克拉伯病的動物模型的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及小兒球形細胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良的動物模型，以及所述動物模型在篩選 和/或驗證可以用作治療球形細胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良的藥物的試劑方面的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 小兒球形細胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良（GLD，半乳糖?；拾贝贾练e癥或克拉伯病 (Krabbe's disease))是中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中的一種罕見的常染色體隱性遺傳性退行性 疾病。據(jù)估計，在美國的發(fā)病率是1:100. 〇〇〇。它的特點是存在球形細胞（具有多個核的 細胞），神經(jīng)的保護髓鞘層退化和腦細胞損失。GLD導(dǎo)致嚴重的智力下降和肌肉運動延遲。 這是由半乳糖腦苷脂-β-半乳糖苷酶（GALC)的缺陷導(dǎo)致的，半乳糖腦苷脂-β-半乳糖苷 酶（GALC)是髓鞘的代謝所必需的酶。該疾病常常侵襲6個月月齡前的嬰兒，但它也可在青 少年時期或成年人中出現(xiàn)。癥狀包括煩躁、沒有任何原因的發(fā)熱、四肢僵硬（高血壓）、癲癇 發(fā)作、與食物攝入相關(guān)的問題、嘔吐以及智力和肌肉運動能力的遲緩發(fā)育。其他癥狀包括肌 肉無力、痙攣、耳聾和失明。
[0003] 目前，還沒有GLD的根治療法。來自非常小的臨床研宄（包括得了小兒GLD的患 者）的結(jié)果顯示，在癥狀發(fā)作之前從非相關(guān)供體接受了臍帶血干細胞的兒童只發(fā)展非常少 的神經(jīng)無效。該結(jié)果還顯示，與接受成年人骨髓的患者相比，接受了臍帶血的患者的疾病進 展被更快地穩(wěn)定。已經(jīng)顯示，如果在疾病的過程中提早地實施骨髓移植，骨髓移植對患有輕 微疾病的患者具有有益效果。通常，在2歲之前，小兒GLD是致命的。以后發(fā)病的患者通常 具有較輕的疾病進展。
[0004] 外源性替代缺失或缺陷的酶（酶替代療法，ERT)已被證明對患有溶酶體貯積癥 (如戈謝?。℅aucher disease))的患者有效。獲取合適且可靠的GLD動物模型對于GLD的 酶替代療法的發(fā)展最為重要。
[0005] 半乳糖神經(jīng)酰胺酶基因（GALC)的長度為大約60kb并由17個外顯子組成。已在 鼠和人GALC基因中鑒定出多種突變和多態(tài)性，從而導(dǎo)致GLD具有不同的嚴重程度。表1列 出了一些這些突變和多態(tài)性，包括很常見的所謂30-kb缺失。該缺失構(gòu)成歐洲血統(tǒng)的個體 中的突變GALC等位基因的主要部分。該大缺失在處于純合狀態(tài)時或者與另一與嚴重疾病 相關(guān)的突變雜合時導(dǎo)致經(jīng)典的嬰兒形式。然而，通常在人類患者中觀察到的表型差異不僅 來自特定突變和多態(tài)性，還可能來自其他還未知的因素。這使得幾乎不可能預(yù)測每個單獨 的突變在處于不同的環(huán)境中時的效果。
[0006] 表 1 (采用自 Tappion 等人，2010):
[0007]
【主權(quán)項】
1. 一種多能或全能的非人類哺乳動物細胞，其包括至少一種編碼半乳糖腦苷 脂-0 -半乳糖苷酶（GALC)的外源核酸構(gòu)建體，其中，對應(yīng)于人類GALC中的第270位的甘 氨酸的氨基酸改變成天冬氨酸并且對應(yīng)于人類GALC中的第546位的異亮氨酸的氨基酸改 變成蘇氨酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的細胞，其中，所述外源核酸構(gòu)建體編碼人類半乳糖腦苷 脂-0 -半乳糖苷酶（GALC)，其中，第270位的甘氨酸改變成天冬氨酸并且第546位的異亮 氨酸改變成蘇氨酸。
3. 根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的細胞，其中，所述半乳糖腦苷脂_ 0 _半乳糖苷 酶包括與SEQ ID NO. : 3中示出的序列基本上相同的序列。
4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的細胞，其中，所述半乳糖腦苷脂_ 0 _半乳糖苷 酶包括SEQ ID NO. : 3中示出的序列。
5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的細胞，其中，所述重組基因插入所述非人類哺 乳動物細胞的基因組中。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的細胞，其中，所述重組基因破壞所述非人類哺乳動物細胞的 內(nèi)源半乳糖腦苷脂-e -半乳糖苷酶等位基因。
7. 根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的細胞，其中，所述細胞中的所述重組基因是雜 合的。
8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的細胞，其中，所述細胞中的所述重組基因是純 合的。
9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的細胞，其中，所述細胞是半乳糖腦苷脂_ 0 _半 乳糖苷酶（GALC)缺陷的。
10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的細胞，其中，所述半乳糖腦苷脂-e _半乳糖 苷酶（GALC)缺陷是可誘導(dǎo)的。
11. 根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的細胞，其中，所述非人類哺乳動物細胞是多能 或者全能小鼠細胞。
12. 根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的細胞，其中，所述非人類哺乳動物細胞是小鼠 胚胎干（ES)細胞。
13. -種制造轉(zhuǎn)基因的非人類哺乳動物的方法，包括以下步驟： (a) 提供根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的多能或全能的非人類哺乳動物細胞， (b) 將所述多能或全能的非人類哺乳動物細胞插入所述非人類哺乳動物的分離的胚細 胞內(nèi)， (c) 將包括所述多能或全能的非人類哺乳動物細胞的所述胚細胞植入所述非人類哺乳 動物的假孕雌性體內(nèi)， (d) 鑒定步驟（c)的懷孕雌性的后代中的種系傳遞。
14. 根據(jù)前述權(quán)利要求所述的方法，其中，所述非人類哺乳動物是小鼠。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述非人類哺乳動物細胞是小鼠胚胎干細胞。
16. -種半乳糖腦苷脂-0 -半乳糖苷酶（GALC)缺陷轉(zhuǎn)基因的非人類哺乳動物，其包括 至少一種編碼半乳糖腦苷脂-0-半乳糖苷酶（GALC)的外源核酸構(gòu)建體，其中，對應(yīng)于人類 GALC的第270位的甘氨酸的氨基酸改變成天冬氨酸并且對應(yīng)于人類GALC的第546位的異 亮氨酸的氨基酸改變成蘇氨酸。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的轉(zhuǎn)基因的非人類哺乳動物，其中，所述外源核酸構(gòu)建體編 碼人類半乳糖腦苷脂-0 -半乳糖苷酶（GALC)，其中，第270位的甘氨酸改變成天冬氨酸并 且第546位的異亮氨酸改變成蘇氨酸。
18. 根據(jù)權(quán)利要求16-17中的任一項所述的轉(zhuǎn)基因的非人類哺乳動物，其中，所述半乳 糖腦苷脂-半乳糖苷酶包括與SEQ ID NO :3中示出的序列基本上相同的序列。
19. 根據(jù)權(quán)利要求16-18中的任一項所述的轉(zhuǎn)基因的非人類哺乳動物，其中，所述半乳 糖腦苷脂-半乳糖苷酶包括SEQ ID NO :3中示出的序列。
20. 根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的轉(zhuǎn)基因的非人類哺乳動物，其中，所述重組基 因插入所述非人類哺乳動物細胞的基因組中。
21. 根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的轉(zhuǎn)基因的非人類哺乳動物，其中，所述重組基 因破壞所述非人類哺乳動物細胞的內(nèi)源半乳糖腦苷脂_ 0 _半乳糖苷酶等位基因。
22. 根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的轉(zhuǎn)基因的非人類哺乳動物，其中，所述非人類 哺乳動物是小鼠。
23. 根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的轉(zhuǎn)基因的非人類哺乳動物，其中，所述轉(zhuǎn)基 因的非人類哺乳動物對由所述外源核酸構(gòu)建體編碼的所述半乳糖腦苷脂_半乳糖苷酶 (GALC)酶免疫耐受。
24. 根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的轉(zhuǎn)基因的非人類哺乳動物，其中，所述半乳糖 腦苷脂-0-半乳糖苷酶（GALC)缺陷是可誘導(dǎo)的。
25. 根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的轉(zhuǎn)基因的非人類哺乳動物，其中，所述半乳糖 腦苷脂-0-半乳糖苷酶（GALC)缺陷只存在于成年動物中。
26. 根據(jù)權(quán)利要求15-25中的任一項所述的轉(zhuǎn)基因的小鼠在篩選或驗證可以用作治療 球形細胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良的藥物的試劑方面的用途。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的用途，其中，所述試劑是分離的重組半乳糖腦苷脂-0 -半 乳糖苷酶（GALC)。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的用途，其中，所述試劑是分離的重組人類半乳糖腦苷 脂-0-半乳糖苷酶（GALC)。
29. -種驗證試劑的方法，包括以下步驟： (a) 提供根據(jù)權(quán)利要求15和25中的任一項所述的轉(zhuǎn)基因的非人類哺乳動物， (b) 使所述非人類哺乳動物與試劑接觸以便驗證， (c) 在所述接觸之后，確定所述非人類哺乳動物是否響應(yīng)于所述試劑。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述試劑是分離的重組半乳糖腦苷脂-e -半 乳糖苷酶（GALC)。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中，所述試劑是分離的重組人類半乳糖腦苷 脂-0-半乳糖苷酶（GALC)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及小兒球形細胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良的動物模型，以及所述動物模型在篩選和/或驗證可以用作治療球形細胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良的藥物的試劑方面的用途。
【IPC分類】C12N9-24, C12N15-85, A01K67-027
【公開號】CN104735976
【申請?zhí)枴緾N201380042380
【發(fā)明人】延斯·福格, 克拉斯·安德松
【申請人】Ace生物科學(xué)公司
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2013年8月7日
【公告號】EP2882284A1, US20150196014, WO2014023314A1