一種菌絲球分布均勻的杏鮑菇液體菌種及其發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及杏鮑菇栽培技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種菌絲球分布均勻的杏鮑菇液體菌 種及其發(fā)酵方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 杏鮑葫（PleurotuseryngiiQuel.)又名刺序側(cè)耳，具有菌肉肥厚、質(zhì)地脆嫩等優(yōu) 點，特別是其菌柄組織致密、結(jié)實、乳白、爽口，被稱為"平菇王"、"干貝菇"，具有杏仁香味和 鮑魚的口感，適合保鮮、加工，深得人們的喜愛，其營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生 素及鈣、鎂、銅、鋅等礦物質(zhì)，可以提高人體免疫功能，對人體具有抗癌、降血脂、潤腸胃以及 美容等作用，具有極高的栽培價值與商業(yè)價值。
[0003] 目前國內(nèi)外杏鮑菇栽培以固體菌種為主，而液體菌種相對于固體菌種具有生產(chǎn)周 期短、菌齡一致、出菇齊、便于管理、菌種成本低、接種方便且快速等優(yōu)點，有利于食用菌生 產(chǎn)的規(guī)?；?、工廠化。近年來由于工廠化栽培技術(shù)的迅猛發(fā)展，為縮短菌種制備周期，提高 菌種質(zhì)量和生產(chǎn)效率，國內(nèi)外生產(chǎn)廠家研宄開發(fā)液體菌種用于替代目前杏鮑菇生產(chǎn)中普遍 使用的固體菌種，并在實際生產(chǎn)中開始應(yīng)用。
[0004] 杏鮑菇液體菌種是通過液體發(fā)酵工藝生產(chǎn)有活力的杏鮑菇菌絲體。目前，國內(nèi)尚 未頒布統(tǒng)一的國家標(biāo)準(zhǔn)來規(guī)范杏鮑菇液體菌種的質(zhì)量和品質(zhì)，但是在實際應(yīng)用過程中人們 總結(jié)應(yīng)用效果制訂了一些地方性標(biāo)準(zhǔn)，如遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)《DB21/T 1693-2008食用菌液體 菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》等，在這些標(biāo)準(zhǔn)中明確規(guī)定，合格的食用菌液體菌種應(yīng)該"可見特有的 菌絲形態(tài)，球狀和叢狀菌絲體大量分布，菌絲粗壯，菌絲內(nèi)原生質(zhì)分布均勻""菌液稍粘稠， 有大量片狀或球狀菌絲體懸浮、分布均勻"，也就是說優(yōu)良的液體菌種菌絲球密度高、直徑 小，分布均勻；另一方面，在實際生產(chǎn)應(yīng)用中杏鮑菇液體菌種是通過生產(chǎn)線接種機進行機械 化接種操作，由于接種機噴口狹窄，為防止菌液堵塞管道，還需要增加液體菌種接種前的預(yù) 處理工藝（一般采用機械粉碎的方法使菌液中的菌絲球直徑變小，使菌液變均勻）。因此， 杏鮑菇液體發(fā)酵菌絲球的大小、密度、均勻度等物理特性是優(yōu)質(zhì)液體菌種的關(guān)鍵控制指標(biāo)。
[0005] 目前，有關(guān)杏鮑菇液體培養(yǎng)的研宄報道和專利技術(shù)大部分集中于搖瓶水平，規(guī)模 化發(fā)酵研宄的較少，基本集中在發(fā)酵工藝的優(yōu)化方面，尤其在發(fā)酵培養(yǎng)基的改良方面較 多：申請?zhí)枮?01410568173. 3的中國專利公開了一種改良的杏鮑菇液體發(fā)酵培養(yǎng)基以 及利用其培養(yǎng)杏鮑菇液體菌種的方法，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加〇. 1-0. 3g/100ml的明膠、瓊 脂中的一種或二者的混合物，采用攪拌、搖床震蕩培養(yǎng)，上述公開的專利培養(yǎng)基中瓊脂添 加量超過0. 4g/100ml凝固，無法進行液體培養(yǎng)，不易控制，存在發(fā)酵失敗隱患，并且搖床 培養(yǎng)得到的液體菌種量少，不適合規(guī)?；C械化生產(chǎn)，同時菌種質(zhì)量不是很好。申請?zhí)?為201410244283. 4的中國專利公開了一種食用菌液體菌種的生產(chǎn)方法，是將保存的食用 菌菌株經(jīng)活化后在固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后粉碎，繼續(xù)在固體培養(yǎng)基上密封培養(yǎng)2-3天，與 0. 15-0. 2%的瓊脂溶液接觸混勻得到液體菌種，上述公開的專利實質(zhì)上仍然存在固體發(fā)酵 的缺陷，并且其中的粉碎再培養(yǎng)工藝和調(diào)配工藝易污染雜菌，高速攪拌打漿和粉碎的高剪 切力對菌種傷害頗大。北方園藝.食用菌篇公開了劉冠丼等發(fā)表的杏鮑菇液體菌種的制備 研宄【2009 (11) 230-232】，對杏鮑菇液體菌種發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，但仍不全 面，不能很好的適合菌種生長、繁殖，得到的液體菌種的發(fā)酵菌絲球的大小、密度、均勻度等 物理特性不很理想，同樣存在攪拌剪切力對菌絲球質(zhì)量的嚴重影響。
[0006] 鼓氣發(fā)酵是將氧氣或無菌空氣從氣升式發(fā)酵罐底部通入的發(fā)酵方式，同時具備通 氧和柔和攪拌的作用，通氧效率高、溶氧效果好，可有效防止攪拌式發(fā)酵剪切力對杏鮑菇液 體菌種質(zhì)量的影響，得到的液體菌種菌絲粗壯、粘度適中、菌絲球直徑小、密度高、分布均 勻。申請?zhí)枮?01310479951. 7的中國專利公開了一種杏鮑菇液體菌種的培養(yǎng)方法，將傳統(tǒng) 的馬鈴薯碳源和麩皮氮源替換為豆柏粉，將培養(yǎng)基倒入發(fā)酵罐，121°C滅菌60-120分鐘，滅 菌后水淋冷卻并通入無菌空氣；接種培養(yǎng)好的液體母種，接種量為1-2%。，發(fā)酵罐培養(yǎng)溫度 為21-26°C，通氣壓力為0. 5-1. 5兆帕，培養(yǎng)7-10天得到杏鮑菇液體菌種，但上述公開的專 利培養(yǎng)基營養(yǎng)不全面，發(fā)酵工藝滯后，發(fā)酵周期長，得到的液體菌種質(zhì)量仍不理想。
[0007] 綜上，依據(jù)杏鮑菇的菌種特性，通過優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，采用鼓氣發(fā)酵制備高 質(zhì)量、高產(chǎn)量、成本低的菌絲球分布均勻的杏鮑菇液體菌種仍是本領(lǐng)域技術(shù)人員的不懈追 求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有鼓氣發(fā)酵制備杏鮑菇液體菌種的缺陷，在菌 種培養(yǎng)過程各階段培養(yǎng)基中科學(xué)復(fù)配可提高菌種抗冷、熱應(yīng)激性和免疫性的中草藥提取物 以及適應(yīng)性原料木肩粉，采用分段追加接種和變溫發(fā)酵的方式，縮短菌種菌齡、增殖代數(shù)差 距，適時流加包被后的殼聚糖調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基的粘度，培養(yǎng)出一種發(fā)酵菌絲粗壯、活性高、 菌絲球直徑小、密度大、分布均勻、發(fā)酵周期短的杏鮑菇液體菌種。
[0009] 為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0010] 一種菌絲球分布均勻的杏鮑菇液體菌種的發(fā)酵方法，包括如下步驟：
[0011] 1)取保存好的杏鮑菇斜面菌種〇. 2cm2的菌種塊2塊接種于平板培養(yǎng)基進行活化， 25°C恒溫培養(yǎng)10天，如此活化2次，得平板種子；
[0012] 2)將平板種子用直徑為0. 5cm的打孔器截取0. 2cm2的菌種塊3塊接入250mL三角 瓶中，液體種子培養(yǎng)基裝液量為lOOmL，于25°C恒溫培養(yǎng)2天，然后放入恒溫搖床中，25°C、 100r/min振蕩培養(yǎng)3天得液體種子；
[0013] 3)將液體種子以10%的接種量接種于50〇1^搖瓶中，搖瓶培養(yǎng)基裝液量25〇11^，于 25°C、150r/min振蕩恒溫培養(yǎng)4天得搖瓶種子；
[0014] 4)將搖瓶種子以10 %的接種量接種于5L種子罐中，種子罐培養(yǎng)基裝液量3L，于 25°C、通氣量4L/min條件下恒溫培養(yǎng)4天得種子罐種子；
[0015] 5)首先將種子罐種子以8%接種量接種于30L發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量15L， 于30-32°C、通氣量3-5L/min恒溫發(fā)酵12-24h，然后以0. 3-0. 5°C /min的速率降溫至 18-22°C，向發(fā)酵罐中加入10_12g包被殼聚糖和900mL種子罐種子，在通氣量3-5L/min條 件下恒溫發(fā)酵l〇_16h，最后以0. 2-0. 4°C /min的速率升溫至24-26°C，在通氣量2-4L/min 條件下恒溫發(fā)酵45-52h即得菌絲球分布均勻的杏鮑菇液體菌種；
[0016] 所述杏鮑菇斜面菌種為市購杏鮑菇純化菌株；
[0017] 所述平板培養(yǎng)基組成為：馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氫鉀 3g/L，硫酸鎂 I. 5g/L，瓊脂 20g/L，VB1 0· 02g/L，余量為水，pH 值 6. 0 ;
[0018] 所述液體種子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖30g/L，酵母浸出汁5g/L，蛋白胨2g/L，瓊脂 2g/L，中草藥提取物0. 3-0. 5g/L，磷酸二氫鉀0. 5g/L，硫酸鎂0. 5g/L，木肩粉0. 1-0. 3g/L， VB1 (λ 01g/L，余量為水，pH 值 6. 0 ;
[0019] 所述搖瓶培養(yǎng)基組成為：黃豆餅粉60g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，中草藥提取 物 0· 5-1. Og/L，磷酸二氫鉀 0· 5g/L，硫酸鎂 0· 5g/L，木肩粉 0· 2-0. 4g/L，VB1 0· 01g/L，余量 為水，pH值6.0 ;
[0020] 所述種子罐培養(yǎng)基組成為：黃豆餅粉60g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，中草藥提 取物 0· 8-1. 2g/L，磷酸二氫鉀 0· 5g/L，硫酸鎂 0· 5g/L，木肩粉 0· 3-0. 5g/L，VB1 0· 01g/L，余 量為水，pH值6.0 ;
[0021] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：黃豆餅粉60g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，中草藥提 取物 I. 3-1. 5g/L，木肩粉 0· 7-0. 9g/L，磷酸二氫鉀 0· 5g/L，硫酸鎂 0· 5g/L，VB1 0· 01g/L，余 量為水，pH值6.0 ;
[0022] 優(yōu)選地，所述中草藥提取物的制備方法，包括如下步驟：按重量份數(shù)計，稱取黃芪 30份，干姜30份，陳皮30份，牛黃25份，丹皮25份，甘草20份，知母18份，金銀花18份， 魚腥草17份，赤芍15份，黃芩15份，川芎10份，當(dāng)歸8份；置盛有0. 2%碳酸氫鈉溶液的 超聲波清洗機中于200W、30KHz清洗12min，瀝干，將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下， 置容器中均勻混合并添加5倍重量的水，得混合物料，控制溫度80°C保持3h，接著降溫至 45°C，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為4,在功率200W條件下進行微波提取12min，同時在功率250W，頻 率35KHz條件下進行超聲波輔助提取；然后加入混合物料總重量1. 0 %的混合酶進行酶解， 用乳酸調(diào)節(jié)PH值為6. 2,酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，乙醇和 丙醇混合的質(zhì)量比為1:2,控制溫度至70°C保持3. 5h，過