專(zhuān)利名稱(chēng)：一種體細(xì)胞克隆哺乳動(dòng)物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行克隆的方法，更具體地，涉及用體細(xì)胞來(lái)克隆哺乳動(dòng)物的方法。本發(fā)明還涉及制備用于哺乳動(dòng)物克隆的重構(gòu)卵的方法。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞核移植，不僅在胚胎生物學(xué)研究中是一種很重要的工具，而且對(duì)“優(yōu)良”胚胎(家畜)的擴(kuò)繁也是一種較好的方法。
在哺乳動(dòng)物中，已應(yīng)用早期的胚胎分裂球或胚胎來(lái)源的培養(yǎng)細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞，簡(jiǎn)稱(chēng)為“ES細(xì)胞”)來(lái)提供細(xì)胞核，獲得了相應(yīng)的克隆動(dòng)物綿羊(使用8-16細(xì)胞)[Willadsen S.M.,et al,Nature,1986]；兔(使用8-細(xì)胞)[Stice S.L.,et al,Bio.Reprod.,1989]；豬(使用2-8細(xì)胞)[Prather R.S.,et al.Biol.Reprod.,1989]；牛(使用2-32細(xì)胞)[Prather R.S.,et al.J.Anim.Sci.,1987，]；山羊(使用8-細(xì)胞)[張涌，“國(guó)外畜牧-草食家畜分冊(cè)”，1993]；小鼠(使用ES-細(xì)胞)[Tsunda Y.,et al.Journal ofReproduction and Fertility.,1993]。
近年來(lái)，使用體細(xì)胞來(lái)提供細(xì)胞核，也已在一些哺乳動(dòng)物中成功獲得了克隆動(dòng)物。1997年，Willmult等人應(yīng)用乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行核移植產(chǎn)生了綿羊多利[Willmut I.,et al.,Nature.1997]。隨后，又獲得了不同類(lèi)型的體細(xì)胞克隆動(dòng)物(1)胎兒成纖維細(xì)胞核移植綿羊[Schnieke A.E.,et al.,Science,1997]，(2)胎兒成纖維細(xì)胞核移植牛[Gibelli J.B.,et al.IBID,1998]，(3)輸卵管上皮細(xì)胞核移植牛等。以上核移植動(dòng)物均是應(yīng)用細(xì)胞融合的方法制備的。
此外，1988年Wakayama T等人利用小鼠的另一種體細(xì)胞-即卵丘細(xì)胞，先將該體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)去除，然后將細(xì)胞核直接注射到去核的鼠卵細(xì)胞細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，產(chǎn)生了核移植小鼠[Wakayama T.,et al.,Nature,1988]。
然而，所述產(chǎn)生體細(xì)胞克隆動(dòng)物的方法所涉及到的步驟仍很繁多，因此本領(lǐng)域迫切需要步驟更少、效率更高的克隆動(dòng)物的方法。
本發(fā)明的目的就是提供一種步驟更少，效率更高的用體細(xì)胞克隆哺乳動(dòng)物的方法。在該方法中，不對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行去除細(xì)胞質(zhì)的處理，而是將體細(xì)胞直接注射到去核的卵母細(xì)胞中，并省去了細(xì)胞融合步驟。
本發(fā)明的另一目的是提供一種新的獲得用于制備體細(xì)胞克隆哺乳動(dòng)物的重構(gòu)卵的方法。在該方法中，不對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行去除細(xì)胞質(zhì)的處理，而是將體細(xì)胞直接注射到去核的卵母細(xì)胞中，并省去了細(xì)胞融合步驟。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種體細(xì)胞克隆哺乳動(dòng)物的制備方法，該方法包括以下步驟提供去核的哺乳動(dòng)物供質(zhì)卵母細(xì)胞和用于供核的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞；用顯微注射法，將用于供核的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞直接注射入所述的去核供質(zhì)卵母細(xì)胞，形成重構(gòu)卵；對(duì)所述的重構(gòu)卵進(jìn)行激活處理，形成激活的重構(gòu)卵；將所述的激活的重構(gòu)卵移植到寄母動(dòng)物的輸卵管中，或者將所述的激活的重構(gòu)卵在體外或體內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，形成重構(gòu)胚，然后再將重構(gòu)胚移植到寄母動(dòng)物的子宮內(nèi)；飼養(yǎng)所述的寄母動(dòng)物，產(chǎn)生體細(xì)胞克隆的哺乳動(dòng)物。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種獲得用于制備體細(xì)胞克隆哺乳動(dòng)物的重構(gòu)卵的方法，該方法包括以下步驟提供去核的哺乳動(dòng)物供質(zhì)卵母細(xì)胞和用于供核的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞；用顯微注射法，將用于供核的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞直接注射入所述的去核供質(zhì)卵母細(xì)胞，形成重構(gòu)卵；對(duì)所述的重構(gòu)卵進(jìn)行激活處理，形成激活的重構(gòu)卵。
本發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，其發(fā)明點(diǎn)在于省去了對(duì)體細(xì)胞去除細(xì)胞質(zhì)的處理步驟，而是將體細(xì)胞直接注射到去核的卵母細(xì)胞中，并省去了細(xì)胞融合步驟。由于省去了這些步驟，因此導(dǎo)致克隆哺乳動(dòng)物的方法或產(chǎn)生重構(gòu)卵的方法更加簡(jiǎn)易，效率更高。
在說(shuō)明書(shū)附圖中，


圖1顯示了現(xiàn)有技術(shù)中產(chǎn)生體細(xì)胞克隆哺乳動(dòng)物的方法。
圖2顯示了本發(fā)明的產(chǎn)生體細(xì)胞克隆哺乳動(dòng)物的方法。
圖3顯示了在本發(fā)明方法中通過(guò)手術(shù)沖卵而獲得哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞。
圖4顯示了在本發(fā)明方法中進(jìn)行顯微操作的照片。
圖5A-D顯示了對(duì)哺乳動(dòng)物(羊)卵母細(xì)胞進(jìn)行去核操作，以及將體細(xì)胞顯微注射到去核卵母細(xì)胞。其中，圖5A是在去核前的卵母細(xì)胞；圖5B是去核過(guò)程中的卵母細(xì)胞；圖5C是將體細(xì)胞注射到去核卵母細(xì)胞之前(移核之前)；圖5D是將體細(xì)胞注射到去核卵母細(xì)胞之后(移核之后)。
圖6顯示了由體細(xì)胞克隆發(fā)育而成早期胚胎。
圖7A和7B分別了顯示了貼壁生長(zhǎng)的羊乳腺上皮細(xì)胞(放大200倍)和懸浮的乳腺上皮細(xì)胞(放大200倍)。
圖8顯示了本發(fā)明一實(shí)例中產(chǎn)生體細(xì)胞克隆羊的流程圖。
現(xiàn)參見(jiàn)
圖1，圖中顯示了現(xiàn)有技術(shù)中產(chǎn)生體細(xì)胞克隆哺乳動(dòng)物的方法。該方法包括以下步驟(1)獲得提供細(xì)胞質(zhì)的卵母細(xì)胞(簡(jiǎn)稱(chēng)為“供質(zhì)卵母細(xì)胞”)。
一般地，獲得供質(zhì)卵母細(xì)胞可由以下兩種方法獲得。一是從卵巢卵泡上取出未成熟卵母細(xì)胞，并在體外成熟；一是供細(xì)胞質(zhì)的哺乳動(dòng)物經(jīng)超數(shù)排卵誘導(dǎo)后，從其輸卵管內(nèi)沖出中Ⅱ期卵母細(xì)胞。這些獲得供質(zhì)卵母細(xì)胞的方法都是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。
(2)獲得供核細(xì)胞(即提供細(xì)胞核的細(xì)胞)一般地，獲得供核細(xì)胞可采用成年動(dòng)物的體組織(如皮膚)、未期體細(xì)胞(如顆粒細(xì)胞)等，將有關(guān)組織剪碎和消化后，分散成單個(gè)體細(xì)胞，然后在體外培養(yǎng)，形成細(xì)胞系。也可直接消化成單個(gè)體細(xì)胞。
(3)卵母細(xì)胞的去核一般，將卵母細(xì)胞的核遺傳物質(zhì)在顯微鏡下應(yīng)用去核針機(jī)械去除，從而獲得去核的卵母細(xì)胞。
(4)移核現(xiàn)有技術(shù)中的移核過(guò)程通常有兩種方式。第一種是將含細(xì)胞質(zhì)的體細(xì)胞移入卵周隙中，然后將注入卵周隙的體細(xì)胞和卵母細(xì)胞在融合液內(nèi)通過(guò)電刺激而發(fā)生融合，形成融合式的移核卵(重構(gòu)卵)。第二種是先將體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)去除，再把體細(xì)胞核(不含或含少量胞質(zhì))直接注入去核卵母細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，形成注射式的移核卵(重構(gòu)卵)。
(5)激活對(duì)步驟(4)中形成的重構(gòu)卵，通過(guò)電刺激法或化學(xué)法加以激活，形成被激活的重構(gòu)卵。
(6)體內(nèi)或體外培養(yǎng)，或者直接移植為了觀(guān)察重構(gòu)胚的發(fā)育情況，對(duì)于步驟(5)中形成的被激活的重構(gòu)卵，可以將其移入輸卵管而在體內(nèi)進(jìn)行短暫培養(yǎng)，或者利用飼養(yǎng)細(xì)胞(feeder cell)(例如輸卵管上皮細(xì)胞)進(jìn)行體外培養(yǎng)。然后，將發(fā)育的胚胎移入寄母動(dòng)物(受體)的子宮中。
此外，對(duì)于步驟(5)中形成的被激活的重構(gòu)卵，也可將其直接移入寄母動(dòng)物(受體)的輸卵管內(nèi)，待其妊娠產(chǎn)仔。
(7)飼養(yǎng)妊娠的寄母動(dòng)物對(duì)妊娠的寄母動(dòng)物小心飼養(yǎng)，以產(chǎn)生體細(xì)胞克隆動(dòng)物。對(duì)生出的動(dòng)物通過(guò)DNA指紋分析來(lái)驗(yàn)證。
現(xiàn)參見(jiàn)圖2，圖中顯示了本發(fā)明的產(chǎn)生體細(xì)胞克隆哺乳動(dòng)物的方法。本發(fā)明方法包括以下步驟(1)獲得供質(zhì)卵母細(xì)胞該步驟可與上述的現(xiàn)有技術(shù)的步驟(1)相同。較佳地，供質(zhì)卵母細(xì)胞是通過(guò)母畜的超數(shù)排卵而獲得的。本領(lǐng)域常規(guī)的制備供質(zhì)卵母細(xì)胞的方法都可適用于本發(fā)明。
(2)獲得供核體細(xì)胞該步驟可與上述的現(xiàn)有技術(shù)的步驟(2)相同。本領(lǐng)域常規(guī)的制備供核體細(xì)胞的方法都可適用于本發(fā)明。
(3)卵母細(xì)胞的去核該步驟可與上述的現(xiàn)有技術(shù)的步驟(2)相同。本領(lǐng)域常規(guī)的去核方法都可適用于本發(fā)明。
(4)移核在該步驟中，將步驟(2)中的供核體細(xì)胞直接用顯微注射法而注入去核的卵母細(xì)胞中，形成重構(gòu)卵。即在本發(fā)明方法中，不必對(duì)體細(xì)胞去除胞質(zhì)，也不必先將體細(xì)胞移入卵周隙中再進(jìn)行融合處理。
(5)激活對(duì)步驟(4)中形成的重構(gòu)卵，通過(guò)電刺激法或化學(xué)法加以激活，形成被激活的重構(gòu)卵。本領(lǐng)域中的常規(guī)的激活處理方法都可用于本發(fā)明。通常，對(duì)重構(gòu)卵的激活處理可用電刺激和/或化學(xué)刺激法進(jìn)行。較佳地，在本發(fā)明中對(duì)重構(gòu)卵的激活處理選自下組(ⅰ)重構(gòu)卵在0.2-0.4M甘露醇，3-5mg／ml的胎牛血清，0.08-0.12mM MgSO4的激活液中，進(jìn)行1-3次電刺激，電壓為600-800V/cm，每次電刺激持續(xù)20-80μs；(ⅱ)重構(gòu)卵在0.2-0.4M甘露醇，3-5mg／ml的胎牛血清，0.08-0.12mM MgSO4的激活液中，進(jìn)行1-3次電刺激，電壓為600-800V/cm，每次電刺激持續(xù)20-80μs，然后再如下進(jìn)行化學(xué)法激活即在5-20μM離子霉素中激活5分鐘，并在1-5μM 6-DMAP(6-dimethylaminopurine，即6-二甲基氨基嘌呤)激活1-6小時(shí)。
(6)體內(nèi)或體外培養(yǎng)，或者直接移植該步驟可與上述的現(xiàn)有技術(shù)的步驟(6)相同。本領(lǐng)域常規(guī)的對(duì)重構(gòu)卵進(jìn)行體內(nèi)或體外培養(yǎng)，或者直接移植的方法，都可適用于本發(fā)明。
(7)飼養(yǎng)妊娠的寄母動(dòng)物該步驟可與上述的現(xiàn)有技術(shù)的步驟(7)相同。本領(lǐng)域常規(guī)的飼養(yǎng)妊娠寄母動(dòng)物的方法以及檢驗(yàn)體細(xì)胞克隆動(dòng)物的方法，都可適用于本發(fā)明。
通過(guò)上述的比較可以看出，本發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，省去了對(duì)體細(xì)胞去除細(xì)胞質(zhì)的處理步驟，而是將體細(xì)胞直接注射到去核的卵母細(xì)胞中，并省去了細(xì)胞融合步驟。由于省去了這些步驟，因此導(dǎo)致克隆哺乳動(dòng)物的方法或產(chǎn)生重構(gòu)卵的方法更加簡(jiǎn)易，效率更高。
本發(fā)明方法可適用于各種哺乳動(dòng)物，較佳地該哺乳動(dòng)物是非人的哺乳動(dòng)物?？捎糜诒景l(fā)明方法的哺乳動(dòng)物的例子包括(但并不限于)羊、牛、豬、馬、狗、貓、老虎、猴、兔、小鼠和大鼠。此外，人也可作為一種適用于本發(fā)明方法的哺乳動(dòng)物。
適用于本發(fā)明方法的體細(xì)胞包括各種已分化的體細(xì)胞，例如來(lái)自各種組織(如皮膚、乳腺、輸卵管、肌肉等)和器官(如耳、卵巢等)的細(xì)胞?？捎糜诒景l(fā)明方法的體細(xì)胞的例子包括(但并不限于)皮膚細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、輸卵管細(xì)胞、耳細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、卵丘細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞。
本領(lǐng)域中各種獲得卵母細(xì)胞的方法以及對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行去核處理的方法都可用于本發(fā)明。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，去核的哺乳動(dòng)物供質(zhì)卵母細(xì)胞是這樣獲得的通過(guò)超數(shù)排卵法獲得處于中Ⅱ期卵母細(xì)胞，然后進(jìn)行去核處理獲得去核的哺乳動(dòng)物供質(zhì)卵母細(xì)胞。
在本發(fā)明方法中，在體細(xì)胞被直接注射之前，可對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理，以使其充分分散成單個(gè)細(xì)胞。例如，在如下條件下進(jìn)行處理將培養(yǎng)的體細(xì)胞用0.1-0.5％的胰蛋白酶消化以后，再應(yīng)用1-10mg/L蛋白酶E，36-39℃，3-8％CO2中消化1-20min，然后用于直接注射。
在本發(fā)明方法中，體細(xì)胞和卵母細(xì)胞可以來(lái)自同一動(dòng)物，也可來(lái)自同種動(dòng)物或異種動(dòng)物。
在本發(fā)明中，對(duì)于被激活的重構(gòu)卵，可以被直接移入寄母動(dòng)物(受體)的輸卵管內(nèi)，待其妊娠產(chǎn)仔?；蛘呖梢詫⑵湟迫胼斅压芏隗w內(nèi)進(jìn)行短暫培養(yǎng)，或者利用飼養(yǎng)細(xì)胞(feeder cell)(例如輸卵管上皮細(xì)胞)進(jìn)行體外培養(yǎng)，形成重構(gòu)胚，以便觀(guān)察重構(gòu)胚的發(fā)育情況。然后回收該重構(gòu)胚，將其移植到寄母動(dòng)物的子宮內(nèi)，待其妊娠產(chǎn)仔。
在本發(fā)明方法中，還包括驗(yàn)證步驟即對(duì)重構(gòu)胚或出生的動(dòng)物進(jìn)行DNA指紋分析，以驗(yàn)證是否是克隆動(dòng)物。也可根據(jù)克隆動(dòng)物的表型(例如毛的顏色和斑紋)來(lái)驗(yàn)證是否是克隆動(dòng)物。
下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明，應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于闡述目的而不用于限制本發(fā)明范圍。
實(shí)施例A、方法供質(zhì)母畜超數(shù)排卵技術(shù)(提供卵母細(xì)胞)超數(shù)排卵是指采用制劑誘導(dǎo)動(dòng)物一次排出正常排卵數(shù)若干倍的方法。進(jìn)行一次超排所耗費(fèi)用還比受體同步要多得多。通過(guò)激素[孕馬血清促性激素(PMSG)；促卵泡激素(FSH)、促卵泡激素釋放因子(LRH)]處理，使母畜呈非季節(jié)性排卵，并且在一次排卵中，能排出較多的卵子。對(duì)激素處理過(guò)的、使用過(guò)的動(dòng)物，仍可以再重復(fù)超排使用3-4次，是在時(shí)間間隔、激素用量等方面有所不同，這樣充分地利用了試驗(yàn)動(dòng)物。有多種超數(shù)排卵技術(shù)可供使用。
在本發(fā)明中采用的具體方法是每只動(dòng)物肌注氯前列烯醇(PG，上海計(jì)劃生育研究所)0.06-0.1mg/次，間隔10-14天后注射第二次，在第二次注射PG 10-14天后開(kāi)始超排，即首先肌肉注射FSH(寧波激素制品廠(chǎng))，用量按7-12IU/kg計(jì)(不同種動(dòng)物用量不盡相同)，分6次，2次/日，每次間隔8-12小時(shí)。間隔24小時(shí)發(fā)情時(shí)注射LRH(上海東風(fēng)制藥廠(chǎng))，25ug/次，注射LRH后28-30小時(shí)回收卵母細(xì)胞。
受體母畜的激素處理(受體同步)為與提供卵母細(xì)胞胞質(zhì)的供質(zhì)母羊同步，受體母羊間隔10-14天分兩次肌肉注射PG，在供質(zhì)母羊超排注射PG前24小時(shí)，受體也同時(shí)注射PG，受體注射LRH的時(shí)間及劑量與供體相同。
哺乳動(dòng)物體細(xì)胞系的建立在哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆過(guò)程中，動(dòng)物體細(xì)胞的體外培養(yǎng)及細(xì)胞系的建立亦是很重要。根據(jù)所需克隆動(dòng)物的種類(lèi)和要求，選擇組織或器官建立細(xì)胞系。其方法為將組織、器官或末分化細(xì)胞用胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞，用M199或RM1640等常規(guī)培養(yǎng)液(加10％胎牛血清)培養(yǎng)，傳代，遺傳分析，冷凍保存或作供核用。
卵母細(xì)胞的收集供質(zhì)卵母細(xì)胞供體母畜在注射LRH后26-30小時(shí)，進(jìn)行卵母細(xì)胞的收集。收集是通過(guò)手術(shù)的方法，在母畜的腹部作一切口，將母畜的輸卵管與卵巢暴露在體外，用沖卵液(F10培養(yǎng)液+5％BSA)從輸卵管中沖出卵母細(xì)胞(見(jiàn)圖3)，將收集的卵母細(xì)胞培養(yǎng)在CZB培養(yǎng)液中。
卵母細(xì)胞去核將卵母細(xì)胞移入手術(shù)液中，在顯微鏡下，用持卵針固定卵母細(xì)胞，卵母細(xì)胞排出的極體處于鐘表3點(diǎn)位，去核針正對(duì)著或稍偏離極體去除極體與一部分胞質(zhì)(見(jiàn)圖5A和5B)。
體細(xì)胞注射培養(yǎng)的體細(xì)胞經(jīng)0.25％的胰蛋白酶消化以后，移入手術(shù)液中。再應(yīng)用蛋白酶E(1-10mg/L)，37℃，5％CO2中消化1-10分鐘。洗滌以后，移入手術(shù)液中，再將細(xì)胞注射進(jìn)去核的卵母細(xì)胞中(圖5C和5D)，形成重構(gòu)卵。
重構(gòu)卵的激活重構(gòu)卵采用兩種方法激活一是將重構(gòu)卵在激活液(0.3M甘露醇，4mg／ml胎牛血清，0.1mM MgSO4)中進(jìn)行電刺激(電壓600-800V/cm，每次持續(xù)40μs)后，再用化學(xué)方法激活(10μM離子霉素5分鐘+2μM 6-DMAP 2-6小時(shí))。激活后重構(gòu)卵移入正常的CZB培養(yǎng)液中培養(yǎng)。反應(yīng)溫度通常為37℃±2℃范圍內(nèi)。
重構(gòu)卵體內(nèi)培養(yǎng)應(yīng)用手術(shù)的方法，將激活的重構(gòu)卵吸入移卵管，將移卵管從輸卵管喇叭口處插入，將卵移入輸卵管內(nèi)，隨后在輸卵管與子宮連拉部用縫線(xiàn)結(jié)扎。在體內(nèi)培養(yǎng)6天后，剪下輸卵管，用培養(yǎng)液沖出胚胎(即重構(gòu)胚)，觀(guān)察胚胎發(fā)育情況。
胚胎移植將發(fā)育的重構(gòu)胚移入與胚胎發(fā)育同步的寄母動(dòng)物(受體)子宮內(nèi)。1個(gè)月后B超檢查是否妊娠，精心飼養(yǎng)，待其產(chǎn)仔。
克隆動(dòng)物驗(yàn)證將出生的動(dòng)物、提供供核細(xì)胞的動(dòng)物與受體羊的DNA進(jìn)行指紋分析，驗(yàn)證是否克隆動(dòng)物。
B、材料在本發(fā)明中所用的M199培養(yǎng)基、RMl640培養(yǎng)基、F10培養(yǎng)基和CZB培養(yǎng)基等都是本領(lǐng)域中常規(guī)的培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)。其中，CZB培養(yǎng)液的配方如下表1、CZB培養(yǎng)液
實(shí)施例1用來(lái)自莎能奶山羊的乳腺上皮細(xì)胞來(lái)克隆莎能奶山羊在該實(shí)施例中，所用的具體技術(shù)路線(xiàn)如圖8所示。具體而言，包括以下步驟1、乳腺上皮細(xì)胞獲得與培養(yǎng)用手術(shù)方法，無(wú)菌地取約1cm2的乳腺組織，在超凈臺(tái)內(nèi)用PBS洗滌、剪碎、0.125％胰酶消化0.5-3小時(shí)，滅菌紗布過(guò)濾后離心，沉淀用M199培養(yǎng)液(含10％FBS)懸浮，于四孔板培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后，傳代、冷凍或用于供核。
2、山羊超排與受體羊的同步山羊超排每只動(dòng)物肌注PG，0.06-0.1mg／次，間隔10-14天后注射第二次，在第二次注射PG 10-14天后開(kāi)始超排，即首先肌肉注射FSH，用量按7-12IU/Kg計(jì)(不同種動(dòng)物用量不盡相同)，分6次，2次/日，每次間隔8-12小時(shí)。間隔24小時(shí)，發(fā)情時(shí)注射LRH，25ug/次，根據(jù)羊的體重作適當(dāng)調(diào)整。
受體羊的同步為與提供卵母細(xì)胞胞質(zhì)的供質(zhì)母羊同步，受體母羊間隔10-14天分兩次肌肉注射PG，在供質(zhì)母羊超排注射PG前24小時(shí)，受體也同時(shí)注射PG，受體注射LRH的時(shí)間及劑量同供體。
3、卵母細(xì)胞的回收山羊注射LRH后28-30小時(shí)后，通過(guò)手術(shù)回收卵母細(xì)胞(圖3)。按手術(shù)常規(guī)剪毛、消毒、打開(kāi)腹腔、拉出子宮與輸卵管，用10ml針筒7號(hào)針頭，沖卵液為F10培養(yǎng)液+5％BSA。被沖出輸卵管內(nèi)的卵子接于園杯內(nèi)。在體視解剖鏡下，將檢出的卵母細(xì)胞置于CZB培養(yǎng)液中，在37℃，5％二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
4、供質(zhì)卵母細(xì)胞的去核與注射供核體細(xì)胞將卵母細(xì)胞移于含7.5ug/ml細(xì)胞松弛素B的CZB培養(yǎng)液(表一)中20分鐘，再移至含20mM HEPES的CZB培養(yǎng)液中。同時(shí)將已消化成球形的乳腺上皮細(xì)胞亦移至該液中。將卵母細(xì)胞去核(圖5A和5B)。去核后再將乳腺上皮細(xì)胞直接注入卵母細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，形成的細(xì)胞稱(chēng)之為重構(gòu)卵(圖5C和5D)。重構(gòu)卵置于CZB液中培養(yǎng)30分鐘，然后進(jìn)行激活處理。
5、激活與包埋將重構(gòu)卵置于含細(xì)胞松弛素B(7.5ug/ml)+離子霉素(10μM)中的CZB培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)5分鐘。然后，移至含細(xì)胞松弛素B(7.5ug／ml)+6-DMAP(2μM)的CZB中，于37℃，液滴法培養(yǎng)2-6小時(shí)。激活后的重構(gòu)卵移至CZB培養(yǎng)液中，進(jìn)行包埋。
包埋采用雙層包埋。所用的包埋液是0.8％與1.0％瓊脂糖(低熔點(diǎn))溶液。該包埋液是這樣制備的在10ml錐形玻璃離心管內(nèi)將適量的瓊脂糖與生理鹽水混合煮沸，至完全溶解后置于41℃，水浴待用。
包埋時(shí)，在一塑料平皿中加入含Ca2+、Mg2+的PBS液，在PBS液底部用吸管加入胎牛血清，將待包埋的卵母細(xì)胞移入血清層，使其自然下沉，待位于底壁，吸出。然后移入另一含剛倒出的0.8％瓊脂糖的小平皿中，將卵母細(xì)胞的位置移動(dòng)2-4次(起到洗滌作用)，再均勻吸卵(卵與卵之間有一定的距離，但相靠不是太遠(yuǎn))，移至PBS中。讓其自然凝固，再分割，換一口徑稍大的吸管，按相同方法進(jìn)行第二層包埋，不同點(diǎn)在于包埋液的瓊脂糖濃度為1.0％。
6、重構(gòu)卵的體內(nèi)培養(yǎng)與回收應(yīng)用手術(shù)的方法，將包埋后的重構(gòu)卵吸入移卵管，將移卵管從輸卵管喇叭口處插入，將重構(gòu)卵移進(jìn)輸卵管內(nèi)，隨后在輸卵管與子宮連接部用縫線(xiàn)結(jié)扎。在體內(nèi)培養(yǎng)6天后，剪下輸卵管，用培養(yǎng)液沖出胚胎(重構(gòu)胚)，觀(guān)察胚胎發(fā)育情況。
7、重構(gòu)胚的移植將發(fā)育的重構(gòu)胚移入與胚胎發(fā)育同步的受體子宮內(nèi)。1個(gè)月后B超檢查是否妊娠，精心飼養(yǎng)，待其產(chǎn)仔。
8、克隆動(dòng)物驗(yàn)證將出生的動(dòng)物、提供供核體細(xì)胞的動(dòng)物與寄母羊的DNA進(jìn)行指紋分析，驗(yàn)證是否克隆動(dòng)物。
結(jié)果如下(一)超數(shù)排卵
超排效果卵巢發(fā)育率(以卵巢直徑＞1cm計(jì))90％(9/10)平均每只山羊排卵數(shù)10.2枚(102枚/10)平均每只山羊回收卵數(shù)8.6(86/10)回收卵效率84％(86/102)由以上結(jié)果可以看出，山羊卵巢發(fā)育好，回收卵效率高，但平均每只山羊排卵數(shù)稍低。
(二)受體同步發(fā)情通過(guò)PG處理后，羊的同步率為78％(12/16)。
(三)體細(xì)胞培養(yǎng)已建立了莎能奶山羊乳腺上皮細(xì)胞系、輸卵管上皮細(xì)胞與顆粒細(xì)胞系。在代供過(guò)程中進(jìn)行了染色體數(shù)分析。觀(guān)察了100個(gè)分裂相，2倍染色體占70％以上。
本試驗(yàn)所用的乳腺上皮細(xì)胞為原代細(xì)胞(見(jiàn)圖7A和7B)，亦未進(jìn)行冷凍與饑餓處理。
(四)去核與體細(xì)胞注射去核總卵數(shù)75枚，其中成活73枚，成活率97％(73/75)體細(xì)胞注射后成活卵數(shù)68枚重構(gòu)卵存活率93％(68/73)
(五)激活與體內(nèi)短暫培養(yǎng)重構(gòu)卵的激活采用化學(xué)激活法，激活后的胚胎移入普通山羊輸卵管內(nèi)培養(yǎng)6天后，手術(shù)回收，觀(guān)察重構(gòu)胚發(fā)育情況。
(六)胚發(fā)育與移植1、重構(gòu)胚早期發(fā)育情況表
2、移植將發(fā)育至32細(xì)胞以上的胚胎移植至受體子宮內(nèi)。每只受體移入4枚。
(七)對(duì)胚胎的驗(yàn)證對(duì)上述處于桑椹階段和早期/晚期囊胚階段的胚胎，取少量細(xì)胞進(jìn)行PCR擴(kuò)增(DNA指紋分析)，結(jié)果表明指紋與莎能奶山羊的相同。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求
1．一種體細(xì)胞克隆哺乳動(dòng)物的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟提供去核的哺乳動(dòng)物供質(zhì)卵母細(xì)胞和用于供核的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞；用顯微注射法，將用于供核的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞直接注射入所述的去核供質(zhì)卵母細(xì)胞，形成重構(gòu)卵；對(duì)所述的重構(gòu)卵進(jìn)行激活處理，形成激活的重構(gòu)卵；將所述的激活的重構(gòu)卵移植到寄母動(dòng)物的輸卵管中，或者將所述的激活的重構(gòu)卵在體外或體內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，形成重構(gòu)胚，然后再將重構(gòu)胚移植到寄母動(dòng)物的子宮內(nèi)；飼養(yǎng)所述的寄母動(dòng)物，產(chǎn)生體細(xì)胞克隆的哺乳動(dòng)物。
2．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的激活的重構(gòu)卵被移植到哺乳動(dòng)物輸卵管內(nèi)作體內(nèi)培養(yǎng)，形成重構(gòu)胚，然后回收該重構(gòu)胚，將其移植到寄母動(dòng)物的子宮內(nèi)。
3．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物體細(xì)胞選自下組的細(xì)胞皮膚細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、輸卵管細(xì)胞、耳細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、卵丘細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞。
4．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述體細(xì)胞在直接注射之前，在如下條件下進(jìn)行處理將培養(yǎng)的體細(xì)胞用0.1-0.5％的胰蛋白酶消化以后，再應(yīng)用1-10mg/L蛋白酶E，36-39℃，3-8％CO2中消化1-20min，然后用于直接注射。
5．如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，對(duì)重構(gòu)卵的激活處理選自下組(ⅰ)重構(gòu)卵在0.2-0.4M甘露醇，3-5mg/ml的胎牛血清，0.08-0.12mM MgSO4的激活液中，進(jìn)行1-3次電刺激，電壓為600-800V/cm，每次電刺激持續(xù)20-80μs；(ⅱ)重構(gòu)卵在0.2-0.4M甘露醇，3-5mg／ml的胎牛血清，0.08-0.12mM MgSO4的激活液中，進(jìn)行1-3次電刺激，電壓為600-800V/cm，每次電刺激持續(xù)20-80μs，然后再如下進(jìn)行化學(xué)法激活即在5-20μM離子霉素中激活5分鐘，并在1-5μM 6-DMAP激活1-6小時(shí)。
6．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該哺乳動(dòng)物選自羊、牛、豬、馬、狗、貓、老虎、猴、兔、小鼠和大鼠。
7．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法還包括驗(yàn)證步驟對(duì)重構(gòu)胚或出生的動(dòng)物進(jìn)行DNA指紋分析，以驗(yàn)證是否是克隆動(dòng)物。
8．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，提供去核的哺乳動(dòng)物供質(zhì)卵母細(xì)胞是這樣獲得的通過(guò)超數(shù)排卵法獲得處于中Ⅱ期卵母細(xì)胞，然后進(jìn)行去核處理獲得去核的哺乳動(dòng)物供質(zhì)卵母細(xì)胞。
9．一種獲得用于制備體細(xì)胞克隆哺乳動(dòng)物的重構(gòu)卵的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟提供去核的哺乳動(dòng)物供質(zhì)卵母細(xì)胞和用于供核的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞；用顯微注射法，將用于供核的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞直接注射入所述的去核供質(zhì)卵母細(xì)胞，形成重構(gòu)卵；對(duì)所述的重構(gòu)卵進(jìn)行激活處理，形成激活的重構(gòu)卵。
10．如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物體細(xì)胞選自下組的細(xì)胞皮膚細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、輸卵管細(xì)胞、耳細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、卵丘細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞；所述體細(xì)胞在直接注射之前，在如下條件下進(jìn)行處理將培養(yǎng)的體細(xì)胞用0.1-0.5％的胰蛋白酶消化以后，再應(yīng)用1-10mg/L蛋白酶E，36-39℃，3-8％CO2中消化1-20min，然后用于直接注射；而且，對(duì)重構(gòu)卵的激活處理選自下組(ⅰ)重構(gòu)卵在0.2-0.4M甘露醇，3-5mg／ml的胎牛血清，0.08-0.12mM MgSO4的激活液中，進(jìn)行1-3次電刺激，電壓為600-800V/cm，每次電刺激持續(xù)20-80μs；(ⅱ)重構(gòu)卵在0.2-0.4M甘露醇，3-5mg/ml的胎牛血清，0.08-0.12mM MgSO4的激活液中，進(jìn)行1-3次電刺激，電壓為600-800V/cm，每次電刺激持續(xù)20-80μs，然后再如下進(jìn)行化學(xué)法激活即在5-20μM離子霉素中激活5分鐘，并在1-5μM 6-DMAP激活1-6小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種獲得用于克隆哺乳動(dòng)物的重構(gòu)卵的方法,包括步驟:提供去核供質(zhì)卵母細(xì)胞和供核體細(xì)胞;用顯微注射法,將供核體細(xì)胞直接注入去核供質(zhì)卵母細(xì)胞,形成重構(gòu)卵;和對(duì)重構(gòu)卵進(jìn)行激活處理,形成激活的重構(gòu)卵。本發(fā)明還提供了一種用所述重構(gòu)卵產(chǎn)生體細(xì)胞克隆哺乳動(dòng)物的方法。本發(fā)明方法省去了細(xì)胞融合和去除體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)步驟,因此更加簡(jiǎn)易,效率更高。
文檔編號(hào)A61D19/00GK1294902SQ9911997
公開(kāi)日2001年5月16日 申請(qǐng)日期1999年11月8日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月8日
發(fā)明者成國(guó)祥, 陳建泉 申請(qǐng)人:上海中路生物工程有限公司