一種以葉片為外植體的紅馬銀花組織培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種以葉片為外植體的紅馬銀花組織培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]紅馬銀花(Rhododendronvialii Delavay et Franch.)屬于杜花科，杜花屬的馬銀花亞屬，為常綠灌木。紅馬銀花由于種子較少，有性繁殖出苗率極低，組培時(shí)生根困難，種苗難以滿足市場(chǎng)需求。
[0003]說(shuō)明書(shū)
[0004]本發(fā)明提供一種以葉片為外植體的紅馬銀花組織培養(yǎng)方法，該方法通過(guò)改良組織培養(yǎng)方法，使紅馬銀花組培叢生芽能正常生根，從而達(dá)到快速繁育種苗的目的。
[0005]本發(fā)明所述的一種以葉片為外植體的紅馬銀花組織培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
[0006](I)外植體的采集和預(yù)處理
[0007]采集無(wú)病蟲(chóng)害的野生紅馬銀花帶葉莖段，清水沖洗，在莖段上切取葉片；
[0008](2)滅菌和接種
[0009]將清洗干凈的紅馬銀花葉片在超凈工作臺(tái)上按下列順序進(jìn)行滅菌:質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 % HgCl2溶液中消毒5min，無(wú)菌水清洗4_5次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2% NaClO溶液中滅菌5min，無(wú)菌水清洗4-5次，無(wú)菌濾紙吸干表面水分，然后將葉片切成0.8-1.0cm長(zhǎng)的片段，接種在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為:WPM+蔗糖20-30g/L+瓊脂5-8g/L，pH 5.3-5.5 ；
[0010](3)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)
[0011]將步驟⑵接種的葉片轉(zhuǎn)接到葉片愈傷組織培養(yǎng)基中，在溫度25°C ±2°C，
[0012]暗培養(yǎng)至有愈傷組織出現(xiàn)，所述葉片愈傷組織培養(yǎng)基:WPM+6-BA 1.8-2.2mg/L+2, 4-D 2.8-3.2mg/L，pH 5.3-5.5 ；
[0013](4)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)
[0014]將步驟(3)形成的愈傷組織接種到芽誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)基中，在光照強(qiáng)度
[0015]1400-1800LX、光照時(shí)間12h/d、溫度25±2°C的條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)形成叢生芽，所述芽誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)基為:WPM+ZT 0.8-1.2mg/L+NAA 0.05mg/L+AC 0.5g/L，pH 5.3-5.5 ；
[0016](5)繼代培養(yǎng)
[0017]將步驟(4)誘導(dǎo)形成的叢生芽每隔60-80d按步驟(4)所述的同樣方法進(jìn)行繼代培養(yǎng)；
[0018](6)生根培養(yǎng)
[0019]將步驟(5)繼代培養(yǎng)的叢生芽分株轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，在25±2°C，光
[0020]強(qiáng)1600-2200LX，光照時(shí)間12_14h/d條件下培養(yǎng)至基部長(zhǎng)出3_6條根系即成紅馬銀花組培苗，所述生根培養(yǎng)基為:WPM+IBA 0.8-1.2mg/L+NAA0.4-0.6mg/L+AC lg/L，pH
5.3~5.5 ;
[0021](7)組培苗的煉苗和移栽
[0022]①煉苗:將根長(zhǎng)為6-lOcm，根數(shù)量多6根的組培苗帶瓶移至大棚內(nèi)，放置2-4天后打開(kāi)瓶蓋，在24-28 °C，空氣相對(duì)濕度75-90%，光強(qiáng)6500-8000Lx條件下煉苗4_6天；②移栽與培養(yǎng):將煉苗后的組培苗洗凈根部培養(yǎng)基，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1-0.15%的多菌靈百菌清溶液浸泡根部40-80秒后，移栽至沙壤土:腐殖土按體積6:4的混合基質(zhì)中，用塑料薄膜覆蓋保溫保濕，溫度保持在28-30°C，空氣相對(duì)濕度85-95%，于6000Lx條件下培育8_10d，即成紅馬銀花種苗。
[0023]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0024]本發(fā)明提出了新的技術(shù)方案，能夠促使紅馬銀花愈傷組織順利生根，生產(chǎn)出馬銀花組培苗，從而達(dá)到了快速繁育種苗的目的。本發(fā)明培育組培苗生根率達(dá)到80%，根長(zhǎng)苗壯，所培育的組培苗移栽成活率達(dá)到90%以上，可在園林綠化與組培企業(yè)中推廣應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0025]以下實(shí)施例無(wú)特殊說(shuō)明的，為常規(guī)方法。
[0026]實(shí)施例1
[0027]本發(fā)明所提供的一種以葉片為外植體的紅馬銀花組織培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
[0028](I)外植體的采集和預(yù)處理
[0029]采集無(wú)病蟲(chóng)害的野生紅馬銀花帶葉莖段，清水沖洗，在莖段上切取葉片；
[0030](2)滅菌和接種
[0031]將清洗干凈的紅馬銀花葉片在超凈工作臺(tái)上按下列順序進(jìn)行滅菌:質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 % HgCl2溶液中消毒5min，無(wú)菌水清洗4_5次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2% NaClO溶液中滅菌5min，無(wú)菌水清洗4-5次，無(wú)菌濾紙吸干表面水分，然后將葉片切成0.8-1.0cm長(zhǎng)的片段，接種在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為:WPM+蔗糖20g/L+瓊脂5g/L，pH 5.3 ；
[0032](3)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)
[0033]將步驟(2)接種的葉片轉(zhuǎn)接到葉片愈傷組織培養(yǎng)基中，在溫度25°C，暗培養(yǎng)至有愈傷組織出現(xiàn)，所述葉片愈傷組織培養(yǎng)基為:WPM+6-BA 1.8mg/L+2，4-D2.8mg/L，pH 5.3 ；
[0034](4)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)
[0035]將步驟(3)形成的愈傷組織接種到芽誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)基中，在光照強(qiáng)度1400LX、光照時(shí)間12h/d、溫度25°C的條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)形成叢生芽，所述芽誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)基為:WPM+ZT 0.8mg/L+NAA 0.05mg/L+AC (活性炭)0.5g/L，pH 5.3 ；
[0036](5)繼代培養(yǎng)
[0037]將步驟(4)誘導(dǎo)形成的叢生芽每隔60d按步驟(4)所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)方法(即采用與步驟(4)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)所述的芽誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)基及其在光照強(qiáng)度1400LX、光照時(shí)間12h/d、溫度25°C的條件下繼代培養(yǎng))進(jìn)行一次繼代培養(yǎng)；
[0038](6)生根培養(yǎng)
[0039]將步驟(5)繼代培養(yǎng)的叢生芽分株轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，在25±2°C，光強(qiáng)1600LX，光照時(shí)間12h/d條件下培養(yǎng)至基部長(zhǎng)出3-6條根系即成紅馬銀花組培苗，所述生根培養(yǎng)基為:WPM+IBA 0.8mg/L+NAA 0.4mg/L+AC(活性炭)lg/L，pH 5.3 ；
[0040](7)組培苗的煉苗和移栽
[0041]①煉苗:將根長(zhǎng)為6-lOcm，根數(shù)量多6根的組培苗帶瓶移至大棚內(nèi)，放置3天后打開(kāi)瓶蓋，在28°C，空氣相對(duì)濕度90%，光強(qiáng)7000Lx條件下煉苗4天；②移栽與培養(yǎng):將煉苗后的組培苗洗凈根部培養(yǎng)基，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%的多菌靈百菌清溶液浸泡根部40秒后，移栽至沙壤土:腐殖土按體積6:4的混合基質(zhì)中，用塑料薄膜覆蓋保溫保濕，溫度保持在30°C，空氣相對(duì)濕度95%，于6000Lx條件下培育8d即成紅馬銀花種苗。
[0042]上述培養(yǎng)生根率達(dá)到80%，本發(fā)明培育的組培苗根長(zhǎng)苗壯，所培育出的組培苗移栽成活率達(dá)到90%以上。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種以葉片為外植體的紅馬銀花組織培養(yǎng)方法，包括如下步驟: (1)外植體的采集和預(yù)處理 采集無(wú)病蟲(chóng)害的野生紅馬銀花帶葉莖段，清水沖洗，在莖段上切取葉片； (2)滅菌和接種 將清洗干凈的紅馬銀花葉片在超凈工作臺(tái)上按下列順序進(jìn)行滅菌:質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%HgCl2溶液中消毒5min，無(wú)菌水清洗4_5次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2% NaClO溶液中滅菌5min，無(wú)菌水清洗4-5次，無(wú)菌濾紙吸干表面水分，然后將葉片切成0.8-1.0cm長(zhǎng)的片段，接種在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為:WPM+蔗糖20-30g/L+瓊脂5-8g/L，pH 5.3-5.5 ； (3)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng) 將步驟(2)接種的葉片轉(zhuǎn)接到葉片愈傷組織培養(yǎng)基中，在溫度25°C ±2°C，暗培養(yǎng)至有愈傷組織出現(xiàn)，所述葉片愈傷組織培養(yǎng)基:WPM+6-BA 1.8-2.2mg/L+2, 4_D 2.8-3.2mg/L，pH.5.3~5.5 ; (4)芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 將步驟(3)形成的愈傷組織接種到芽誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)基中，在光照強(qiáng)度1400-1800LX、光照時(shí)間12h/d、溫度25±2°C的條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)形成叢生芽，所述芽誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)基為:WPM+ZT 0.8-1.2mg/L+NAA 0.05mg/L+AC 0.5g/L，pH 5.3-5.5 ； (5)繼代培養(yǎng) 將步驟(4)誘導(dǎo)形成的叢生芽每隔60-80d按步驟(4)所述的方法進(jìn)行繼代培養(yǎng)； (6)生根培養(yǎng) 將步驟(5)繼代培養(yǎng)的叢生芽分株轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，在25±2°C，光強(qiáng).1600-2200LX，光照時(shí)間12_14h/d條件下培養(yǎng)至基部長(zhǎng)出3_6條根系即成紅馬銀花組培苗，所述生根培養(yǎng)基為:WPM+IBA 0.8-1.2mg/L+NAA 0.4-0.6mg/L+AClg/L，pH 5.3-5.5 ； (J)組培苗的煉苗和移栽 ①煉苗:將根長(zhǎng)為6-lOcm，根數(shù)量多6根的組培苗帶瓶移至大棚內(nèi)，放置2-4天后打開(kāi)瓶蓋，在24-28°C，空氣相對(duì)濕度75-90%，光強(qiáng)6500-8000Lx條件下煉苗4_6天?、谝圃耘c培養(yǎng):將煉苗后的組培苗洗凈根部培養(yǎng)基，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1-0.15%的多菌靈百菌清溶液浸泡根部40-80秒后，移栽至沙壤土:腐殖土按體積6:4的混合基質(zhì)中，用塑料薄膜覆蓋保溫保濕，溫度保持在28-30°C，空氣相對(duì)濕度85-95%，于6000Lx條件下培育8_10d即成紅馬銀花種苗。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種以葉片為外植體的紅馬銀花組織培養(yǎng)方法。該方法包括外植體的采集和預(yù)處理、滅菌和接種、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)、芽誘導(dǎo)培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、煉苗和移栽。本發(fā)明方法能夠促使紅馬銀花愈傷組織順利生根，其組培苗生根率達(dá)到80％以上，根長(zhǎng)苗壯，移栽成活率達(dá)到90％以上。
【IPC分類】A01H4-00
【公開(kāi)號(hào)】CN104737915
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510184811
【發(fā)明人】孫永玉, 閆紅, 李昆, 唐國(guó)勇, 劉方炎, 張春華
【申請(qǐng)人】中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲(chóng)研究所
【公開(kāi)日】2015年7月1日
【申請(qǐng)日】2015年4月20日