東北紅豆杉組織培養(yǎng)快速繁殖方法
【專利說明】
[0001]技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及生物技術(shù)。利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖東北紅豆杉優(yōu)質(zhì)苗木。
[0002]【背景技術(shù)】東北紅豆杉(Taxus cuspidata)屬紅豆杉科(Taxaceae)紅豆杉屬(Taxus)常綠針葉喬木。東北紅豆杉用途:(I)紫杉醇:從植株提取的紫杉醇對(duì)肺癌等多種腫瘤具有很好的治療效果，由于其廣譜性和療效佳，被譽(yù)為抗癌藥物的今日之星；
[2]中藥:根、莖、葉、皮均可入藥，可治療高血壓、糖尿病、心臟病等癥；(3)用材:材質(zhì)優(yōu)良，適用于樂器、雕刻、高級(jí)家具、美工裝飾等用途；(4)綠化:樹形優(yōu)美，漿果鮮紅色，其枝葉四季濃密蒼翠，是東北地區(qū)少有的常綠觀賞樹種；(5)其他:植株含有紫杉素(TaxinC37H51N010)、東北紅豆杉精油(劇毒)、單寧、紅色素、植物油等。
[0003]東北紅豆杉天然種群數(shù)量的稀少，雌雄異株，花粉無氣囊，飛散距離短，最佳授粉期很短，東北紅豆杉植株結(jié)實(shí)量屬于低產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)型，即絕大多數(shù)年份結(jié)實(shí)量很少，并且種皮堅(jiān)硬(透氣透水性差)、種子內(nèi)含有萌發(fā)抑制物、種胚發(fā)育不完善等導(dǎo)致種子深度休眠。種子休眠期長(zhǎng)、發(fā)芽率低導(dǎo)致東北紅豆杉種群實(shí)生苗數(shù)量數(shù)量減少，降低了遺傳多樣性，被列為國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)的野生珍稀瀕危植物。
[0004]
【發(fā)明內(nèi)容】
(I)芽體增殖:取東北紅豆杉芽鱗未展開之芽苞為外植體，接種到改良的MS培養(yǎng)基中添加6-芐基氨基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)，芽體增殖效果較好。(2)不定根誘導(dǎo):東北紅豆杉幼嫩芽體，不定根發(fā)生較緩慢，不定根發(fā)生有兩種方式，即愈傷組織生根型與皮層生根型，愈傷組織生根型較多。(3)移栽與馴化:以苔蘚為基質(zhì)時(shí)，移栽后成活率較高。組培苗移栽時(shí)保持較高的空氣相對(duì)濕度，有利于維持幼苗的水分平衡和移栽成活。在馴化期間逐漸降低空氣相對(duì)濕度，經(jīng)常噴施殺菌劑，可以提高移栽成活率。
【具體實(shí)施方式】
[0005](I)外植體表面滅菌:在初級(jí)培養(yǎng)時(shí)，在超凈工作臺(tái)上用75%酒精先對(duì)外植體(東北紅豆杉嫩芽)消毒30s，倒去酒精，用無菌水沖洗干凈，再用0.1%的HgC12消毒lOmin，最后用無菌水沖洗3?4次，備用。
[0006](2)芽體增殖培養(yǎng):在MS培養(yǎng)基中分別加入80mg/L酵母提取物和水解酪蛋白，加入6-芐基氨基腺嘌呤(6-BA)0.lmg/L和萘乙酸(NAA)0.5mg/L，培養(yǎng)基中蔗糖用量均為30g/L，瓊脂用量為10g/L，培養(yǎng)基ρΗ5.5，配制好的培養(yǎng)基在1.05mPa(12rC )條件下滅菌20min，滅菌后的培養(yǎng)基平放于工作臺(tái)上，冷卻備用。在超凈工作臺(tái)內(nèi)接種外植體，接種后置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為，溫度22?28°C，每日光照時(shí)間10?12h，光照強(qiáng)度I 800?2 OOOlx0
[0007](3)不定根誘導(dǎo):先將東北紅豆杉芽體轉(zhuǎn)移到1/2MS培養(yǎng)基上，在短日照(光8h、暗16h)、低溫(日20°C，夜17°C )條件下培養(yǎng)45天，再轉(zhuǎn)接到1/2MS培養(yǎng)基加入吲哚丁酸(IBA) 3.5mg/L和NAA0.3mg/L上，繼續(xù)培養(yǎng)20-30天，開始發(fā)生不定根，不定根發(fā)生的形式有兩種，一種是皮層直接生根，另一種是愈傷組織生根。
[0008](4)組培苗移栽:組培苗的不定根長(zhǎng)到1.5cm左右時(shí)，用鑷子將試管苗從培養(yǎng)瓶中輕輕取出，洗去粘附的培養(yǎng)基，勿傷苗體，浸入濃度為1.2g/L的多菌靈水溶液中，藥浴20min，移栽基質(zhì)分別為苔蘚在高溫、高壓條件下滅菌。冷卻至室溫后，把經(jīng)過藥浴的東北紅豆杉試管苗，移栽到盛有不同基質(zhì)的秧盤中，澆透水。將秧盤置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行組培苗馴化。馴化條件為，第I周溫度25°C，空氣相對(duì)溫度80?90% ;第2周溫度為23°C，空氣相對(duì)溫度70?80% ;第3周溫度為20°C，空氣相對(duì)濕度60?70%。在馴化期間每周噴一次濃度為1.2g/L多菌靈水溶液。經(jīng)過3?5周的馴化培養(yǎng)后，組培苗便可以適應(yīng)外界條件。從培養(yǎng)箱內(nèi)取出組培苗，放在溫室內(nèi)按常規(guī)育苗方式進(jìn)行管理。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.以東北紅豆杉嫩芽為外植體進(jìn)行增殖培養(yǎng)效果較好。
2.為改良的MS+0.lmg/L6-BA+0.5NAA可實(shí)現(xiàn)東北紅豆杉組培苗的快速繁殖。
3.東北紅豆杉組培苗在1/2MS培養(yǎng)基上先木質(zhì)化培養(yǎng)，再誘導(dǎo)不定根。
【專利摘要】本發(fā)明涉及東北紅豆杉組織培養(yǎng)快速繁殖方法。東北紅豆杉是一種可以提取紫杉醇治療多種腫瘤，還可以綠化、用材、中藥等用途。以東北紅豆杉嫩芽為外植體，接種到加入6-芐基氨基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)改良的MS培養(yǎng)基，進(jìn)行增殖培養(yǎng)。芽苗在1/2MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定根，且根系較發(fā)達(dá)。取出生根苗，在1.2g/L的多菌靈水溶液中浸泡20min后，移栽到苔蘚基質(zhì)中，管理好溫度和濕度，噴施殺菌劑，組培苗成活率高。
【IPC分類】A01H4-00
【公開號(hào)】CN104620985
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510069096
【發(fā)明人】程廣有, 唐曉杰, 王明啟, 楊振國(guó)
【申請(qǐng)人】北華大學(xué)
【公開日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2015年2月3日