專利名稱：：山楊的組織培養(yǎng)和快速繁殖培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體的講，本發(fā)明屬植物生物技術(shù)的楊樹生物技術(shù)研究領(lǐng)域。楊樹作為林木細胞工程的模式種，其組織培養(yǎng)技術(shù)一直為國內(nèi)外學者所關(guān)注。從六十年代末起，國外就開始對楊樹的組織培養(yǎng)進行研究(Winton等，1968)。Winton等人分別于1970年和1971年對美洲山楊(Populustremuloides)和歐洲山楊(P.tremula)組織培養(yǎng)獲得成功。我國的楊樹離體培養(yǎng)工作開始于七十年代，但主要以毛白楊(P.tomentosa)、銀白楊(P.alba)及一些雜交楊為主。有關(guān)山楊(P.davidiana)的組織培養(yǎng)報道僅集中發(fā)表在1993年出版的山楊育種研究一書中，其中徐妙珍、劉培林等人發(fā)表了山楊組織培養(yǎng)的研究，詳細報道了有關(guān)山楊的組織培養(yǎng)技術(shù)。他們雖然完成了山楊的組織培養(yǎng)，但并沒有篩選出一種最佳培養(yǎng)基。本發(fā)明的目的在于提供一種山楊的組織培養(yǎng)基，其分化率高，單芽分化率可達數(shù)十倍的山楊的組織培養(yǎng)和快速繁殖培養(yǎng)基。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是培養(yǎng)基的組成成分a、該培養(yǎng)基的組成成分是KNO3、NH4NO3、MgSO4·7H2O、Ca(NO3)2、K2SO4、CaCl2·2H2O、KH2PO4、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、KI、NaMoO4·2H2O、EDTA-Fe、煙酸、肌醇、甘氨酸、鹽酸硫胺、鹽酸吡哆醇、瓊脂、蔗糖，本發(fā)明的特征是在原來WP培養(yǎng)基基礎(chǔ)上增加了6-BA、NAA及IBA，提高了KH2PO4的含量，同時降低了K2SO4和CaCl2·2H2O的含量。b、配置培養(yǎng)基配方為<tablesid="table1"num="002"><table>成分含量(mg/L)KNO3、NH4NO3MgSO4·7H2OCaCl2·2H2OKH2PO440040037040-60150-300Ca(NO3)2556K2SO4500-800Na2-EDTAFeSO4·7H2O37.327.8KI0.83H2BO3MnSO4·H2OZnSO4·7H2OCuSO4·5H2ONa2MoO4·2H2O6.222.38.60.250.25煙酸肌醇甘氨酸鹽酸硫胺鹽酸吡哆醇0.550255瓊脂蔗糖8000-1500020000-250006-BANAAIBA0.5-0.80.005-0.010.8-1</table></tables>本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明減少了激素含量和種類，降低了成本。分化率高，單芽分化率可達數(shù)十倍。試管苗期聞即表現(xiàn)出很強的生長勢，木質(zhì)化程度高，葉片鮮綠，葉面積大。下面對本發(fā)明的實施例作進一步詳細描述。培養(yǎng)基的組成成分a、該培養(yǎng)基的組成成分是KNO3、NH4NO3、MgSO4·7H2O、Ca(NO3)2、K2SO4、CaCl2·2H2O、KH2PO4、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、KI、NaMoO4·2H2O、EDTA-Fe、煙酸、肌醇、甘氨酸、鹽酸硫胺、鹽酸吡哆醇、瓊脂、蔗糖，本發(fā)明的特征是在原來WP培養(yǎng)基基礎(chǔ)上增加了6-BA、NAA及IBA，提高了KH2PO4的含量，同時降低了K2SO4和CaCl2·2H2O的含量。6、配呈培養(yǎng)基配方為各個時期所用培養(yǎng)基配方具體包括以下三種類型分化培養(yǎng)基WP+6-BA0.5-0.8mg/L+NAA0.01-0.05mg/L繼代培養(yǎng)基WP+6-BA0.5-1mg/L+NAA0.05-0.2mg/L生根培養(yǎng)基WP+IBA0.8-1mg/L所述的生根苗移植培養(yǎng)環(huán)境的濕度要保持在90-100％或過飽和狀態(tài)，光照強度在500-8000勒克司。應用以上培養(yǎng)基，用山楊的頂芽、側(cè)芽、葉片經(jīng)消毒后接種在該培養(yǎng)基上，兩個月可以產(chǎn)生叢生芽。轉(zhuǎn)移到適當?shù)呐囵B(yǎng)基里培養(yǎng)7-10天，即可誘導生根。待生根苗生長健壯后，即可進行移栽，經(jīng)溫室培養(yǎng)兩周，逐漸移至苗圃培養(yǎng)。發(fā)明人曾用中國山楊(PopulusdavidianaDove)的葉片和芽進行培養(yǎng)，取得成功，具體操作如下于12月至次年3月從生長健壯、無病蟲害的優(yōu)良母樹上采集枝條，枝條采回后，及時修剪成適于保存的枝段，用塑料布包好，保存于4℃冰箱即可。接種前將枝段截成直徑約0.5-0.8cm的小枝段于室溫下水培3-5天，待芽膨大時即可用于接種。接種前首先要進行外植體的表面消毒處理。①、芽外植體消毒將芽取下后，首先用肥皂水沖洗數(shù)次，再用自來水沖洗干凈，然后用70％乙醇消毒2分鐘，無菌水沖洗3次，然后轉(zhuǎn)移在超凈工作臺中再用3％次氯酸鈉清洗10分鐘，無菌水沖洗3次，即可用于接種。②、葉片外植體消毒取以充分展開的葉片，先用無菌水沖洗，然后用70％乙醇消毒60秒，無菌水沖洗3次，最后再在超凈工作臺中再用3％次氯酸鈉清洗8分鐘，無菌水沖洗3次，即可用于接種。山楊組織培養(yǎng)采用WP培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，再根據(jù)不同時期的具體需要添加適宜的激素。不同時期采用的培養(yǎng)基類型如下①、分化培養(yǎng)基WP+6-BA0.8mg/L+NAA0.01mg/L②、繼代培養(yǎng)基WP+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L③、生根培養(yǎng)基WP+IBA1mg/L上述各種培養(yǎng)基配置時除添加以上成分外，還要添加蔗糖2.5％，瓊脂粉1％，PH值調(diào)整為6.5，分裝后在121℃、1.1Kg/cm2的壓力下滅菌20分鐘。將外植物消毒后，接種到適宜培養(yǎng)基中，接種過程中要嚴格進行無菌操作，以免培養(yǎng)材料被污染，接種后將接種體置于培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度控制在25℃±1，每天用2000勒克司照光10小時，接種體3-4周繼代一次，連續(xù)培養(yǎng)2-3代，就可以形成多叢分化苗。當分化苗苗莖長到1.5-2cm、直徑約1mm時，由莖基部剪斷接入生根培養(yǎng)基，1周左右即可看到幼根。經(jīng)過3-4周培養(yǎng)，小苗已具有了發(fā)達、健壯的根系，苗莖已木質(zhì)化，此時即可進行移栽。將生長鍵壯的試管苗除去棉塞進行3天的煉苗，使試管苗由完全異養(yǎng)逐漸適應自養(yǎng)環(huán)境。移栽前在培養(yǎng)瓶中到入少許清水，將培養(yǎng)基浸軟，以減少試管苗根系損傷。用鑷子將小苗從培養(yǎng)瓶中夾出，洗去根上粘著的培養(yǎng)基，將根系小心展開，栽入營養(yǎng)缽中，澆透水，移入溫室培養(yǎng)。試管苗移植初期對環(huán)境條件要求嚴格，環(huán)境濕度控制在90％，光照強度控制到5000勒克司，以能保證移栽成活率。權(quán)利要求1.一種山楊的組織培養(yǎng)和快速繁殖培養(yǎng)基，其特征在于培養(yǎng)基的組成成分a、該培養(yǎng)基的組成成分是KNO3、NH4NO3、MgSO4·7H2O、Ca(NO3)2、K2SO4、CaCl2·2H2O、KH2PO4、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、KI、NaMoO4·2H2O、EDTA-Fe、煙酸、肌醇、甘氨酸、鹽酸硫胺、鹽酸吡哆醇、瓊脂、蔗糖，本發(fā)明的特征是在原來WP培養(yǎng)基基礎(chǔ)上增加了6-BA、NAA及IBA，提高了KH2PO4的含量，同時降低了K2SO4和CaCl2·2H2O的含量。b、配置培養(yǎng)基配方為各個時期所用培養(yǎng)基配方具體包括以下三種類型分化培養(yǎng)基WP+6-BA0.5-0.8mg/L+NAA0.01-0.05mg/L繼代培養(yǎng)基WP+6-BA0.5-1mg/L+NAA0.05-0.2mg/L生根培養(yǎng)基WP+IBA0.8-1mg/L2.按照權(quán)利要求1所述的山楊的組織培養(yǎng)和快速繁殖培養(yǎng)基，其特征在于生根苗移植培養(yǎng)環(huán)境的濕度要保持在90-100％或過飽和狀態(tài)，光照強度在500-8000勒克司。全文摘要一種山楊的組織培養(yǎng)和快速繁殖培養(yǎng)基屬生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明解決了利用山楊器官、組織進行組織培養(yǎng)和快速繁殖的技術(shù)關(guān)鍵。該培養(yǎng)基的特征是一種改良的WP培養(yǎng)基,該培養(yǎng)基通過增加6－BA、NAA、IBA及提高KH文檔編號A01H4/00GK1299586SQ9912265公開日2001年6月20日申請日期1999年12月16日優(yōu)先權(quán)日1999年12月16日發(fā)明者祖元剛,閻秀峰,范繼紅,孔瑾,石福臣,張寶友,吳宇,于景華申請人:東北林業(yè)大學,祖元剛,閻秀峰,范繼紅,孔瑾,石福臣,張寶友,吳宇,于景華