專利名稱：利用遠緣雜交和孤雌生殖生產(chǎn)玉米雜交種子的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)玉米雜交種子的方法，具體地說，本發(fā)明涉及利用遠緣雜交和孤雌生殖生產(chǎn)玉米雜交種子的方法。
在玉米育種上的主要問題是種質(zhì)遺傳基礎狹窄。長期以來，國內(nèi)外玉米育種一直沿用品種間雜交和系統(tǒng)選育方法，親緣關系近，不能解決遺傳基礎貧乏，育種工作的水平和進展受到很大局限。為了種質(zhì)遺傳基礎的拓寬并創(chuàng)造新種質(zhì)資源，提高育種水平，許多遺傳育種學家都把注意力集中在野生資源的開發(fā)利用上。通過遠緣雜交途徑將野生近緣種屬的有經(jīng)濟價值的基因導入栽培玉米，以創(chuàng)造出遺傳多樣性的新種質(zhì)。
玉米遠緣雜交育種方法是以玉米作母本，以近緣種屬作父本進行雜交。雜交時將父本花粉授在母本的花絲上。第2年將雜種一代(F1)植株與玉米回交獲得回交一代(BC1)。第3年從BC1中選優(yōu)良單株與玉米回交獲得回交二代(BC2)。直至第8至10年，甚至更長時間如此連續(xù)進行回交下去。在回交過程中，也可采用回交與自交交替進行。
利用這種方法結實率很低，以二倍體多年生大芻草為例，一般情況每個果穗結實在10粒以下或更低，甚至不結實。再者，其遠緣雜種后代長期瘋狂分離不能穩(wěn)定。自70年代以來，中外遺傳育種學家就開展了玉米遠緣雜交育種研究，一直采用這種常規(guī)的經(jīng)典的連續(xù)多代回交方法，或自交與回交交替等方法，以至經(jīng)過連續(xù)回交8代以上，甚至更多世代仍不能得到穩(wěn)定后代，用此方法至今尚未獲得遺傳性穩(wěn)定的在育種上利用的優(yōu)良異源種質(zhì)純系(Petrov 1976，InS.S.khokhlov，Apomixis and Breeding，pp18-28，Amerind publishing co.pvt，ltd，New Delhi；Zhelegnova 1976，Tr.-Biol.-in-ta.-sib.-otd.-AN-SSSR.No.30.109-115；Magoja等1994 InBiotechnology inAgricuture and Forestry.Vol.25，maize(ed.by Y.P.S.Bajaj)springer-verlag BerlinHeidelberg；牛應峰等1993四川農(nóng)業(yè)大學學報，11(4)579-584和賴仲銘等1991中國的遺傳學研究，中國科學出版社，P.85-87.)。為此，必須尋找新的途徑。
本發(fā)明的目的是提供一種利用遠緣雜交和孤雌生殖生產(chǎn)玉米雜交種子的方法。
現(xiàn)有技術中誘導玉米孤雌生殖的方法有(1)生物學因素誘導，它包括品種間和遠緣雜交法，延遲授粉法，異源細胞質(zhì)法，雙生苗分選法等；(2)物理學因素誘導，它包括射線照射(X射線，r射線，紫外線等)，熱中子流輻射，溫度處理等；(3)化學因素誘導，它包括生長素類，激素類，誘變劑類和其他類化學物質(zhì)。其處理方法有兩種，一種是藥物處理與授粉相結合，另一種是單獨藥物處理。
過去玉米的孤雌生殖誘導，主要是通過生物學因素，如品種間雜交和遠緣雜交法，延遲授粉法，異源細胞質(zhì)法和雙生苗選擇法等，物理學因素，如X或r射線照射，紫外線照射，熱中子流輻射，溫度處理等，化學因素，如化學藥劑處理花粉結合授粉等，這些方法所獲得的孤雌生殖為單倍體，其誘導頻率低，所用材料均為自交系或品種間雜交種(Chase 1969，Bot，Rev.35(2)117-167；1974，Advances and potential(Ed.K.Kasha)univ.of Guelph.Guelph，ontario，canada，P.2 11-230；Deanon 1957 philipp.Agric.41364-377)。
單獨使用化學藥物誘導孤雌生殖的研究在棉花、番茄、黃瓜、黑穗狀醋栗等植物上有報道。但在80年代以前，主要糧食作物之一的玉米尚未有這方面的研究。
我們實驗室自80年代初以來，首先開展了化學藥物誘導玉米孤雌生殖技術的研究，其目的在于誘導玉米孤雌生殖單倍體，經(jīng)加倍得到純合二倍體，這種方法對雜種優(yōu)勢強的作物玉米的育種是一條快捷的新途徑。
本發(fā)明的利用遠緣雜交和孤雌生殖生產(chǎn)玉米雜交種子的方法包括以下步驟(1)以玉米作母本，以二倍體大芻草作父本，將父本于抽穗前進行暗處理25-30天，在授粉前花絲吐出后在靠近果穗頂部剪去花絲，或剪掉果穗軸頂尖0.1-0.5公分及花絲，1-3天后，當花絲再長出0.5-1.5公分時授粉，得到雜種F1；(2)以玉米作母本，以遠緣雜種F1作父本進行回交獲得回交一代(BC1)；
(3)在BC1植株群中選玉米型的優(yōu)良植株進行如下處理果穗吐絲后4-6天，在距果穗軸頂部0.0-0.5厘米處剪掉花絲，于次日或當天花絲長至1.0-2.0公分左右時將含有2-4％二甲基亞砜和30-50ppm馬來酰胼MS水溶液噴霧在花絲上，得到孤雌生殖純合二倍體種子(Pa1)；(3)從孤雌生殖一代(Pa1)植株群體中對單株的抗性，綜合農(nóng)藝性狀進行鑒定，評選出若干優(yōu)良單株，其植株結實的種子為Pa2；(4)從孤雌生殖二代(Pa2)株系中對株系的遺傳穩(wěn)定性，綜合農(nóng)藝性狀，抗性等鑒定，評選出優(yōu)良純系，并同時配制測交組合，得到玉米雜交種子。
上述方法中的二倍體大芻草可以是二倍體多年生大芻草。
上述方法中，第2步驟的剪花絲的時間以上午8時以前為佳，主要防止空氣中花粉污染；噴霧藥液時間以下午7時以后為佳，其一是為了避免溫度過高，減少藥液過快蒸發(fā)，其二防止空氣中花粉污染。
上述方法中，第2步驟的組成為2-4％二甲基亞砜+30-40ppm馬來酰胼MS水溶液中加入500-700ppm PEG(6000)，其誘導孤雌生殖結實效果提高；在該藥液中加入500-700ppm PEG(6000)+2-4％Tween20，其誘導孤雌生殖結實效果更佳。
上述方法中，第2步驟的藥液噴霧若連續(xù)兩天內(nèi)噴霧兩次效果更好。
單獨化學藥物誘導孤雌生殖的優(yōu)點是，它不需要授粉者的花粉或雄配子的刺激參與受精，僅靠藥物誘發(fā)產(chǎn)生單性生殖，這就免去了上面所述的生物因素，以及其授粉結合的物理因素和藥物誘導等多種方法處理后，必須從雜種中挑選單倍體或純合二倍體進行鑒別，選擇等程序，大大簡化了孤雌生殖誘導的手續(xù)，和節(jié)省了大量的工作量。
用本發(fā)明的化學藥物誘導玉米孤雌生殖方法處理未授粉的玉米自交系、改良種、農(nóng)家種、雜交種，均獲得比以往的孤雌方法更好的效果，其誘導孤雌生殖結實率按處理小花計算平均為0.193％，最高達到0.456％，自然孤雌生殖結實率為0.0005％。
如上所述其他方法誘導的孤雌生殖為單倍體，而我們的藥物誘導玉米孤雌生殖技術的突出優(yōu)點是，這一方法誘導孤雌生殖直接產(chǎn)生純合二倍體，而不是單倍體，這就逾越了玉米單倍體加倍困難的障礙。
80年代以來我們將經(jīng)過改進的化學藥物誘導孤雌生殖產(chǎn)生純合二倍體技術應用于玉米與二倍體多年生大芻草的遠緣雜交育種上，獲得了很好的效果。關于二倍體多年生大芻草與玉米的親緣關系，有學者認為是同一屬的兩個種，另一些學者認為是兩個不同的屬，至今尚無定論。在玉米遠緣雜交育種中應用化學藥物誘導孤雌生殖技術，迄今國內(nèi)外尚無這方面的研究。通過多年的育種實踐證明，化學藥物誘導孤雌生殖技術用于玉米遠緣雜交育種，提高了結實頻率，克服了雜種后代長期瘋狂分離不穩(wěn)定的老大難問題，使之在早代(Pa2)遺傳性穩(wěn)定下來。迄今我們已先后選用不同遺傳背景的不同生態(tài)型玉米作母本與二倍體多年生大芻草作父本雜交的遠緣雜種BC1作誘導孤雌生殖的供體親本，均能在其孤雌生殖早代(Pa2)獲得遺傳性穩(wěn)定的純系，這表明該方法具有高度重復性?，F(xiàn)在我們已經(jīng)選育出一批優(yōu)異的異源種質(zhì)純系，如，540，540優(yōu)，445A，515A，pt101，pt103，中1575，中1580等。它們已配制出優(yōu)良雜交種，有的如遺單6號品種(5003×540)已通過審定在生產(chǎn)上推廣，有的如540×H21，1302×540，1302×445A，8112×515A等雜交種正在參加省級區(qū)試，表現(xiàn)良好。還有一批優(yōu)良雜交種正在各地進行適應性試驗，試種、示范。除此，還創(chuàng)造出一大批具有經(jīng)濟價值的新種質(zhì)資源。玉米遠緣雜交育種方法選育的孤雌純系540等及其配制的遠緣雜交品種遺單6號等屬于我們首創(chuàng)。
實施例實施例1全部試驗在北京中科院遺傳所試驗場進行。
我們于1985年以玉米自交系330為母本，以二倍體多年生大芻草為父本進行雜交。于抽穗前，在7月上旬至8月上旬進行遮光暗處理，從下午4時遮光至次日上午9時打開。母本于6月6-15日分兩期播種，父本于4月初播種溫室，于5月20日前后移栽大田。當8月下旬母本花絲抽出，用剪刀齊果穗軸頂部剪掉花絲。待花絲再長出1.0公分左右授粉，雜交果穗5個，得到雜交種子(F1)143粒，平均每穗結實28.6粒。
第二年4月25日播種F1種子。以F1植株為父本，以自交系330為母本，于8月中、下旬開花抽絲期進行雜交，回交果穗6個，得到回交一代(BC1)種子573粒，平均每穗結實95.5粒；第三年4月25-26日播種BC1種子。從BC1植株群體中選玉米型生長勢強、健壯、優(yōu)良植株386株進行孤雌生殖處理，直接生產(chǎn)純合二倍體種子(Pa1)，處理方法如下果穗抽絲4天后，于上午7時半齊果穗軸頂部剪掉花絲，于次日花絲再長出1.0公分左右時，于下午7時半將藥液噴霧在花絲上；處理1藥液組成為2％二甲基亞砜+40ppm馬來酰胼MS水溶液，處理果穗242個，結實34粒，每穗平均為0.141粒；處理2藥液組成為處理1藥液中加入600ppm PEG(6000)，處理果穗144個，結實43粒，每穗平均為0.299粒；第2處理比第1處理提高結實率1.1倍，得到孤雌生殖種子77粒(Pa1)。
1988年將孤雌生殖Pa1種子于4月26日播種。從74株Pa1植株群體中鑒定評選出植株生長勢強、抗逆性強、抗病、抗倒伏，株型緊湊，果穗大，穗位適中，籽粒品質(zhì)好，單株生產(chǎn)潛力大等綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的單株31株，其收獲種子為Pa2。
1989年將孤雌生殖Pa2種子于4月26日按株系播種。從Pa2株系群中，按株系植株的整齊一致鑒定評選其純度高和遺傳性穩(wěn)定，以及綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良(與上述標準同)株系，從其中評選出優(yōu)良純系540等，并同時將純系540配制測交組合。
以后按常規(guī)程序經(jīng)測交鑒定、品比等試驗中選育出優(yōu)良雜交種遺單6號(5003×540)，其特點是抗大、小斑病，抗倒伏、抗旱耐澇、不早衰，果穗粗而長，品質(zhì)好，適宜糧飼兼用，已通過審定在生產(chǎn)應用，科試7號(H21×540)已通過區(qū)試待審定。實施例2我們于1987年以玉米自交系旅9為母本，以二倍體多年大芻草為父本進行雜交。母本于6月6-15日分兩期播種，父本于4月初播種溫室，于5月20日前后移栽大田。暗處理同實施例1。當8月下旬母本花絲抽出，用剪刀將果穗軸頂部0.3公分及花絲剪掉。待花絲再長出1.0公分左右授粉，雜交果穗4個，得到雜交種子(F1)156粒，平均每穗結實39粒。
1988年4月27日播種F1種子。以F1植株為父本，以自交系旅9為母本，于8月中下旬開花抽絲期進行雜交，回交果穗5個，得到回交一代(BC1)種子634粒，平均每穗結實126.8粒。
1989年將BC1種子于4月26-28日播種。從BC1植株群體中選玉米型生長勢強、健壯、優(yōu)良植株415株進行孤雌生殖處理，直接生產(chǎn)純合二倍體種子(Pa1)。處理方法如下果穗抽絲5天后，于上午7時齊果穗頂端剪掉花絲。于次日花絲再長出1.0公分左右時，于下午7時半將藥液噴霧在花絲上。
處理藥液組成為2％二甲基亞砜+40ppm馬來酰胼+600ppmPEG(6000)MS水溶液，處理果穗356個，結實110粒，每穗平均為0.309粒。
1990年將Pa1種子于4月26日播種。從103株Pa1植株群體中鑒定評選出優(yōu)良單株46株，其收獲種子為Pa2。其鑒定評選內(nèi)容，標準與實例1相同。
1991年將Pa2種子于4月28日按株系播種。從Pa2株系群中，按實例1相同內(nèi)容，標準鑒定評選優(yōu)良株系，從其中評選出優(yōu)良純系，并命名為445A，515A，并同時將純系445A，515A純系配制測交組合。
以后按常規(guī)程序經(jīng)測交，鑒定，品比等試驗中選育出優(yōu)良雜交種科試12(1302×445A)和科試18(C9×515A)正在參加省級區(qū)試。實施例3我們于1990年以玉米單交種中單120為母本，以二倍體多年生大芻草為父本進行雜交。母本于6月6-15日分兩期播種，父本于4月初播種溫室，于5月20日前后移栽大田。暗處理同實施例1。當8月下旬母本花絲抽出，用剪刀齊果穗軸頂部剪掉花絲。待花絲再長出1.0公分左右授粉。雜交果穗5個，得到雜交種子(F1)215粒，平均每穗結實43粒。
1991年4月28日播種F1種子。以F1植株為父本，以單交種中單120為母本，于8月中、下旬開花抽絲期進行雜交?；亟还?個，得到回交一代(BC1)種子814粒，平均每穗結實162.8粒。
1992年將BC1種子于4月26-29日播種。從BC1植株群體中選玉米型生長勢強、健壯、優(yōu)良植株531株進行孤雌生殖處理，直接生產(chǎn)純合二倍體種子(Pa1)。處理方法如下果穗抽絲4天后，于上午7時齊果穗頂端剪掉花絲，于次日花絲再長出1.0公分左右時，于下午7時半將藥液噴霧在花絲上。
處理藥液組成為2％二甲基亞砜+40ppm馬來酰胼+600ppmPEG(6000)+2％Tween20 MS水溶液。處理果穗436個，結實167粒，平均每穗為0.383粒。
1993年將Pa1種子于4月28日播種。從153株Pa1植株群體中鑒定評選出優(yōu)良單株61株，其收獲種子為Pa2。其鑒定評選內(nèi)容，標準與實例1相同。
1994年將Pa2種子于4月28日按株系播種。從Pa2株系群中，按實例1相同內(nèi)容，標準鑒定評選優(yōu)良株系，從中評選出優(yōu)良純系中1580等，并同時將純系中1580配制測交組合。
以后按常規(guī)程序正在進行測交、品比等試驗進行優(yōu)良雜交種的評選。
權利要求
1.一種利用遠緣雜交和孤雌生殖生產(chǎn)玉米雜交種子的方法，包括以下步驟(1)以玉米作母本，以二倍體大芻草作父本，將父本于抽穗前進行暗處理25-30天，在授粉前花絲吐出后在靠近果穗頂部剪去花絲，或剪掉果穗軸頂尖0.1-0.5公分及花絲，1-3天后，當花絲再長出0.5-1.5公分時授粉，得到雜種F1；(2)以玉米作母本，以遠緣雜種F1作父本進行回交獲得回交一代(BC1)；(3)在BC1植株群中選玉米型的優(yōu)良植株進行如下處理果穗吐絲后4-6天，在距果穗軸頂部0.0-0.5厘米處剪掉花絲，于次日或當天花絲長至1.0-2.0公分左右時將含有2-4％二甲基亞砜和30-50ppm馬來酰胼MS水溶液噴霧在花絲上，得到孤雌生殖純合二倍體種子(Pa1)；(3)從孤雌生殖一代(Pa1)植株群體中對單株的抗性，綜合農(nóng)藝性狀進行鑒定，評選出若干優(yōu)良單株，其植株結實的種子為Pa2；(4)從孤雌生殖二代(Pa2)株系中對株系的遺傳穩(wěn)定性，綜合農(nóng)藝性狀，抗性等鑒定，評選出優(yōu)良純系，并同時配制測交組合，得到玉米雜交種子。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的二倍體大芻草是二倍體多年生大芻草。
3.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，該方法第2步驟的剪花絲是在上午8時以前進行的。
4.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，該方法第2步驟的噴霧藥液是在下午7時以后進行的。
5.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，該方法第2步驟的含有2-4％二甲基亞砜和30-40ppm馬來酰胼的MS水溶液中加入了500-700ppm PEG(6000)。
6.按照權利要求5所述的方法，其特征在于，該藥液中還加入了2-4％Tween20。
7.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，該方法第2步驟的藥液噴霧是連續(xù)兩天內(nèi)噴霧兩次。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用遠緣雜交和孤雌生殖生產(chǎn)玉米雜交種子的方法。為克服現(xiàn)有技術中結實率低,雜種后代瘋狂分離等缺點,本發(fā)明將遠緣雜交和該良的孤雌生殖相結合生產(chǎn)玉米雜交種子。用本發(fā)明的方法已培育出多個優(yōu)良品種。
文檔編號A01H1/02GK1245636SQ9811762
公開日2000年3月1日 申請日期1998年8月24日 優(yōu)先權日1998年8月24日
發(fā)明者谷明光, 郭樂群, 楊太興, 何鍶潔, 張忠 申請人:中國科學院遺傳研究所