浴中，在水浴中不斷晃動(dòng)麥管，10秒后見麥管內(nèi)氣泡可上下移動(dòng)時(shí)，即說明麥管內(nèi)凍精已經(jīng)解凍。
[0023](3)凍精存放與備用:將解凍后的精液集中到一個(gè)干燥的容器中，放入4°C冰箱備用。冰箱存放時(shí)間最多不超過30分鐘就必須用于人工授精。
[0024](4)人工授精:將解凍備用的3mL凍精倒入擠出的卵中，用羽毛輕輕攪勻。然后加入50mL預(yù)先配制好的精子通用激活液，輕輕攪拌3分鐘，靜置I分鐘后，再加入500mL以上清水激活精子以達(dá)到受精，即可將卵移入孵化器中孵化。
[0025]所述的精子激活液為云斑尖塘鱧通用激活液，其配方為:2.6g/L氯化鈉(NaCl)，0.4g/L氯化鉀(KCl)，2.4g/L Tris-HCl。該激活液pH為8.2。放置在4°C冰箱保存，備用。
【具體實(shí)施方式】
[0026]本發(fā)明具體實(shí)例如下，具體參數(shù)為說明本發(fā)明技術(shù)方案所需，不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。
[0027]一、云斑尖塘鱧精子的超低溫冷凍保存
[0028]1、配備精子稀釋液:配方為7.0g/L氯化鈉(NaCl)，lg/L氯化鉀(KCl)，15g/L葡萄糖(C6H12O6)。該稀釋液鹽度為7.3，pH為7.5。放置在4°C冰箱保存，備用。
[0029]2、精液準(zhǔn)備:選擇體重500克以上且性腺發(fā)育成熟的云斑尖塘鱧雄魚，用干毛巾擦干生殖孔周圍及腹部的水。用手輕輕擠壓雄魚腹部，待能擠出精液后，用干燥的滴管吸取精液，開始3-5滴精液不采集，然后將精液擠入干燥的容器中，混勻。將精液用清水激活后，在10 X 20倍的顯微鏡下進(jìn)行鏡檢，計(jì)算機(jī)輔助檢測鮮精平均活率達(dá)到90%以上，平均曲線運(yùn)動(dòng)速度(VCL)達(dá)到35微米/秒以上，平均直線運(yùn)動(dòng)速度達(dá)到20微米/秒以上。
[0030]3、準(zhǔn)備超低溫冷凍保存:準(zhǔn)確量取需要被冷凍的云斑尖塘鱧0.75mLX6精液，加入2.25mLX6精子稀釋液，混勻。將稀釋后的精液放入4°C冰箱進(jìn)行凍前平衡，30分鐘后加如抗凍劑二甲亞砜(DMSO)，使抗凍劑在精液中的終濃度達(dá)到10%。
[0031]4、程序降溫:抗凍劑加入后，立即混勻，分裝至0.5mL麥管，6支麥管裝入I個(gè)麥管套中，I個(gè)冷凍架上可放2個(gè)麥管套。將分裝好的精液以最快的速度放入程序降溫儀的冷凍室中。所述的降溫程序?yàn)?從0°C開始，以5°C /分鐘的速度降至-15°C，在-15°C停留5分鐘，然后再以25°C /分鐘速度從-15°C降至_85°C，最后在_85°C處平衡10分鐘。降溫完成后，直接將裝有精液的麥管或冷凍管連同冷凍支架一起從程序降溫儀中取出，立即放入液氮罐中，在-196°C溫度中保存。
[0032]二、云斑尖塘鱧超低溫保存精子的復(fù)蘇:
[0033]1、配備精子激活液:其配方為:2.6g/L氯化鈉(NaCl)，0.4g/L氯化鉀(KCl)，
2.4g/L Tris-HClo該激活液pH為8.2。放置在4°C冰箱保存，備用。
[0034]2、擠卵:對(duì)體重400克以上的云斑尖塘鱧雌魚進(jìn)行催產(chǎn)，達(dá)到效應(yīng)期后，采用腹部擠壓法將卵輕輕擠入小陶瓷碗中。
[0035]3、解凍及復(fù)蘇:從液氮罐中取出冷凍I個(gè)月以上的云斑尖塘鱧凍精:首先在液氮表面平衡15分鐘，然后用長鑷子從液氮罐中冷凍支架上取下I支麥管套的凍精(I支麥管套內(nèi)裝6支麥管，每支麥管裝有0.5mL凍精，共3mL凍精)。在液氮罐口放置30?60秒后，從麥管套中取出麥管，將麥管直接放入37°C水浴中，在水浴中不斷晃動(dòng)麥管，10秒后見麥管內(nèi)氣泡可上下移動(dòng)時(shí)，即說明麥管內(nèi)凍精已經(jīng)解凍。
[0036]4、人工授精:將解凍備用的3mL凍精倒入擠出的云板尖塘鱧的卵中，用羽毛輕輕攪勻。然后加入50mL預(yù)先配制好的精子通用激活液，輕輕攪拌3分鐘，靜置I分鐘后，再加入500mL以上清水激活精子以達(dá)到受精，即可將受精卵移入孵化器中孵化，受精率超過85%，同時(shí)利用小部分復(fù)蘇后的凍精進(jìn)行鏡檢，平均存活率達(dá)到90%以上。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種云斑尖塘鱧精子超低溫保存的方法，其步驟是: (1)云斑尖塘鱧精子的采集:選擇性腺發(fā)育成熟的云斑尖塘鱧雄魚，用干毛巾擦干生殖孔周圍及腹部的水；用手輕輕擠壓雄魚腹部，待能擠出精液后，用干燥的滴管吸取精液，開頭3-5滴精液不要，然后將精液擠入干燥的容器中，混勻； (2)精子活力檢測:在10X20倍的顯微鏡下進(jìn)行鏡檢，計(jì)算機(jī)輔助檢測鮮精平均活率達(dá)到90%以上，平均曲線運(yùn)動(dòng)速度(VCL)達(dá)到35微米/秒以上，平均直線運(yùn)動(dòng)速度達(dá)到20微米/秒以上，該精子便可用于超低溫冷凍保存；將鏡檢合格的精子放入4°C冰箱保存?zhèn)溆茫? (3)精子的稀釋:準(zhǔn)確量取需要被冷凍的云斑尖塘鱧精液，加入精液3倍體積的精子稀釋液，使精液與稀釋液的稀釋比達(dá)到1: 3;精液與稀釋液混勻，備用； (4)精液的凍前平衡:將稀釋后的精液放入4°C冰箱，進(jìn)行凍前平衡；云斑尖塘鱧精液的凍前平衡時(shí)間為15?45分鐘； (5)加抗凍劑及分裝:在平衡好的云斑尖塘鱧精液中直接加入抗凍劑二甲亞砜(DMSO)，使抗凍劑在精液中的終濃度達(dá)到10%;抗凍劑加入后，立即混勻，分裝至麥管；所有的管內(nèi)不能留有氣泡，分裝過程必須在冰面完成，分裝完成的管子在沒有進(jìn)入程序降溫儀前，應(yīng)全部埋在冰里； (6)程序降溫:將分裝好的精液以快速放入程序降溫儀的冷凍室中；云斑尖塘鱧的降溫程序從0°C開始，以5°C /分鐘的速度降至-15°C，在-15°C停留5分鐘，然后再以25V /分鐘速度從_15°C降至_85°C，最后在_85°C處平衡10分鐘； (7)進(jìn)入液氮:降溫完成后，直接將裝有精液的麥管或冷凍管取出，立即放入液氮罐中，在-196°C溫度中保存。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)所用的雄魚為云斑尖塘鱧(Oxyeleotris marmorata)，且體重在 500 克以上。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中所述的精子稀釋液配方為:7.0g/L氯化鈉(NaCl)，lg/L氯化鉀(KCl)，15g/L葡萄糖(C6H1206);該稀釋液鹽度為7.3，pH為7.5 ;放置在4°C冰箱保存，備用。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中精液的凍前平衡步驟為:將稀釋后的精液放入4°C冰箱，進(jìn)行凍前平衡；云斑尖塘鱧精液的凍前平衡時(shí)間為15?45分鐘。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(5)中所述的抗凍劑二甲亞砜(DMSO)在精液中的終濃度達(dá)到10%。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(6)中所述的降溫程序?yàn)?從(TC開始，以5°C /分鐘的速度降至-15°C，在-15°C停留5分鐘，然后再以25°C /分鐘速度從-15°C降至_85°C，最后在_85°C處平衡10分鐘。
7.—種云斑尖塘鱧精子超低溫保存后的復(fù)蘇方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)從液氮罐中取出凍精:首先在液氮表面平衡15分鐘，然后用長鑷子從液氮罐中取下裝有凍精的麥管；在液氮罐口放置30?60秒后，準(zhǔn)備解凍； (2)解凍:將麥管直接放入37°C水浴中，在水浴中不斷晃動(dòng)麥管，10秒后見麥管內(nèi)氣泡可上下移動(dòng)時(shí)，即說明麥管內(nèi)凍精已經(jīng)解凍； (3)凍精存放與備用:將解凍后的精液集中到一個(gè)干燥的容器中，放入4°C冰箱備用；冰箱存放時(shí)間最多不超過30分鐘就必須用于人工授精； (4)人工授精:將解凍備用的3mL凍精倒入擠出的卵中，用羽毛輕輕攪勻；然后加入50mL預(yù)先配制好的精子通用激活液，輕輕攪拌3分鐘，靜置I分鐘后，再加入500mL以上清水激活精子以達(dá)到受精，即可將受精卵移入孵化器中孵化。
8.如權(quán)利要7所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)所述的精子激活液配方為:2.6g/L 氯化鈉(NaCl)，0.4g/L 氯化鉀(KCl)，2.4g/L Tris-HCl ;該激活液 pH 為 8.2，放置在4°C冰箱保存，備用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種云斑尖塘鱧精子超低溫冷凍保存及復(fù)蘇方法，其步驟是：1、一種云斑尖塘鱧精子超低溫保存的方法：(1)云斑尖塘鱧精子的采集；(2)精子活力檢測；(3)精子的稀釋；(4)精液的凍前平衡；(5)加抗凍劑及分裝；(6)程序降溫；(7)進(jìn)入液氮。2、一種云斑尖塘鱧精子超低溫保存的復(fù)蘇方法：(1)從液氮罐中取出凍精；(2)解凍；(3)凍精存放與備用；(4)人工授精。本發(fā)明的方法對(duì)云斑尖塘鱧精子進(jìn)行超低溫保存及復(fù)蘇，從而為進(jìn)一步開展云斑尖塘鱧的雜交育種、人工繁殖以及種質(zhì)保存提供優(yōu)質(zhì)精液，為云斑尖塘鱧遺傳改良奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明的方法操作簡單，快捷，費(fèi)用低廉，實(shí)用性強(qiáng)。
【IPC分類】A01N1-02
【公開號(hào)】CN104521943
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410747454
【發(fā)明人】尹紹武, 張國松, 任乾, 李鵬, 王小軍
【申請(qǐng)人】南京師范大學(xué)
【公開日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年12月9日