專利名稱：用于植物轉化的質粒和使用此質粒的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及農(nóng)桿菌介導的植物轉化，特別是用T-DNA進行的植物轉化，其中防止了非T-DNA載體序列的同時轉移。
領域背景通過使用農(nóng)桿菌和存在于野生型農(nóng)桿菌中的Ti或Ri質粒轉化植物的方法自1983年來就為人所知(如在EP 0 116 718和EP 0 120 516中)。此轉化方法一般包括用提供異源基因的非致瘤性農(nóng)桿菌菌株侵染植物。異源基因位于質粒上一段所謂的T-DNA中，T-DNA是位于兩個24堿基對長的不完全正向重復序列即T-DNA邊界之間的DNA。異源基因向植物中的轉移發(fā)生在通過農(nóng)桿菌和植物細胞的共培養(yǎng)而由酚化合物活化質粒定位的Vir基因的過程中。這些vir基因(D1和D2)在精確位點使邊界重復序列產(chǎn)生切口，由此T-DNA在T-DNA邊界處從質粒上切割下來并插入植物基因組中。
看來右邊界區(qū)在T-DNA轉移中最關鍵刪去T-DNA右邊界區(qū)的Ti質粒是無毒的(Holsters，M.等，質粒3，212-230，1980)。左邊界區(qū)的刪除對毒性無影響(Joos，H.等，細胞32，1057-1067，1983)。
當使用雙元載體系統(tǒng)進行轉化時，需要T-DNA邊界的存在，其中T-DNA位于分開的獨立復制子雙元載體上。
轉化后，T-DNA以單一單位或串聯(lián)排列的多拷貝存在于宿主植物基因組中。但是，還經(jīng)常發(fā)現(xiàn)截短的T-DNA區(qū)(Deroles S.C.和Gardner，R.C.，植物分子生物學，11，365-377，1988)。最近，有信息表明還有邊界外的DNA整合入宿主植物基因組中。據(jù)報道該現(xiàn)象發(fā)生在20％-30％的轉基因植物中(Martineau，B.等，植物細胞6，1032-1033，1994)。但是，最近，有文獻報道約75％的煙草轉化體含有載體“骨架”序列(Kononov，M.E.等，植物雜志11(5)，945-957，1997)。
另一有時發(fā)生的現(xiàn)象是T-DNA轉移在也作用為(弱)起始點的左邊界起始。于是“連讀”的DNA量可能變得豐富發(fā)現(xiàn)有時在左邊界起始的轉移連讀通過右邊界并再次終止于左邊界，導致全部雙元載體的轉移(Van der Graaff，E.等，植物分子生物學31，677-681，1996)。
由于只轉移存在于T-DNA中的DNA是植物遺傳學家的目標，因此防止兩個連讀機制是受歡迎的。而且，處理轉基因植物和/或轉基因食品(市場)注冊請求的注冊機構也認為轉基因植物載體DNA的污染應盡可能避免。
發(fā)明概述本發(fā)明包括包含具有側翼T-DNA邊界的T-DNA的植物轉化載體，其特征在于載體進一步包含可防止帶有比T-DNA序列更多的載體序列的植物轉化體形成的核酸序列。
可防止帶有比T-DNA序列更多的載體序列的轉化體形成的該序列是編碼毒性化合物的基因，優(yōu)選地選自RNA酶、DNA酶、植物毒素、白喉毒素、蛋白酶和反義管家基因如ATP合酶、細胞色素c、丙酮酸激酶、氨?；D移酶或者磷酸、二羧酸、三羧酸和2-氧代-戊二酸轉運蛋白。
上述載體的另一實施方案是防止帶有T-DNA序列外的載體序列的轉化體形成的序列包含結合DNA結合蛋白的序列或G+C含量高的序列。
通過用根據(jù)本發(fā)明所述的載體轉化植物獲得不含有T-DNA外的載體序列的轉基因植物的方法也是本發(fā)明的一部分。其次，含有這樣的載體的宿主如細菌、優(yōu)選地農(nóng)桿菌科(Agrobacteriaceae)成員、更優(yōu)選地農(nóng)桿菌屬或根瘤桿菌屬(Rhizobacterium)成員、最優(yōu)選地根瘤農(nóng)桿菌也構成本發(fā)明的一部分。
此外，特征在于使用根據(jù)本發(fā)明所述載體的植物轉化方法也包含于本發(fā)明中。
附圖簡述


圖1所用構建體的圖示。圖2用于檢測載體序列共整合的引物雜交位置的圖示。
發(fā)明詳述基本上所有用于植物轉化的已知質粒和載體都能加工成根據(jù)本發(fā)明所述的載體或在根據(jù)本發(fā)明所述的方法中可用的載體。這樣的質粒的例子是pBin19(Bevan，M.，核酸研究12，8711-8721，1984)、pMOG101(WO93/10251)、pMOG800(WO95/05467)、pMON128(EP 0 131623)、GV2260(Deblaere等，1985，核酸研究13，4777-4788)、etcetera和所有從它們衍生的質粒。
這些質粒的關鍵特征是它們包含具有側翼T-DNA邊界序列的T-DNA。而且，它們必須適于在農(nóng)桿菌中復制，因此它們應含有適合用于農(nóng)桿菌中的復制起點(ori)序列。盡管最常使用的農(nóng)桿菌菌株是根瘤農(nóng)桿菌，但發(fā)根農(nóng)桿菌也適于植物轉化。在此，可轉化的DNA位于Ri質粒上并且該DNA因此應稱為R-DNA。但是，T-DNA是普遍使用的術語，這并不將本發(fā)明限制于根瘤農(nóng)桿菌，而是包括所有用于植物轉化的其中DNA序列位于兩個正向重復序列之間的轉化方法。
對于轉化，除T-DNA之外，毒性蛋白也是必需的。這些毒性蛋白可由也包含T-DNA的相同質粒編碼，在此組中的質粒一般稱為共整合質粒。毒性基因位于分開的質粒上(該系統(tǒng)常稱為雙元載體系統(tǒng))或甚至位于細菌染色體上也是同樣可行的。
而且，質粒一般還包含編碼抗生素抗性的基因(使其能在選擇壓力下培養(yǎng))以及在大腸桿菌中復制的起點。
關于植物基因轉化以及農(nóng)桿菌和其中Ti質粒的作用的一般介紹可在“基因操作原理”手冊(old，R.W.和Primrose，S.B.，Blackwell科學出版社，倫敦，1994，第14章，268-301頁)中找到。
本發(fā)明的一個實施方案包括其中植物表達啟動子控制下的編碼毒素的基因位于T-DNA邊界之外的載體。關鍵是此基因對細菌是無毒的或者不在細菌中表達，否則它將傷害細菌及其將T-DNA轉化到植物中的能力。有幾種可防止對細菌的毒性效應的方法。其中一種方法是選擇對細菌無毒的毒性化合物。這樣的毒性化合物的例子是白喉毒素。相似地，將必需的植物管家基因敲除的反義方法也是避免細菌損傷的選擇。對于此方法，必須記住要選擇在植物中有活性(并且必需的)但在細菌中缺乏或僅有次要功能或同源性不大不會受到基因反義表達阻礙的基因。
然而，即使毒素對細菌是有害的，也可找到防止上述毒素在細菌中表達的方法。實現(xiàn)此目的的一個選擇是制備毒素在植物啟動子控制之下的基因構建體。盡管不是所有植物特異性啟動子都可用于這樣的載體，因為它們在細菌中至少有一些表達，但是容易確定所選啟動子是否在細菌細胞中未產(chǎn)生表達(例如通過用上述啟動子引導的GUS基因轉化細菌；細菌中的GUS表達可以容易地得到檢測)。
最后，防止毒素在細菌中表達的方法是將內(nèi)含子序列引入毒素的編碼序列(或用含有內(nèi)含子的基因組序列)。由于細菌不能切除內(nèi)含子，因此只會產(chǎn)生非功能性蛋白(或其部分)，這對細菌是無害的。
可用的毒素包括針對于特定植物的毒素，但也可使用作用于膜系統(tǒng)和/或其它基本細胞結構或過程的更廣泛有效毒素。這樣的毒素的例子包括RIP、爪蟾抗菌肽、RNA酶(如芽孢桿菌RNA酶)、DNA酶、蛋白酶、etcetera。
其它方法可以幾種方式應用，并且用于這些方法中的基因可選自(a)編碼抗內(nèi)源RNA轉錄物的核酶的基因，(b)產(chǎn)生能引起過敏反應的蛋白的基因，(c)轉錄時產(chǎn)生與細胞存活必需內(nèi)源基因的RNA轉錄物互補或至少部分互補的RNA轉錄物的基因，即已知的基因表達反義抑制方法(公開于EP-A 240 208中)和(d)轉錄時產(chǎn)生與細胞存活必需內(nèi)源基因的RNA轉錄物相同或至少非常相似的RNA轉錄物的基因，這是稱為共抑制的尚未完全了解的基因表達抑制方法(公開于Napoli C.等，1990，植物細胞2，279-289)。
當病原體來源的誘導蛋白與對應的植物來源的受體蛋白同時表達時有可能引起過敏反應(HR)。這樣的對應的誘導物/受體基因及它們在轉基因植物中引起HR的適用性在本領域內(nèi)已知，例如黃枝孢avr基因和Lycopersicon esculentum Cf基因(WO91/15585)或丁香假單胞菌avr基因和擬南芥RPMI基因(Grant M.R.等，科學269，843-846，1995)。這些基因用于本發(fā)明的一般方法是將這些基因之一插入T-DNA邊界之間而互補基因在邊界之外。因此，當邊界外DNA轉移入植物中時，兩基因都表達并將產(chǎn)生會殺死由此轉化的細胞的過敏反應。
因為植物來源的抗性基因在一些植物中天然存在，因此那些植物有可能具有編碼位于T-DNA邊界外的相應無毒基因的基因。當它在轉化后表達時將遇到內(nèi)源產(chǎn)生的相應植物基因并引起HR反應。
用于此HR機制的構建體的優(yōu)選實施方案(鑒于調(diào)節(jié)限制)是植物來源的基因存在于T-DNA邊界之間并且病原體來源的基因存在于邊界外的構建體。
根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，使用反義基因以抑制細胞存活必需的內(nèi)源基因的表達，其中基因在植物細胞中表達。
反義干擾基因的靶基因選自那些編碼細胞存活必需的酶(也稱為管家酶)的基因并且應該是核編碼的、優(yōu)選地單拷貝基因，盡管那些由小型基因家族編碼的酶也適于本發(fā)明的目的。而且，上述基因的反義表達效應必須不能由于正常由這樣的酶合成的酶產(chǎn)物從其它細胞或細胞器的擴散或轉運而消除。優(yōu)選地，選擇編碼膜轉運酶的基因，因為它們參與建立跨細胞器膜的化學梯度。根據(jù)定義，通過反義表達對這些蛋白的抑制不能由于跨越這些蛋白定位其中的膜的底物擴散而消除。轉運的化合物不僅限于有機分子也可以是無機性質的分子如P、H、OH或電子。
靶酶的目錄以舉例的方式在表1中給出，但本發(fā)明并不限于此表中提及的酶。更詳細的目錄可見《植物的生物化學》(編輯Stumpf &Conn，1988-1991，1-16卷，學術出版社)叢書或《植物生理學百科全書》(新刊，1976，Springer-Verlag，柏林)。
盡管編碼這些酶的基因僅在一些情況下得到分離并因此基因拷貝數(shù)是未知的，但是它們應滿足的標準已在本發(fā)明中得到描述。
表1反義和有義表達的靶酶的例子
為得到植物宿主中最大的反義效應，使用同源基因是優(yōu)選的。同源意味著可以從與植物宿主相同的植物物種獲得。對于本說明書的目的，異源意味著可從不同植物或非植物物種獲得。異源還應包括在其編碼核酸序列的mRNA中修飾的與宿主基因至少5％不同的合成基因類似物。因為管家基因一般是高度保守的，所以來自其它(植物)物種的異源探針可用于分離來自作物物種的形成抗性的相應基因。因為此方法不需要過多實驗，這樣的基因分離在本領域普通技術人員能力范圍之內(nèi)。
關于轉錄終止區(qū)的必需性，普遍認為這樣的區(qū)域增強植物細胞中的轉錄效率和可靠性。因此使用這些區(qū)域在本發(fā)明內(nèi)容中是特別優(yōu)選的。
本發(fā)明的另一實施方案是一種載體，其中連讀或從左邊界開始的DNA轉移通過T-DNA邊界外的核酸序列插入而受到抑制，上述核酸序列插入影響要轉移入植物中的DNA分子形成天然需要的DNA解旋過程。
這樣的序列的例子是約40個核苷酸(優(yōu)選地20-60堿基對)的GC富集序列，此序列在能量上不利于其DNA解旋，因此預期可通過此序列阻礙DNA解旋。但是，也可使用其它阻礙連讀或左邊界起始的序列。這樣的雙鏈序列增加的穩(wěn)定性的計算方法為本領域技術人員所知，并在Maniatis、Fritsch和Sambrook所著的分子克隆，實驗室手冊，冷泉港，1982，第388頁中有所描述。
可在T-DNA邊界外的序列中阻礙DNA解旋過程的核苷酸序列的另一個例子是包含農(nóng)桿菌DNA結合蛋白的結合位點的序列。結合的雙鏈DNA結合蛋白的移位是DNA解旋所必需的，因此鏈移位所需的能量大大增加。另外，靠近左邊界的DNA結合蛋白的存在可在物理上影響左邊界下游的DNA解旋所需的DNA-蛋白復合物的裝配。
一般而言，所有雙鏈DNA結合蛋白都能影響此過程。優(yōu)選地，使用那些DNA-蛋白相互作用可通過用外界刺激處理農(nóng)桿菌細胞來誘導或增強的蛋白結合位點。更優(yōu)選地，DNA結合蛋白是virG，它也是參與T-DNA動員和轉移的所有vir基因的活化蛋白。已知VirG與vir元件盒結合，包含序列5’TNCAATTGAAAY 3’〔其中N是任意核苷酸，而Y是嘧啶堿基核苷酸(T或C)〕。認為virG與此vir元件盒的結合是在通過virA/virG雙成分調(diào)節(jié)系統(tǒng)活化農(nóng)桿菌的基礎上起始或增強的。在體內(nèi)，vir基因的活化依賴于virG的磷酸化，但此修飾的真正作用仍不清楚。如Sheng和Citovsky所概述的(植物細胞8，1699-1710，1996)，可能性很大的解釋是磷酸化的virG在其相關結合位點上有增強的親和性。
而且，與左邊界序列緊密連接的、結合的DNA結合蛋白的結合位點的引入能通過空間障礙在物理上影響此左邊界上鏈移位所需蛋白的裝配，因而有效地減弱左邊界上的起始。
盡管例如因為一些植物物種到目前為止仍難以進行遺傳轉化，所以本發(fā)明的一些實施方案目前可能不能實施，但是本發(fā)明在這些物種中的實施僅是時間問題而不是原理問題，因為遺傳轉化本身的可行性與本發(fā)明的基本實施方案無關。
目前植物物種轉化對于大量植物物種包括雙子葉植物和單子葉植物來說是常規(guī)的。原則上任何轉化方法都可用于將根據(jù)本發(fā)明所述的嵌合DNA導入適當祖細胞。根據(jù)本發(fā)明所述的優(yōu)選方法包括農(nóng)桿菌介導的DNA轉移。特別優(yōu)選的是使用EP A 120 576和美國專利4,940,838中公開的所謂雙元載體技術。
番茄轉化優(yōu)選地基本按Van Roekel等所述的進行〔Van Roekel，J.S.C.，Damm，B.，Melchers，L.S.，Hoekema，A(1993)影響番茄(Lycopersicon esculentum)轉化頻率的因素，植物細胞報告，12，644-647〕。馬鈴薯轉化優(yōu)選地基本按Hoekema等所述的進行〔Hoekema，A.，Huisman，M.J.Molendijk，L.，van den Elazen，P.J.M.和Cornelissen，B.J.C.(1989)兩個對馬鈴薯X病毒有抗性的商業(yè)馬鈴薯載培品種的遺傳工程，生物/技術7，273-278〕。
盡管有時認為單子葉植物更難于進行遺傳轉化，但是它們可以接受轉化并且可以從轉化的細胞或胚或者其它植物材料再生出可育的轉基因植物。單子葉植物包括商業(yè)上重要的作物如水稻和玉米可以接受通過農(nóng)桿菌菌株進行的DNA轉移(參見WO94/00977；EP 0 159 418 B1；Gould J，Michael D，Hasegawa O，Ulian EC，Peterson G，Smith RH，(1991)植物生理學95，426-434)。
已知幾乎所有植物都可從培養(yǎng)的細胞或組織再生。再生方法在植物物種與物種間有所差異，但一般是首先提供轉化原生質體的懸浮液或含有轉化外植體的培養(yǎng)皿?？芍苯诱T導苗或經(jīng)器官發(fā)生或胚胎發(fā)生從愈傷組織間接誘導芽并隨后使之生根。除了選擇性標記，培養(yǎng)基一般還含有多種氨基酸和激素如植物生長素和細胞因子。向培養(yǎng)基加谷氨酸和脯氨酸也是有利的，特別是對諸如玉米和紫花苜蓿的物種。有效再生將取決于培養(yǎng)基、基因型和載培史。如果對這三個可變因素加以調(diào)控，再生常常是可再現(xiàn)和重復的。將轉化的基因序列穩(wěn)定整合入轉基因植物中后，由它們所賦予的特征可通過有性雜交轉移給其它植物。根據(jù)所要雜交的物種，可使用任何常規(guī)育種技術。
實驗部分實施例1雙元載體骨架的構建將單一的SalI限制性核酸內(nèi)切酶位點導入pMOG800以便將用于抑制連讀或反選擇帶有載體序列的轉基因的元件克隆入左邊界的相鄰處。此位點位于與左邊界相鄰的10bp處。用引物SEQ ID NO1到SEQ IDNO4，采用簡單的基于PCR的誘變策略產(chǎn)生包含DraIII和NruI單一位點的片段，此片段與雙元載體pMOG800(于1993年8月12日以CBS414.93保存于真菌菌種保藏中心，Baarn，荷蘭)中的相應片段幾乎相同，在T-DNA外離左邊界重復序列10bp處有額外的單一SalI位點。
用DraIII和NruI消化此PCR片段并將其克隆入用DraIII和NruI消化的pMOG800。獲得的質粒稱為pNE03。實施例2GC富集序列的插入通過使SEQ ID NO5和6彼此退火產(chǎn)生40bp GC富集片段。將此片段插入SalI位點將只在一個完整末端留下SalI位點。合成的雙鏈寡核苷酸由T4多核苷酸激酶磷酸化并克隆入SalI消化的pNE03載體。獲得的質粒pNE07具有在SalI位點插入的GC富集序列，這導致左T-DNA邊界最近一側的SalI位點的去除。表示定位的圖示見
圖1。實施例3virG結合位點的插入含有virG結合位點的片段來自農(nóng)桿菌菌株EHA101的virB啟動子。以前已證明virB啟動子含有兩個為VirG所識別的vir元件盒序列(Das和Pazour，1989，核酸研究17，4541-4150)。認為只有Vir元件盒不足以結合virG蛋白，另外Vir元件盒3’端約19bp的特異性非保守序列最可能也是結合VirG蛋白所需要的。使用引物SEQ ID NO7和8從根瘤農(nóng)桿菌菌株MOG101 PCR擴增出約90bp的VirB啟動子片段。用SalI和AvaI消化該片段并將其導入pNE03載體的單一SalI位點。再次定位此片段以使SalI-AvaI末端在離左邊界最近處結合。表示定位的圖示見1。此載體稱為pNE09。實施例4芽孢桿菌RNA酶表達盒的導入用NcoI和EcoRI位點從pMOG944(WO98/22599)切下芽孢桿菌RNA酶開放閱讀框和nos終止子序列(925bp)并將其克隆入用NcoI和EcoRI消化的pMOG1302中。pMOG1302含有GapC啟動子片段(Shih等，1991，基因104，133-138)和pMOG445(以pUC為基礎)載體骨架〔pMOG445是通過將用引物SEQ ID NO9和10制備的合成雙鏈DNA插入用EcoRI和SstI消化的pUC18從pUC18(Yannisch-Perron和Messing，1985，基因33，103-119)制備的〕。獲得的質粒含有與Gapc啟動子結合的芽孢桿菌RNA酶開放閱讀框和nos 3’非翻譯序列/終止子以及位于起始密碼子NocI位點上的5’非翻譯序列。獲得的質粒稱為pNE01。隨后用BamHI和XhoI位點將pNE01的完整表達盒(GapC-芽孢桿菌RNA酶-nos)克隆入pBSK+(Stratagene，La Jolla，CA，美國)。此質粒稱為pNE05。用BamHI消化pNE05并導入破壞BamHI位點并引入SalI位點的銜接頭(SEQ ID NO11)。獲得的質粒是pNE08。然后用SalI和XhoI將表達盒從pNE08中切出并將其克隆入全都用SalI消化的修飾的雙元載體pNE03、pNE07和pNE09。這導致產(chǎn)生載體pNE10(僅含芽孢桿菌RNA酶元件盒)、pNE11(GC堆+芽孢桿菌RNA酶盒)和pNE12(virG結合位點+芽孢桿菌RNA酶元件盒)。實施例5GUS標記元件盒的導入來自pMOG1059的EcoRI-HindIII片段含有GUS表達盒，它包含1)fdrolD嵌合啟動子和非翻譯序列(專利申請?zhí)?7203912，12/12/97遞交)，2)含有StLS1內(nèi)含子的GUS開放閱讀框(Vancanneyt等，1990，Mol.Gen.Genet.220-245-250)和3)蛋白酶抑制劑II基因的3’非翻譯/終止子序列(Thorhburg等，1987，美國國家科學院院報84，744-748)。將此EcoRI-HindIII片段插入雙元載體pNE10、11和12邊界間的EcoRI-HindIII位點。GUS元件盒離右邊界最近，發(fā)現(xiàn)nptII選擇性標記離左邊界最近(見
圖1)。用pMOG1059作為未修飾的對照，其載體序列是未經(jīng)修飾的pMOG800骨架。pMOG1313是在T-DNA上含有FdrolD-GUS元件盒并含有與其左邊界相鄰的GC堆的雙元載體，pMOG1314在T-DNA內(nèi)與之相同，但含有與左邊界相鄰的virG結合位點，pMOG1315也含有相同的T-DNA序列并含有與左邊界相鄰的芽孢桿菌RNA酶元件盒。同樣地，pMOG1316含有GC堆和芽孢桿菌RNA酶元件盒，而pMOG1317在芽孢桿菌RNA酶元件盒之后含有virG結合位點。實施例6用新雙元載體轉化馬鈴薯的頻率分析在三個分開的轉化實驗中用常規(guī)轉化方法以根瘤農(nóng)桿菌菌株EHA105轉化載培品種Kardal的馬鈴薯莖段(如PCT/EP 98/02979中所述)。每個構建體最少使用150個外植體。這經(jīng)常會導致約90個轉化體/構建體的再生。轉化頻率測定為相對于所用外植體數(shù)的能在含卡那霉素生長培養(yǎng)基上選擇壓力下生根的再生體數(shù)。在表1中我們將對照構建體pMOG1059的轉化頻率定為1.0。表1.對測試的構建體觀察到的平均相對轉化頻率。在每個實驗中所有值以pMOG1059(設為1.00)為標準。數(shù)值是三次獨立轉化實驗的平均值。<
>左邊界外GC堆或VirG結合位點的插入看來可在一定程度上增加轉化頻率。我們并不完全理解此效應的原因。一種解釋是對DNA轉移的左邊界起始的影響〔正如恰好由一些研究者所指出的(Kononov.M.E.等，1997，植物雜志11，945-957；Ramanathan，V.和Veluthambi，K.，1995植物分子生物學28，1149-1154〕將增加T-DNA轉移的機會，這將增加nptII選擇性標記的原始轉化細胞數(shù)目。實施例7載體骨架共整合的分析下面我們通過PCR分析覆蓋T-DNA的左右邊界的片段，即表明載體DNA在轉化體中整合的片段的存在。對每個構建體，通過多重PCR分析75個單獨株系的外邊界序列。以nptII引物作為內(nèi)對照，用6個引物進行多重PCR。引物在雙元載體上的位置見圖2。
使用引物SEQ ID NO12和13從用載體pMOG1313、pMOG1314和pMOG1059制備的轉化體擴增覆蓋左邊界的序列，獲得約1200bp的片段。對于用構建體pMOG1315、pMOG1316和pMOG1317制備的轉化體，使用引物SEQ ID NO12和14擴增其覆蓋左邊界的序列。此情況中的外部引物退火到芽孢桿菌RNA酶基因上。選擇此引物，因為否則PCR片段會太大使得不能有效擴增。用內(nèi)對照nptII的引物SEQ ID NO15和16進行的PCR擴增將得到約850bp的片段。對于包含右邊界的序列，用引物SEQ ID NO17和18擴增到500bp片段。PCR反應在Perkin-Elmer 480熱循環(huán)儀上進行。
擴增后，將獲得的PCR片段在含有溴化乙錠的0.8％瓊脂糖凝膠中電泳。照相之后計數(shù)不同片段并測定連讀的百分比(詳見表2)。表2帶有覆蓋左右邊界的序列的單獨轉化體的百分比
從表2中可以看出，表現(xiàn)不需要的載體序列共整合的株系數(shù)非常高。用未修飾的pMOG1059構建體制備的轉基因株系的約半數(shù)有至少部分載體骨架的整合。當將GC富集序列導入左邊界相鄰處時此數(shù)值沒有降低。將virG結合位點導入左邊界相鄰處看來可在一定程度上降低邊界轉移的數(shù)目。明確地，當在左邊界外導入GC富集序列或virG結合位點時，左邊界轉移的株系數(shù)有顯著降低(計算為僅帶有LB或LB+RB轉移的株系的百分比)，從pMOG1059中的40％下降到pMOG133和pMOG1314轉化系中的約30％和25％。
在左邊界外只帶有芽孢桿菌RNA酶表達盒的構建體pMOG1315表現(xiàn)帶有載體序列的轉化體數(shù)顯著降低。GC片段或virG結合位點與芽孢桿菌RNA酶的結合看來可進一步降低帶有載體序列的轉化體數(shù)。在我們的實驗中，我們看到帶有邊界轉移的單獨株系數(shù)下降到約10％，這相對于未修飾的pMOG1059對照是非常顯著的改善。
對我們所收集的初級番茄轉化體的粗略調(diào)查表明約40％的轉基因番茄植物含有邊界外序列。這清楚地表明在其它植物物種中也需要此技術。實施例8使用無毒基因和抗性基因進行T-DNA外載體序列的反選擇將來自丁香假單胞菌的AvrRpml誘導物編碼區(qū)有效地克隆到強組成型啟動子之后及馬鈴薯蛋白酶抑制劑II轉錄終止子序列之前。將此表達盒導入左T-DNA邊界下游的BglII位點。將含有來自擬南芥的以組成型啟動子和終止子序列為側翼的Rpml抗性基因的基因組DNA片段導入T-DNA，從而形成pMOG1257(圖2)。使用常規(guī)方法用構建體進行歐洲油菜、番茄和馬鈴薯植物的轉化。
通過使用每一轉化體基因組DNA的PCR反應，分析用此轉化方法得到的轉基因植物中T-DNA外載體序列的存在。所用載體覆蓋靠近左邊界的T-DNA外約300bp序列。實施例9拷貝數(shù)的測定為測定含有構建體pMOG1317的植物和含有構建體pMOG1059的對照植物的拷貝數(shù)，使用基本如(Rogers和Bendich，1985，植物分子生物學5，69-76)所述的CTAB提取方法從每株系的25株植物的葉中分離基因組DNA。用限制性內(nèi)切酶EcoRI在適當?shù)木彌_液中于37℃消化約10μg基因組DNA 16小時。此限制性位點在兩個構建體中都只有一個，在GUS表達盒和NPT-II表達盒之間。用1體積酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1，v/v，Gibco BRL公司)抽提消化混合物并用0.1體積的3M NaAc(pH＝5.2)和2.5體積的96％乙醇沉淀。用70％乙醇洗DNA沉淀，然后將其溶于20μl蒸餾水中。
將每個樣品以2V/cm在0.7％瓊脂糖凝膠中分離約16小時。用0.4MNaOH采用Southern印跡將DNA轉移到尼龍膜(Hybond-N+，AmershamLife Science公司)上。用32P-dCTP標記的558bp GUS片段(pMOG18的NcoI-EcoRV片段；Sijmons等，生物技術，第8卷，1990年3月，第217-221頁)作為探針與印跡雜交(16小時，65℃)。然后以65℃0.2×SSC的嚴謹性洗滌印跡。Southern印跡的結果在表3中列出。表3.在用pMOG1059和pMOG1317轉化的不同單獨株系中觀察到的T-DNA插入數(shù)目<
<p>序列表(1)基本信息(i)申請人(A)名稱MOGEN International nv(B)街道Einsternweg 97(C)城市Leiden(E)國家The Netherlands(F)郵政編號(Zip)2333 CB(G)電話31-(0)71-5258282(H)傳真31-(0)71-5221471(ii)發(fā)明名稱用于植物轉化的質粒和使用此質粒的方法(iii)序列數(shù)18(iv)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.25(EPO)(vi)在先申請資料(A)申請?zhí)朎P 97201990.5(B)遞交目1997年6月30日(2)關于SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型cDNA
(iii)假設否(iii)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO1GATGGCAAAC GCTAATAAGG G21(2)關于SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iii)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO2GAGCGGGTTT AACCTACTTC C21(2)關于SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iii)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO3CTGTTGTCGA CGGCTGGCTG GTGGCAGGAT ATATTGTGG 39(2)關于SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度38個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iii)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO4CCAGCCGTCG ACAACAGCTC CCCGACCGGC AGCTCGGC 38(2)關于SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度44個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iii)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO5TCGACGGGGT GCCTGGGGCG GTGGCGGGGc GGGCCGGGGC GTGC44(2)關于SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度44個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構線型(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iii)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO6TCGAGCACGC CCCGGCCCGC CCCGCCACCG CCCCAGGCAC CCCG 44(2)關于SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iii)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO7TTCTCGAGAG GGTCGGTTAC TCG 23(2)關于SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(xi)序列描述SEQ ID NO8TTGTCGACTC CAAGACGCCG AGC 23(2)關于SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度28個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(xi)序列描述SEQ ID NO9AATTCAGATC TCCATGGATC GATGAGCT 28(2)關于SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(xi)序列描述SEQ ID NO10CATCGATCCA TGGAGATCTG 20(2)關于SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度12個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型
(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(xi)序列描述SEQ ID NO11GATCGGTCGA CC 12(2)關于SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(xi)序列描述SEQ ID NO12GACGCTAAAG GCAAACTTGA TTC 23(2)關于SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(xi)序列描述SEQ ID NO13TTAACCTACT TCCTTTGGTT CCG 23(2)關于SEQ ID NO14的信息(i)序列特征
(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(xi)序列描述SEQ ID NO14AGCGGCCCAT TTTAGTAGAC GGG 23(2)關于SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度28個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(xi)序列描述SEQ ID NO15ATCAATTCGA ACCCCAGAGT CCCGTCCA28(2)關于SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(xi)序列描述SEQ ID NO16CTGGATCGTT TCGCATGATT G 21(2)關于SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(xi)序列描述SEQ ID NO17CCAACTTATC AGTGATAAAG AATCCGC 27(2)關于SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(xi)序列描述SEQ ID NO18GAGATCAGAT TGTCGTTTCC CGCCTTC2權利要求
1.包含具有側翼T-DNA邊界的T-DNA的植物轉化載體，其特征在于載體進一步包含防止帶有比T-DNA序列更多的載體序列的植物轉化體形成的核酸序列。
2.根據(jù)權利要求1所述的載體，其特征在于防止帶有比T-DNA序列更多的載體序列的轉化體形成的核酸序列是編碼毒性化合物的基因，毒性化合物選自RNA酶、DNA酶、植物毒素、白喉毒素、蛋白酶和反義管家基因如ATP合酶、細胞色素C、丙酮酸激酶、氨酰轉移酶以及磷酸、二羧酸、三羧酸和2-氧代-戊二酸轉運蛋白。
3.根據(jù)權利要求1所述的載體，其特征在于防止帶有比T-DNA序列更多的載體序列的轉化體形成的核酸序列通過包含阻礙DNA解旋的序列來防止通讀。
4.根據(jù)權利要求3所述的載體，其特征在于核酸序列通過包含結合DNA結合蛋白的序列來防止帶有比T-DNA序列更多的載體序列的轉化體形成。
5.根據(jù)權利要求4所述的載體，其特征在于結合DNA結合蛋白的序列是vir元件盒，優(yōu)選地是序列5’TNCAATTGAAAY3’〔其中N是任意核苷酸，而Y是嘧啶堿基核苷酸(T或C)〕。
6.根據(jù)權利要求5所述的載體，其特征在于阻礙DNA解旋的序列是有高GC含量的序列，優(yōu)選地是20-60堿基對的序列，更優(yōu)選地是約40堿基對的序列。
7.根據(jù)權利要求5或6所述的載體，其特征在于序列有超過80％、優(yōu)選地超過90％的GC含量。
8.通過用根據(jù)權利要求1-7中的任意一項所述的載體轉化植物獲得不包含T-DNA外的載體序列的轉基因植物的方法。
9.一種宿主，含有根據(jù)權利要求1-7中的任意一項所述的載體。
10.根據(jù)權利要求5所述的宿主，其特征在于它是細菌，優(yōu)選地是農(nóng)桿菌科成員，更優(yōu)選地是農(nóng)桿菌屬或根瘤桿菌屬的成員，最優(yōu)選地是根瘤農(nóng)桿菌。
11.一種植物轉化方法，其特征在于使用根據(jù)權利要求1到7中的任意一項所述的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及農(nóng)桿菌介導的植物轉化,尤其涉及用T－DNA進行的植物轉化,其中邊界處的連讀受到抑制。這可通過構建T－DNA邊界外的DNA結合位點以抑制載體DNA向植物細胞的轉移來實現(xiàn),也可以在T－邊界外插入對植物有毒的與宿主植物基因或共轉移基因協(xié)同作用或不協(xié)同作用的編碼序列以便產(chǎn)生對帶有多余載體DNA的植物的反選擇。
文檔編號A01H1/00GK1261919SQ98806766
公開日2000年8月2日 申請日期1998年6月29日 優(yōu)先權日1997年6月30日
發(fā)明者M·H·斯圖伊維爾, A·S·旁斯泰恩, S·A·奧爾, O·J·M·格狄恩, L·H·希蒙斯, B·M·M·戴克, S·赫克斯特拉, H·泰蓋拉爾, N·埃爾津加 申請人:莫根國際股份有限公司