)細(xì)胞上清以測(cè)定肌醇六磷酸酶活性。
在BMMY培養(yǎng)基中培養(yǎng)96小時(shí)后，16個(gè)巴斯德畢赤酵母pPICZαA∷MATE轉(zhuǎn)化子用以檢測(cè)肌醇六磷酸酶活性?；钚缘淖畲蟮霓D(zhuǎn)化子命名為克隆17被選做進(jìn)一步研究。在9天中監(jiān)測(cè)巴斯德畢赤酵母pPICZαA∷MATE克隆17和陰性克隆(巴斯德畢赤酵母pPICZαA)的生長(zhǎng)和肌醇六磷酸酶產(chǎn)生情況。在10ml BMGY(甘油)培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)分離物(28℃,250RPM)以制備促酵物。細(xì)胞收獲并通過(guò)將細(xì)胞以O(shè)D600=2.5重懸于50ml BMMY(甲醇)培養(yǎng)基而制備雙份培養(yǎng)物。得到的培養(yǎng)物被轉(zhuǎn)到500ml三角瓶中并在28℃ 250RPM下孵育。每隔24小時(shí)向培養(yǎng)基中加入終濃度為0.5％甲醇。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中測(cè)量光密度和肌醇六磷酸酶活性。結(jié)果列于表4。只在攜帶有反芻月形單胞菌phyA基因的培養(yǎng)物中檢測(cè)到了肌醇六磷酸酶活性。在培養(yǎng)了210.5小時(shí)后，這些培養(yǎng)物產(chǎn)生的肌醇六磷酸酶高達(dá)22.5單位/ml。
通過(guò)改進(jìn)誘導(dǎo)方法和培養(yǎng)基組合物，搖動(dòng)三角瓶培養(yǎng)物的肌醇六磷酸酶活性有所提高。通過(guò)提高誘導(dǎo)培養(yǎng)基中最初細(xì)胞密度(OD610=36.0)，克隆17的肌醇六磷酸酶活性有很大改進(jìn)。在培養(yǎng)接近4天時(shí)(91.5h)總體培養(yǎng)物和無(wú)細(xì)胞上清樣品的肌醇六磷酸酶活性分別在40單位/ml和20單位/ml以上。這些培養(yǎng)物的光密度(OD610)在62和69之間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明甲醇誘導(dǎo)時(shí)培養(yǎng)物量越大，重組肌醇六磷酸酶的產(chǎn)量越大。在富含氧的、最佳生長(zhǎng)條件下緊密控制的發(fā)酵罐系統(tǒng)中培養(yǎng)的畢赤酵母屬，其生物量可高達(dá)150g/L(干重)或光學(xué)密度為1500。
畢赤酵母屬肌醇六磷酸酶的產(chǎn)量可通過(guò)在培養(yǎng)基中加入Tween-80得以提高。以前有報(bào)道，表面活性物質(zhì)可影響碳黑曲霉(AspergillusCarbonarius)的肌醇六磷酸酶的產(chǎn)量(Al-Asheh和Duvnjak,1994)。將0,0.02,0.1或0.5％的Tween-80加入到培養(yǎng)巴斯德畢赤酵母pPICZαA∷MATE克隆17的培養(yǎng)中對(duì)肌醇六磷酸酶產(chǎn)量的影響列于表5。從培養(yǎng)了2天的YPD培養(yǎng)物中收獲細(xì)胞并重懸于BMMY中(OD610=8.3)。每種濃度的Tween-80準(zhǔn)備三份并于28℃,250RPM孵育。每天往三角瓶中加入甲醇(0.005體積)。含有較高濃度Tween-80的培養(yǎng)基中肌醇六磷酸酶活性升高更快。而且，當(dāng)較高濃度Tween-80使用時(shí)，大部分的肌醇六磷酸酶活性存在于上清。在補(bǔ)充0.5％Tween-80的BMMY培養(yǎng)基中培養(yǎng)克隆17 9天后，搖動(dòng)三角瓶中培養(yǎng)物的肌醇六磷酸酶產(chǎn)量可高達(dá)298單位/ml。
SDS-PAGE分析細(xì)胞和上清中的蛋白以證實(shí)由巴斯德畢赤酵母產(chǎn)生的PhyA。當(dāng)5μl的上清在12％SDS-PAGE凝膠上分離時(shí)，可明顯看到一條37kDa蛋白帶。細(xì)胞蛋白樣品中也可看到一條37kDa的帶而其量不到相應(yīng)的上清中量的10％。除了PhyA，克隆17的上清中有很少其他蛋白(畢赤酵母屬表達(dá)的有用的特征)。重組PhyA蛋白占分泌蛋白的95％以上(從SDS-PAGE凝膠電泳估計(jì))。在陰性對(duì)照培養(yǎng)物(巴斯德畢赤酵母pPICZαA)的上清或細(xì)胞中都沒(méi)有37kDa的蛋白帶。
表達(dá)反芻月形單胞菌肌醇六磷酸酶(PhyA)重組巴斯德畢赤酵母細(xì)胞的搖動(dòng)三角瓶實(shí)驗(yàn)表明了這種蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)的潛力。通過(guò)在發(fā)酵罐中培養(yǎng)和誘導(dǎo)克隆17，肌醇六磷酸酶的產(chǎn)量有很明顯的提高。通過(guò)進(jìn)一步篩選獨(dú)立的轉(zhuǎn)化子或使用多拷貝載體系統(tǒng)增加基因拷貝數(shù)從而使肌醇六磷酸酶的產(chǎn)量還會(huì)有所增加。畢赤酵母屬中1/10-1/100的轉(zhuǎn)化子發(fā)生自發(fā)的多質(zhì)粒整合。通過(guò)控制肌醇六磷酸酶基因拷貝數(shù)量和發(fā)酵參數(shù)，有望使肌醇六磷酸酶產(chǎn)生提高10倍(如3000單位/ml)。這會(huì)使其生產(chǎn)水平可與商業(yè)化無(wú)花果曲霉肌醇六磷酸酶生產(chǎn)系統(tǒng)相比。據(jù)說(shuō)這些系數(shù)的產(chǎn)量約為3000000單位(釋放的μmol Pi/分鐘)肌醇六磷酸酶活性/L培養(yǎng)物。
ⅳ．重組反芻月形單胞菌肌醇六磷酸酶(PhyA)對(duì)谷物底物的活性檢測(cè)了由巴斯德畢赤酵母生產(chǎn)的反芻月形單胞菌JY35肌醇六磷酸酶使谷物釋放的磷。谷物飼料被磨碎并通過(guò)一個(gè)網(wǎng)孔篩以得到大小為1-3mm的顆粒。將磨碎的谷物(0.5g)稱重后加入滅菌的15ml Falcon管中，并將此管中加入2ml 0.1M乙酸鈉緩沖液(pH5.0)。加入肌醇六磷酸酶后，反應(yīng)混合物于37℃孵育。通過(guò)測(cè)量上清中磷酸量確定釋放的磷酸。為測(cè)量背景磷酸，制備反應(yīng)混合物后立即加入5％TCA終止反應(yīng)。所有實(shí)驗(yàn)都有三份。
在乙酸緩沖液中孵育谷物導(dǎo)致隨著時(shí)間的進(jìn)行，磷的釋放量也增加(表6)。盡管肌醇六磷酸酶的加入會(huì)明顯增加磷的釋放量，磷釋放率隨時(shí)間進(jìn)行減慢。
加入到孵育混合物中的肌醇六磷酸酶的濃度影響磷的釋放量。將肌醇六磷酸酶濃度從0.08單位提高到0.48單位/g谷物導(dǎo)致上清中磷水平的增加(表7)。應(yīng)注意到，將肌醇六磷酸酶的濃度從0.32提高到0.48單位則釋放磷的增加量微乎其微。D．反芻月形單胞菌phyA基因在歐洲油菜種子中的克隆-特定表達(dá)構(gòu)建體已發(fā)展了針對(duì)多種單子葉和雙子葉作物的轉(zhuǎn)化和基因表達(dá)方法。在此實(shí)施例中，構(gòu)建了一個(gè)反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)肌醇六磷酸酶表達(dá)構(gòu)建體，其中編碼成熟PhyA的區(qū)域與一個(gè)油質(zhì)蛋白編碼基因融合以使目的種子油體專門表達(dá)反芻月形單胞菌肌醇六磷酸酶。啟動(dòng)子和/或分泌信號(hào)序列可被能夠在歐洲油菜或其他轉(zhuǎn)化植物中提供高效表達(dá)的啟動(dòng)子取代。此表達(dá)構(gòu)建體通過(guò)土壤細(xì)菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化導(dǎo)入歐洲油菜細(xì)胞。
?。畾W洲油菜表達(dá)載體的構(gòu)建文獻(xiàn)(Gelvin等，1993)描述了多種在歐洲油菜起作用的表達(dá)載體。在此實(shí)施例中，用編碼phyA成熟CDS的片段替代pCGOBPGUS(van Rooijen和Moloney,1994)中的大腸桿菌的β-葡糖苷酸酶從而制備構(gòu)建體。這可通過(guò)將pCGOBPGUS的PstⅠ KpnⅠ片段亞克隆到PstⅠKpnⅠ消化的pUCBM20上完成，pCGOBPGUS包含有油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子∷油質(zhì)蛋白CDS∷β-葡糖苷酸酶∷NOS區(qū)，pUCBM20為Boehringer Mannheim Canada,Laval,PQ的產(chǎn)品。此質(zhì)粒被稱為pBMOBPGUS。編碼成熟PhyA的phyA區(qū)域被寡核苷酸引物MATN(GA GGA TCC ATG GCC AAG GCG CCG GAG CAG AC)(SEQ IDNO.7)和M13反向引物擴(kuò)增。寡核苷酸MATN(SEQ ID NO.7)的末端設(shè)計(jì)有合適的限制性酶切位點(diǎn)使擴(kuò)增產(chǎn)物直接裝配到消化后的pBMOBPGUS中。以MATN(SEQ ID NO.7)和M13反向引物擴(kuò)增的phyA片段被NcoⅠSstⅠ消化并被連入以相似切割的pBMOBPGUS以產(chǎn)生質(zhì)粒pBMOBPphyA。歐洲油菜表達(dá)載體，pCGOBPphyA，是通過(guò)用pBMOBPphyA的PstⅠKpnⅠ片段替代pCGOBPGUS的PstⅠKpnⅠ片段制備成的，pBMOBPphyA包含有油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子∷油質(zhì)蛋白CDS∷phyA CDS∷NOS片段。
ⅱ．歐洲油菜的轉(zhuǎn)化及PhyA的表達(dá)根據(jù)van Rooijen和Moloney(1994)描述的方法制備轉(zhuǎn)基因歐洲油菜。用電穿孔法將pCGOBPphyA轉(zhuǎn)入根癌土壤桿菌EHA101(pCGOBPphyA)。在外植體上使轉(zhuǎn)基因植物再生，外植體植根于含有20μg/ml卡那霉素的無(wú)激素MS培養(yǎng)基中。測(cè)定幼小植物體的NPTⅡ活性，生長(zhǎng)至成熟，自花傳粉并結(jié)種子。收集來(lái)個(gè)單個(gè)轉(zhuǎn)化子的種子，部分種子用以測(cè)定其肌醇六磷酸酶活性并與未轉(zhuǎn)化植物的種子相比較。用具最高活性肌醇六磷酸酶活性的克隆種子繁殖第二代植物(T2)。選擇NPTⅡ?yàn)榧兒献?phyA也為純合子)的T2植物種子并用以大量繁殖植物(T3),T3能夠產(chǎn)生最高量的肌醇六磷酸酶。
實(shí)施例8其他微生物中肌醇六磷酸酶相關(guān)基因的鑒定為了鑒定與phyA相關(guān)的肌醇六磷酸酶基因，可用雜交分析篩選來(lái)自一個(gè)或多個(gè)目的反芻分離物的核苷酸，所用的方法為實(shí)施例4B所描述的技術(shù)(Sambrook,1989；Ausubel,1990)，探針為phyA(SEQID NO.1)或其一部分。用已知的方法克隆相關(guān)核苷酸。為了提高分析的敏感性，當(dāng)被篩選的生物基因組比較復(fù)雜時(shí)，可用放射性同位素(即32P)。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)可用于鑒定phyA相關(guān)基因。用SEQ IDNO.1的序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物進(jìn)行PCR(或變異PCR如RT-PCR)以優(yōu)先擴(kuò)增純的或混合培養(yǎng)物中的相關(guān)序列。擴(kuò)增產(chǎn)物可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳觀察并用已知方法克隆?？捎眠@些技術(shù)檢測(cè)多種材料，如細(xì)胞，克隆，斑，及提取的核酸(如DNA、RNA)，以觀察相關(guān)序列的存在情況。另外，可用PhyA(SEQ ID NO.2)特異的抗體的免疫檢測(cè)技術(shù)以篩選整個(gè)細(xì)胞或提取的目的蛋白以觀察相關(guān)的肌醇六磷酸酶的存在情況。表1．瘤胃細(xì)菌的肌醇六磷酸酶活性
表2．所選瘤胃細(xì)菌分離物的肌醇六磷酸酶活性
*U=釋放的Pi微摩爾數(shù)/分鐘表3．反芻月形單胞菌1肌醇六磷酸酶在重組大腸桿菌DH5α中的表達(dá)
1反芻月形單胞菌JY35是一種桿狀、新月性、專性厭食微生物，發(fā)酵葡萄糖過(guò)程中產(chǎn)生丙酸，能發(fā)酵乳糖，不發(fā)酵甘油，甘露醇(見Bergey′s系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)，John G.Holt編輯，Williams and Wilkins,Baltimore,1984)2單位=釋放Pi的微摩爾數(shù)/分鐘3括號(hào)內(nèi)的數(shù)字為標(biāo)準(zhǔn)誤4ND=未被檢測(cè)表4．轉(zhuǎn)化了pPICZαA(陰性對(duì)照)或pPICZαA∷MATE(克隆17)的巴斯德畢赤酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和肌醇六磷酸酶活性<
表5．Tween-80濃度對(duì)轉(zhuǎn)化有pPICZαA∷MATE(克隆17)的巴斯德畢赤酵母的生長(zhǎng)和肌醇六磷酸酶活性的影響
表6．孵育時(shí)間及重組反芻月形單胞菌JY53肌醇六磷酸酶(2單位/克谷物)對(duì)從谷物中釋放磷酸的影響
表7．重組反芻月形單胞菌JY35肌醇六磷酸酶濃度對(duì)從谷物中釋放磷酸的影響
<p>參考文獻(xiàn)Al-Asheh,S.和Z.Duvnjak.1994。表面活性劑對(duì)肌醇六磷酸酶生產(chǎn)的影響及在固態(tài)發(fā)酵方法中Aspergillus carbonarius引起的canola谷物中肌醇六磷酸含量的下降。生物技術(shù)通訊16:183-188。
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此處列出的發(fā)表物體現(xiàn)了與本發(fā)明相關(guān)的領(lǐng)域內(nèi)熟練技術(shù)人員的技術(shù)水平。此處的發(fā)表物通過(guò)參考文獻(xiàn)連為一體如同每一篇發(fā)表物都通過(guò)參考文獻(xiàn)顯示出來(lái)。
盡管前述發(fā)明通過(guò)舉例和實(shí)施例的方式進(jìn)行了詳細(xì)地描述，舉例和實(shí)施例是為了清晰和便于理解，很明顯，某些變化和改良在權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人Cheng,Kuo-JoanSelinger,Leonard B.
Yanke,Lindsey J.
Bae,Hee-DongZhou,Lu MingForsberg,Cecil W.
(ⅱ)發(fā)明題目編碼反芻微生物肌醇六磷酸酶的DNA序列(ⅲ)序列數(shù)7(ⅵ)通訊地址(A)收信人McKay-Carey&amp;Company(B)街道2125,10155-102 St.
(C)城市Edmonton(D)州Alberta(E)國(guó)家加拿大(F)郵編T5J 4G8(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)形式軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)可操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0 Version #1.30(ⅵ)目前申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)入檔日期May 23,1997(C)分類(ⅷ)律師/代理人信息(A)姓名Mary Jane Mckay-Carey(B)注冊(cè)號(hào)碼(C)參考/備案號(hào)37003WO0(ⅸ)聯(lián)系信息
(A)電話(403)424-0222(B)傳真(403)421-0834(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1401個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)環(huán)性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅲ)推斷的不是(ⅳ)反義的不是(ⅵ)最初出處(A)生物反芻月形單胞菌(B)株JY35(ⅶ)最近出處(A)文庫(kù)基因組DNA文庫(kù)(B)克隆pSrP.2(ⅳ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置231-1268(C)鑒定方法實(shí)驗(yàn)的(D)其他信息/密碼子_起始=231/功能=“肌醇六磷酸脫磷酸作用”/產(chǎn)物=“肌醇六磷酸酶”/證據(jù)=實(shí)驗(yàn)的/基因=“phyA”/數(shù)量=1/標(biāo)準(zhǔn)名字=“肌醇六磷酸磷酸水解酶”/引用名=([1])(ⅳ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞信號(hào)肽
(B)位置231..311(C)鑒定方法實(shí)驗(yàn)(D)其他信息/密碼子_起始=1/功能=“肌醇六磷酸酶分泌”/產(chǎn)物=“信號(hào)肽”/證據(jù)=實(shí)驗(yàn)的/引用=([1])(ⅳ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞成熟肽(B)位置312..1268(C)鑒定方法實(shí)驗(yàn)的(D)其他信息/密碼子_起始=312/產(chǎn)物=“肌醇六磷酸酶”/證據(jù)=實(shí)驗(yàn)的/數(shù)量=2/引用=([1])(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:CGTCCACGGA GTCACCCTAC TATACGACGT ATGTGAAGTT CACGTCGAAG TTCTAGGGAA 60TCACCGATTC GTGCAGGATT TTACCACTTC CTGTTGAAGC GGATGAGAAG GGGAACCGCG 120AAGCGGTGGA AGAGGTGCTG CACGACGGAC GATCGCGCTG AATGAATCAG TGCTTCCTAA 180CTATTGGGAT TCCGCGCAGA CGCGCGGATG GAGTAAAGGA GTAAGTTGTT ATG AAA 236Met Lys-27TAC TGG CAG AAG CAT GCC GTT CTT TGT AGT CTC TTG GTC GGC GCA TCC284Tyr Trp Gln Lys His Ala Val Leu Cys Ser Leu Leu Val Gly Ala Ser-25 -20 -15 -10CTC TGG ATA CTG CCG CAG GCC GAT GCG GCC AAG GCG CCG GAG CAG ACG332Leu Trp Ile Leu Pro Gln Ala Asp Ala Ala Lys Ala Pro Glu Gln Thr-51 5GTG ACG GAG CCC GTT GGG AGC TAC GCG CGC GCG GAG CGG CCG CAG GAC380Val Thr Glu Pro Val Gly Ser Tyr Ala Arg Ala Glu Arg Pro Gln Asp10 15 20TTC GAG GGC TTT GTC TGG CGC CTC GAC AAC GAC GGC AAG GAG GCG TTG 428Phe Glu Gly Phe Val Trp Arg Leu Asp Asn Asp Gly Lys Glu Ala Leu25 30 35CCG CGT AAT TTC CGC ACG TCG GCT GAC GCG CTG CGC GCG CCG GAG AAG 476Pro Arg Asn Phe Arg Thr Ser Ala Asp Ala Leu Arg Ala Pro Glu Lys40 45 50 55AAA TTC CAT CTC GAC GCC GCG TAT GTA CCG TCG CGC GAG GGC ATG GAT 524Lys Phe His Leu Asp Ala Ala Tyr Val Pro Ser Arg Glu Gly Met Asp60 65 70GCA CTC CAT ATC TCG GGC AGT TCC GCA TTC ACG CCG GCG CAG CTC AAG 572Ala Leu His Ile Ser Gly Ser Ser Ala Phe Thr Pro Ala Gln Leu Lys75 80 85AAC GTT GCC GCG AAG CTG CGG GAG AAG ACG GCT GGC CCC ATC TAC GAT 620Asn Val Ala Ala Lys Leu Arg Glu Lys Thr Ala Gly Pro Ile Tyr Asp90 95 100GTC GAC CTA CGG CAG GAG TCG CAC GGC TAT CTC GAC GGT ATC CCC GTG 668Val Asp Leu Arg Gln Glu Ser His Gly Tyr Leu Asp Gly Ile Pro Val105 110 115AGC TGG TAC GGC GAG CGC GAC TGG GCA AAT CTC GGC AAG AGC CAG CAT 716Ser Trp Tyr Gly Glu Arg Asp Trp Ala Asn Leu Gly Lys Ser Gln His120 125 130 135GAG GCG CTC GCC GAC GAG CGG CAC CGC TTG CAC GCA GCG CTC CAT AAG 764Glu Ala Leu Ala Asp Glu Arg His Arg Leu His Ala Ala Leu His Lys140 145 150ACG GTC TAC ATC GCG CCG CTC GGC AAG CAC AAG CTC CCC GAG GGC GGC 812Thr Val Tyr Ile Ala Pro Leu Gly Lys His Lys Leu Pro Glu Gly Gly155 160 165GAA GTC CGC CGC GTA CAG AAG GTG CAG ACG GAA CAG GAA GTC GCC GAG 860Glu Val Arg Arg Val Gln Lys Val Gln Thr Glu Gln Glu Val Ala Glu170 175 180GCC GCG GGG ATG CGC TAT TTC CGC ATC GCG GCG ACG GAT CAT GTC TGG 908Ala Ala Gly Met Arg Tyr Phe Arg Ile Ala Ala Thr Asp His Val Trp185 190 195CCA ACG CCG GAG AAC ATC GAC CGC TTC CTC GCG TTT TAC CGC ACG CTG 956Pro Thr Pro Glu Asn Ile Asp Arg Phe Leu Ala Phe Tyr Arg Thr Leu200 205 210 215CCG CAG GAT GCG TGG CTC CAT TTC CAT TGT GAA GCC GGT GTC GGC CGC 1004Pro Gln Asp Ala Trp Leu His Phe His Cys Glu Ala Gly Val Gly Arg220 225 230ACG ACG GCG TTC ATG GTC ATG ACG GAT ATG CTG AAG AAC CCG TCC GTA 1052Thr Thr Ala Phe Met Val Met Thr Asp Met Leu Lys Asn Pro Ser Val235 240 245TCG CTC AAG GAC ATC CTC TAT CGC CAG CAC GAG ATC GGC GGC TTT TAC 1100Ser Leu Lys Asp Ile Leu Tyr Arg Gln His Glu Ile Gly Gly Phe Tyr250 255 260TAC GGG GAG TTC CCC ATC AAG ACG AAG GAT AAA GAT AGC TGG AAG ACG 1148Tyr Gly Glu Phe Pro Ile Lys Thr Lys Asp Lys Asp Ser Trp Lys Thr265 270 275AAA TAT TAT AGG GAA AAG ATC GTG ATG ATC GAG CAG TTC TAC CGC TAT 1196Lys Tyr Tyr Arg Glu Lys Ile Val Met Ile Glu Gln Phe Tyr Arg Tyr280 285 290 295GTG CAG GAG AAC CGC GCG GAT GGC TAC CAG ACG CCG TGG TCG GTC TGG 1244Val Gln Glu Asn Arg Ala Asp Gly Tyr Gln Thr Pro Trp Ser Val Trp300 305 310CTC AAG AGC CAT CCG GCG AAG GCG TAAAAGCGCA GGCGGCGGCT CGGAGTCAGG 1298Leu Lys Ser His Pro Ala Lys Ala315GAAATGGCGC TGCCAGCACG GGACGCGCGG CGGCGGATGC TGCGCCGGTC AGGGATGATT 1358GACGACAGCC AGAGAAGAAA GGATGGTTTT ATGAGGTGGA TCC 1401(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度346個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Met Lys Tyr Trp Gln Lys His Ala Val Leu Cys Ser Leu Leu Val Gly-27 -25 -20 -15Ala Ser Leu Trp Ile Leu Pro Gln Ala Asp Ala Ala Lys Ala Pro Glu-10 -51 5Gln Thr Val Thr Glu Pro Val Gly Ser Tyr Ala Arg Ala Glu Arg Pro10 15 20Gln Asp Phe Glu Gly Phe Val Trp Arg Leu Asp Ash Asp Gly Lys Glu25 30 35Ala Leu Pro Arg Asn Phe Arg Thr Ser Ala Asp Ala Leu Arg Ala Pro40 45 50Glu Lys Lys Phe His Leu Asp Ala Ala Tyr Val Pro Ser Arg Glu Gly55 60 65Met Asp Ala Leu His Ile Ser Gly Ser Ser Ala Phe Thr Pro Ala Gln70 75 80 85Leu Lys Asn Val Ala Ala Lys Leu Arg Glu Lys Thr Ala Gly Pro Ile90 95 100Tyr Asp Val Asp Leu Arg Gln Glu Ser His Gly Tyr Leu Asp Gly Ile105 110 115Pro Val Ser Trp Tyr Gly Glu Arg Asp Trp Ala Asn Leu Gly Lys Ser120 125 130Gln His Glu Ala Leu Ala Asp Glu Arg His Arg Leu His Ala Ala Leu135 140 145His Lys Thr Val Tyr Ile Ala Pro Leu Gly Lys His Lys Leu Pro Glu150 155 160 165Gly Gly Glu Val Arg Arg Val Gln Lys Val Gln Thr Glu Gln Glu Val170 175 180Ala Glu Ala Ala Gly Met Arg Tyr Phe Arg Ile Ala Ala Thr Asp His185 190 195Val Trp Pro Thr Pro Glu Asn Ile Asp Arg Phe Leu Ala Phe Tyr Arg200 205 210Thr Leu Pro Gln Asp Ala Trp Leu His Phe His Cys Glu Ala Gly Val215 220 225Gly Arg Thr Thr Ala Phe Met Val Met Thr Asp Met Leu Lys Asn Pro230 235 240 245Ser Val Ser Leu Lys Asp Ile Leu Tyr Arg Gln His Glu Ile Gly Gly250 255 260Phe Tyr Tyr Gly Glu Phe Pro Ile Lys Thr Lys Asp Lys Asp Ser Trp265 270 275Lys Thr Lys Tyr Tyr Arg Glu Lys Ile Val Met Ile Glu Gln Phe Tyr280 285 290Arg Tyr Val Gln Glu Ash Arg Ala Asp Gly Tyr Gln Thr Pro Trp Ser295 300 305Val Trp Leu Lys Ser His Pro Ala Lys Ala310 315(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ⅱ)分子類型其他核苷酸(A)描述/desc=“寡核苷酸SrPr6”(ⅲ)推斷的不是(ⅳ)反義的不是(ⅵ)最初出處(A)生物反芻月形單胞菌(B)株JY35(ⅶ)最近出處(A)文庫(kù)基因組DNA文庫(kù)(B)克隆pSrP.2(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:CGGGATGCTT CTGCCAGTAT20(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ⅱ)分子類型其他核苷酸(A)描述/desc=“寡核苷酸SrPf6”(ⅲ)推斷的不是(ⅳ)反義的不是(ⅵ)最初出處(A)生物反芻月形單胞菌(B)株JY35(ⅶ)最近出處(A)文庫(kù)基因組DNA文庫(kù)(B)克隆pSrP.2
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:CGTCCACGGA GTCACCCTAC 20(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅱ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ⅱ)分子類型其他核苷酸(A)描述/desc=“寡核苷酸MATE2”(ⅲ)推斷的不是(ⅳ)反義的不是(ⅵ)最初出處(A)生物反芻月形單胞菌(B)株JY35(ⅶ)最近出處(A)文庫(kù)基因組DNA文庫(kù)(B)克隆pSrP.2(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:GCGAATTCAT GGCCAAGGCG CCGGAGCAGA C31(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ⅱ)分子類型其他核苷酸(A)描述/desc=“寡核苷酸MATE”(ⅲ)推斷的不是
(ⅳ)反義的不是(ⅵ)最初出處(A)生物反芻月形單胞菌(B)株JY35(ⅶ)最近出處(A)文庫(kù)基因組DNA文庫(kù)(B)克隆pSrP.2(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:GCGAATTCGC CAAGGCGCCG GAGCAGAC28(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ⅱ)分子類型其他核苷酸(A)描述/desc=“寡核苷酸MATN”(ⅲ)推斷的不是(ⅳ)反義的不是(ⅵ)最初出處(A)生物反芻月形單胞菌(B)株JY35(ⅶ)最近出處(A)文庫(kù)基因組DNA文庫(kù)(B)克隆pSrP.2(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:GAGGATCCAT GGCCAAGGCG CCGGAGCAGA C3權(quán)利要求
1．純化和分離的DNA，它編碼反芻微生物肌醇六磷酸酶。
2．權(quán)利要求1的純化和分離的DNA，其中的反芻微生物是一種原核生物。
3．權(quán)利要求1純化和分離的DNA，其中的反芻微生物可以是月形單胞菌屬、普雷沃氏菌屬、密螺旋體屬或巨球形菌屬。
4．權(quán)利要求1純化和分離的DNA，其中的反芻微生物可以是反芻月形單胞菌，棲瘤胃普雷沃氏菌，布氏密螺旋體或埃氏巨球形菌。
5．權(quán)利要求1純化和分離的DNA，其中的反芻微生物是反芻月形單胞菌。
6．權(quán)利要求1純化和分離的DNA，其中的反芻微生物是反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)。
7．權(quán)利要求1純化和分離的DNA，該DNA能夠與包括SEQ ID NO.1核苷酸序列中至少連續(xù)25個(gè)核苷酸的探針在嚴(yán)格條件下雜交。
8．權(quán)利要求1純化和分離的DNA，該肌醇六磷酸酶包含有SEQ IDNO.2的氨基酸序列。
9．權(quán)利要求1純化和分離的DNA，該DNA包含有SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
10．權(quán)利要求1純化和分離的DNA，該DNA包含有SEQ ID NO.1的312-1268位核苷酸。
11．權(quán)利要求1純化和分離的DNA，其中所編碼的肌醇六磷酸酶具有以下特征a)其分子量為37kDa；b)在pH3.0-6.0之間，有活性；且c)在4-55℃溫度范圍，有活性。
12．權(quán)利要求11純化和分離的DNA，其中所編碼的肌醇六磷酸酶在約20-55℃時(shí)有活性。
13．權(quán)利要求11純化和分離的DNA，其中所編碼的肌醇六磷酸酶在約35-40℃時(shí)有活性。
14．權(quán)利要求11純化和分離的DNA，其中所編碼的肌醇六磷酸酶還有以下特征d)測(cè)量釋放無(wú)機(jī)磷酸的量表明，其比活性比源自無(wú)花果曲霉NRRI3135的肌醇六磷酸酶活性高至少兩倍。
15．能夠在合適的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)肌醇六磷酸酶表達(dá)的表達(dá)構(gòu)建體，該表達(dá)構(gòu)建體包含有編碼反芻微生物肌醇六磷酸酶的DNA，此DNA與能與宿主相容的控制序列可操縱地連在一起。
16．權(quán)利要求15的表達(dá)構(gòu)建體，其中的反芻微生物為反芻月形單胞菌。
17．權(quán)利要求15的表達(dá)構(gòu)建體，其中所編碼的肌醇六磷酸酶包含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
18．轉(zhuǎn)化有編碼反芻微生物肌醇六磷酸酶的DNA的宿主細(xì)胞，因而這個(gè)宿主細(xì)胞可以表達(dá)該DNA編碼的肌醇六磷酸酶。
19．權(quán)利要求18中轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中的反芻微生物為反芻月形單胞菌。
20．權(quán)利要求18的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所編碼的肌醇六磷酸酶包含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
21．權(quán)利要求18的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中的宿主細(xì)胞為真核生物。
22．權(quán)利要求18轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中的宿主細(xì)胞為原核生物。
23．權(quán)利要求18轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中的宿主細(xì)胞為巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。
24．權(quán)利要求18的宿主細(xì)胞，其中的宿主細(xì)胞為枯草芽孢桿菌細(xì)胞。
25．權(quán)利要求18的宿主細(xì)胞，其中的宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。
26．反芻月形單胞菌JY35(ATCC 55785)。
27．轉(zhuǎn)化了編碼反芻微生物肌醇六磷酸酶DNA的轉(zhuǎn)基因植物，從而由該DNA所編碼的肌醇六磷酸酶可由此植物表達(dá)。
28．權(quán)利要求27的轉(zhuǎn)基因植物，其中的反芻微生物為反芻月形單胞菌。
29．權(quán)利要求27的轉(zhuǎn)基因植物，其中所編碼的肌醇六磷酸酶包含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
30．一種反芻微生物肌醇六磷酸酶。
31．權(quán)利要求30的肌醇六磷酸酶，其中的反芻微生物為反芻月形單胞菌。
32．權(quán)利要求30的肌醇六磷酸酶具有以下特征a)分子量為37kDa；b)在pH3.0-6.0有活性；且c)在約4-55℃溫度有活性。
33．權(quán)利要求32的肌醇六磷酸酶還具有以下特征d)測(cè)量釋放的無(wú)機(jī)磷酸表明其比活性比無(wú)花果曲霉NRRI 3135肌醇六磷酸酶活性高至少兩倍。
34．權(quán)利要求30的肌醇六磷酸酶，包含有氨基酸序列SEQ ID NO.2內(nèi)的連續(xù)氨基酸殘基。
35．權(quán)利要求30的肌醇六磷酸酶，包含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
36．一種飼料組合物，包含有一種由反芻微生物肌醇六磷酸酶處理的飼料營(yíng)養(yǎng)成分。
37．權(quán)利要求36的飼料組合物，其中的反芻微生物為反芻月形單胞菌。
38．權(quán)利要求36的飼料組合物，其中的肌醇六磷酸酶包含有SEQ IDNO.2的氨基酸序列。
39．權(quán)利要求36的飼料組合物，包含有足夠量的肌醇六磷酸酶，每千克飼料組合物可提供高達(dá)約2000單位(釋放磷酸的μmol數(shù)/分鐘)的肌醇六磷酸酶活性。
40．權(quán)利要求36的飼料組合物，包含有足夠量的肌醇六磷酸酶活性，每千克飼料組合物可提供高達(dá)約1000單位的肌醇六磷酸酶活性。
41．權(quán)利要求36的飼料組合物，包含有足夠數(shù)量的肌醇六磷酸酶，每千克飼料組合物可提供約50-800單位的肌醇六磷酸酶活性。
42．權(quán)利要求36的飼料組合物，包含有足夠數(shù)量的肌醇六磷酸酶，每千克飼料組合物可提供約300-800單位的肌醇六磷酸酶活性。
43．一種飼料添加劑，包含有冷凍干燥微生物制品，該微生物在正常生長(zhǎng)條件下表達(dá)反芻微生物肌醇六磷酸酶。
44．權(quán)利要求43的飼料添加劑，其中所述的微生物為反芻月形單胞菌。
45．權(quán)利要求43的飼料添加劑，其中的微生物是轉(zhuǎn)化有編碼反芻微生物肌醇六磷酸酶DNA的重組微生物。
46．權(quán)利要求45的飼料添加劑，其中的反芻微生物為反芻月形單胞菌。
47．權(quán)利要求45的飼料添加劑，其中表達(dá)的肌醇六磷酸酶包含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
48．處理飼料營(yíng)養(yǎng)成分的飼料添加劑，該飼料添加劑包含有一種反芻微生物肌醇六磷酸酶。
49．權(quán)利要求48的飼料添加劑，其中的微生物為反芻月形單胞菌。
50．權(quán)利要求48的飼料添加劑，其中的肌醇六磷酸酶包含有SEQ IDNO.2的氨基酸序列。
51．生產(chǎn)肌醇六磷酸酶的方法，包括a)將編碼反芻微生物肌醇六磷酸酶的DNA轉(zhuǎn)化到至少一種宿主細(xì)胞，因而此宿主細(xì)胞能表達(dá)該肌醇六磷酸酶；并且b)在有助于宿主細(xì)胞表達(dá)該肌醇六磷酸酶的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞。
52．權(quán)利要求51的方法，進(jìn)一步包括以下步驟c)從培養(yǎng)物中提取該肌醇六磷酸酶。
53．權(quán)利要求51的方法，其中的反芻微生物為反芻月形單胞菌。
54．權(quán)利要求51的方法，其中的肌醇六磷酸酶包含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
55．生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括a)將編碼一種反芻微生物肌醇六磷酸酶的DNA轉(zhuǎn)化到植物中，因而此植物可表達(dá)該肌醇六磷酸酶；并且b)在有助于此植物表達(dá)該肌醇六磷酸酶的條件下培養(yǎng)該植物。
56．權(quán)利要求55的方法，其中的反芻微生物為反芻月形單胞菌。
57．權(quán)利要求55的方法，其中的肌醇六磷酸酶包含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
58．改善動(dòng)物飼料中肌醇六磷酸鹽利用狀況的方法，包括在飼喂動(dòng)物的飲食中包含有效量的反芻微生物肌醇六磷酸酶。
59．權(quán)利要求58的方法，其中的反芻微生物是反芻月形單胞菌。
60．權(quán)利要求58的方法，其中的肌醇六磷酸酶包含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
61．權(quán)利要求58的方法，其中的飲食包括飲用水并且該肌醇六磷酸酶包含于飲用水中。
62．權(quán)利要求58的方法，其中的肌醇六磷酸酶以礦物塊形式提供以供動(dòng)物消耗。
63．權(quán)利要求58的方法，其中的肌醇六磷酸酶以藥丸的形式提供以供動(dòng)物消耗。
64．權(quán)利要求58的方法，其中的肌醇六磷酸酶以凝膠制劑的形式提供以供動(dòng)物消耗。
65．權(quán)利要求58的方法，其中的肌醇六磷酸酶可以液體制劑噴灑于飼料中以供動(dòng)物消耗。
66．權(quán)利要求58的方法，其中的肌醇六磷酸酶可以飼料丸的形式提供以供動(dòng)物消耗。
67．權(quán)利要求58的方法，其中供動(dòng)物消耗的飼料以冷凍干燥的微生物制劑處理，該微生物在正常生長(zhǎng)條件下可表達(dá)該肌醇六磷酸酶。
68．測(cè)定微生物肌醇六磷酸酶活性的方法，包括以下步驟a)提供一種已長(zhǎng)有微生物克隆的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包含有一種肌醇六磷酸鹽源；b)以氯化鈷水溶液處理該培養(yǎng)基；并且c)在該培養(yǎng)基上檢測(cè)透明區(qū)，由此可消除由微生物產(chǎn)生的酸引起的假陽(yáng)性。
69．權(quán)利要求68的方法，經(jīng)過(guò)步驟(b)后，以一種鉬酸銨水溶液和一種礬酸銨水溶液處理該培養(yǎng)基。
70．權(quán)利要求68的方法，其中培養(yǎng)基需要以氯化鈷水溶液處理至少約5分鐘。
71．權(quán)利要求68的方法，其中培養(yǎng)基以鉬酸銨水溶液和礬酸銨水溶液處理至少約5分鐘。
72．權(quán)利要求68的方法，其中培養(yǎng)基以鉬酸銨水溶液和礬酸銨水溶液同時(shí)處理。
73．權(quán)利要求68的方法，其中氯化鈷水溶液的濃度約為2％(重量/體積)。
74．權(quán)利要求69的方法，其中鉬酸銨水溶液的濃度約為6％(重量/體積)并且礬酸銨水溶液的濃度約為0.5％(重量/體積)。
75．鑒定生物體核酸分子的方法，該核酸分子編碼一種肌醇六磷酸酶，該方法包括以下幾步a)從該生物體中分離核酸分子；b)在中等至高嚴(yán)格條件下，在核酸分子中和標(biāo)記探針之間進(jìn)行核酸雜交并標(biāo)記雜交探針，該探針具有包含有SEQ ID NO.1的至少25個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。
76．權(quán)利要求75的方法，其中的雜交條件為中等嚴(yán)格條件。
77．權(quán)利要求75的方法，其中的雜交條件為高度嚴(yán)格條件。
全文摘要
提供了源于反芻微生物的肌醇六磷酸酶。此肌醇六磷酸酶能夠催化劑醇六磷酸釋放無(wú)機(jī)磷。優(yōu)選的肌醇六磷酸酶源包括月形單胞菌屬(Selenomonas),普雷沃氏菌屬(Prevotella),密螺旋體屬(Treponema)和巨球形菌屬(Megasphaera)。本發(fā)明提供了一個(gè)純化的、分離的DNA,它編碼源于反芻月形單胞菌JY35(Selenomonas ruminantiumJY35)(ATCC55785)的肌醇六磷酸酶。也提供了包含編碼該肌醇六磷酸酶DNA的重組表達(dá)載體及轉(zhuǎn)化了編碼該肌醇六磷酸酶DNA的宿主細(xì)胞。此肌醇六磷酸酶可用于廣泛的涉及肌醇六磷酸鹽脫磷酸作用的應(yīng)用,其它的情形包括用于動(dòng)物飼料添加劑。
文檔編號(hào)A01H5/00GK1222195SQ97195483
公開日1999年7月7日 申請(qǐng)日期1997年6月13日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月13日
發(fā)明者K·J·程, L·B·瑟林格, L·J·楊克, H·D·貝, L·周, C·W·福爾斯伯格 申請(qǐng)人:加拿大農(nóng)業(yè)及農(nóng)業(yè)食品部