一種滇桂石斛組織培養(yǎng)繁育方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種植物繁殖方法，特別是一種滇桂石斛組織培養(yǎng)繁育方法。
【背景技術】
[0002]漠桂石斛(Dendrobiumguangxiense S.J.Cheng et C.Ζ.Tang)，為蘭科石斛屬多年生植物，國家二級保護植物。生于海拔約1200米的石灰山巖石上或樹干上。產于中國廣西、貴州西南和云南東南部。滇桂石斛的莖紫色而柔軟，是加工紫皮楓斗的主要原料之一，具有較高的藥用價值，同時滇桂石斛花唇瓣上有紫紅色斑塊，具有很高的觀賞價值。
[0003]目前滇桂石斛已經有人工栽培，主要通過分株繁育或扦插方式繁殖，但所需時間很長，繁殖倍率低，生產上難以實現大面積栽培。雖然滇桂石斛也有種子，但種子不具胚乳，無發(fā)芽能力，只有在真菌共生下，才能促進種子萌發(fā)生長，且發(fā)芽率非常低，通過種子繁育也無法滿足生產需要。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種滇桂石斛組織培養(yǎng)繁育方法，能夠有效快速地提高滇桂石斛種苗的繁殖速度和質量，實現滇桂石斛優(yōu)質種苗的工廠化育苗，以滿足生產上的需要。
[0005]本發(fā)明通過以下技術方案達到上述目的:一種滇桂石斛組織培養(yǎng)繁育方法，包括以下步驟:
[0006](I)外植體的選擇與消毒:取滇桂石斛健康植株新萌發(fā)的嫩芽作為外植體，剝去外層包葉后，依次用2% (v/v)洗潔精水溶液浸泡5min、線狀自來水沖洗15_30min、添加了2-3滴吐溫-20的100毫升0.1 % (v/v)升萊消毒8_10min、無菌水沖洗3_5次，最后用消毒濾紙除去表面水分，得到外植體，其中無菌水為經高壓滅菌的蒸餾水；
[0007](2)外植體初代誘導獲得無菌試管苗:將步驟(I)得到的外植體置于解剖鏡下，剝去0.2-0.3mm的莖尖分生組織，接種到MS培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23_27°C，光照強度15001ux，光照時間為8-10小時/天的條件下培養(yǎng)60天得到無菌試管苗，其中MS培養(yǎng)基中添加2.0mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的PH值為5.8 ;
[0008](3)試管苗叢生芽快速繁殖培養(yǎng):將步驟(2)中得到的無菌試管苗置于MS繁殖培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度23-27°C，光照強度15001ux，光照時間為8_10小時/天的條件下培養(yǎng)75天得到試管苗叢生芽，其中MS繁殖培養(yǎng)基中添加2.0-3.5mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、2.5-4.0mg/L的萘乙酸ΝΑΑ、0.1-1.0mg/L的激動素KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8。
[0009]本發(fā)明的突出優(yōu)點在于:
[0010](I)采用生物技術對滇桂石斛進行組織培養(yǎng)快速繁殖，通過滇桂石斛叢生芽的繁殖，能夠在短時間內培育出大量適合栽培種植的滇桂石斛幼苗，保障滇桂石斛種苗的增殖系數和種苗質量，實現規(guī)?；a，滿足生產上的需要。
[0011](2)采用本發(fā)明所述的培養(yǎng)方法得到的滇桂石斛叢生芽增殖系數達到25-30倍，叢生芽健壯，接種到生根培養(yǎng)基后容易生根。
【具體實施方式】
[0012]下面結合實施例對本發(fā)明的技術方案進一步說明。
[0013]實施例1
[0014]本發(fā)明所述的滇桂石斛的組織培養(yǎng)快速繁殖方法的一個實例，包括以下步驟:
[0015](I)外植體的選擇與消毒:取滇桂石斛健康植株新萌發(fā)的嫩芽作為外植體，剝去外層包葉后，依次用2% (v/v)洗潔精水溶液浸泡5min、線狀自來水沖洗15_30min、添加了2-3滴吐溫-20的100毫升0.1 % (v/v)升萊消毒8_10min、無菌水沖洗3_5次，最后用消毒濾紙除去表面水分，得到外植體，其中無菌水為經高壓滅菌的蒸餾水；
[0016](2)外植體初代誘導獲得無菌試管苗:將步驟(I)得到的外植體置于解剖鏡下，剝去0.2-0.3mm的莖尖分生組織，接種到MS培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23_27°C，光照強度15001ux，光照時間為8-10小時/天的條件下培養(yǎng)60天得到無菌試管苗，其中MS培養(yǎng)基中添加2.0mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的PH值為5.8 ;
[0017](3)試管苗叢生芽快速繁殖培養(yǎng):將步驟(2)中得到的無菌試管苗置于MS繁殖培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度23-27°C，光照強度15001ux，光照時間為8_10小時/天的條件下培養(yǎng)75天得到試管苗叢生芽，其中MS繁殖培養(yǎng)基中添加2.0mg/L的6-芐基腺嘌呤6_BA、2.5mg/L的萘乙酸NAA、1.0mg/L的激動素KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8，叢生芽增殖系數為24.8。
[0018]實施例2
[0019]本發(fā)明所述的滇桂石斛的組織培養(yǎng)快速繁殖方法的另一個實例，包括以下步驟:
[0020](I)外植體的選擇與消毒:取滇桂石斛健康植株新萌發(fā)的嫩芽作為外植體，剝去外層包葉后，依次用2% (v/v)洗潔精水溶液浸泡5min、線狀自來水沖洗15_30min、添加了2-3滴吐溫-20的100毫升0.1 % (v/v)升萊消毒8_10min、無菌水沖洗3_5次，最后用消毒濾紙除去表面水分，得到外植體，其中無菌水為經高壓滅菌的蒸餾水；
[0021](2)外植體初代誘導獲得無菌試管苗:將步驟⑴得到的外植體置于解剖鏡下，剝去0.2-0.3mm的莖尖分生組織，接種到MS培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23_27°C，光照強度15001ux，光照時間為8-10小時/天的條件下培養(yǎng)60天得到無菌試管苗，其中MS培養(yǎng)基中添加2.0mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的PH值為5.8 ;
[0022](3)試管苗叢生芽快速繁殖培養(yǎng):將步驟(2)中得到的無菌試管苗置于MS繁殖培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度23-27°C，光照強度15001ux，光照時間為8_10小時/天的條件下培養(yǎng)75天得到試管苗叢生芽，其中MS繁殖培養(yǎng)基添加含3.5mg/L的6-芐基腺嘌呤6_BA、4.0mg/L的萘乙酸NAA、0.lmg/L的激動素KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8，叢生芽增殖系數為28.6。
[0023]實施例3
[0024]本發(fā)明所述的滇桂石斛的組織培養(yǎng)快速繁殖方法的再一個實例，包括以下步驟:
[0025](I)外植體的選擇與消毒:取滇桂石斛健康植株新萌發(fā)的嫩芽作為外植體，剝去外層包葉后，依次用2% (v/v)洗潔精水溶液浸泡5min、線狀自來水沖洗15_30min、添加了2-3滴吐溫-20的100毫升0.1 % (v/v)升萊消毒8_10min、無菌水沖洗3_5次，最后用消毒濾紙除去表面水分，得到外植體，其中無菌水為經高壓滅菌的蒸餾水；
[0026](2)外植體初代誘導獲得無菌試管苗:將步驟⑴得到的外植體置于解剖鏡下，剝去0.2-0.3mm的莖尖分生組織，接種到MS培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23_27°C，光照強度15001ux，光照時間為8-10小時/天的條件下培養(yǎng)60天得到無菌試管苗，其中MS培養(yǎng)基中添加2.0mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的PH值為5.8 ;
[0027](3)試管苗叢生芽快速繁殖培養(yǎng):將步驟(2)中得到的無菌試管苗置于MS繁殖培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度23-27°C，光照強度15001ux，光照時間為8_10小時/天的條件下培養(yǎng)75天得到試管苗叢生芽，其中MS繁殖培養(yǎng)基中添加2.5mg/L的6-芐基腺嘌呤6_BA、3.0mg/L的萘乙酸NAA、0.5mg/L的激動素KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8，叢生芽增殖系數為27.3。
[0028]實施例4
[0029]本發(fā)明所述的滇桂石斛的組織培養(yǎng)快速繁殖方法的又一個實例，包括以下步驟:
[0030](I)外植體的選擇與消毒:取滇桂石斛健康植株新萌發(fā)的嫩芽作為外植體，剝去外層包葉后，依次用2% (v/v)洗潔精水溶液浸泡5min、線狀自來水沖洗15_30min、添加了2-3滴吐溫-20的100毫升0.1 % (v/v)升萊消毒8_10min、無菌水沖洗3_5次，最后用消毒濾紙除去表面水分，得到外植體，其中無菌水為經高壓滅菌的蒸餾水；
[0031](2)外植體初代誘導獲得無菌試管苗:將步驟⑴得到的外植體置于解剖鏡下，剝去0.2-0.3mm的莖尖分生組織，接種到MS培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23_27°C，光照強度15001ux，光照時間為8-10小時/天的條件下培養(yǎng)60天得到無菌試管苗，其中MS培養(yǎng)基中添加2.0mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的PH值為5.8 ;
[0032](3)試管苗叢生芽快速繁殖培養(yǎng):將步驟(2)中得到的無菌試管苗置于MS繁殖培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度23-27°C，光照強度15001ux，光照時間為8_10小時/天的條件下培養(yǎng)75天得到試管苗叢生芽，其中MS繁殖培養(yǎng)基中添加3.0mg/L的6-芐基腺嘌呤6_BA、3.0mg/L的萘乙酸NAA、0.5mg/L的激動素KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8，叢生芽增殖系數為30.2。
【主權項】
1.一種滇桂石斛組織培養(yǎng)繁育方法，其特征在于:該方法包括以下步驟: (1)外植體的選擇與消毒:取滇桂石斛健康植株新萌發(fā)的嫩芽作為外植體，剝去外層包葉后，依次用2% (v/v)洗潔精水溶液浸泡5min、線狀自來水沖洗15_30min、添加了 2_3滴吐溫-20的100毫升0.1% (v/v)升汞消毒8-10min、無菌水沖洗3-5次，最后用消毒濾紙除去表面水分，得到外植體，其中無菌水為經高壓滅菌的蒸餾水； (2)外植體初代誘導獲得無菌試管苗:將步驟(I)得到的外植體置于解剖鏡下，剝去0.2-0.3mm的莖尖分生組織，接種到MS培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強度15001ux，光照時間為8-10小時/天的條件下培養(yǎng)60天得到無菌試管苗，其中MS培養(yǎng)基中添加2.0mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的PH值為5.8 ; (3)試管苗叢生芽快速繁殖培養(yǎng):將步驟(2)中得到的無菌試管苗置于MS繁殖培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度23-27°C，光照強度15001ux，光照時間為8-10小時/天的條件下培養(yǎng)75天得到試管苗叢生芽，其中MS繁殖培養(yǎng)基中添加1.5-3.5mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、1.0-4.0mg/L的萘乙酸ΝΑΑ、0.1-1.0mg/L的激動素KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8。
【專利摘要】一種滇桂石斛組織培養(yǎng)繁育方法，包括如下步驟：(1)取滇桂石斛健康植株新萌發(fā)的嫩芽作為外植體進行消毒；(2)將消毒后的外植體置于MS基本培養(yǎng)基中誘導得到無菌試管苗；(3)將所述無菌試管苗置于MS繁殖培養(yǎng)基中進行試管苗快速繁殖培養(yǎng)獲得叢生芽。采用本發(fā)明所述的培養(yǎng)方法得到的滇桂石斛叢生芽增殖系數達到25-30倍，能夠在短時間內提供成活率高的滇桂石斛優(yōu)質種苗，有效解決滇桂石斛的規(guī)?；鐔栴}。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105104197
【申請?zhí)枴緾N201510518070
【發(fā)明人】韋坤華, 李林軒, 梁瑩, 黃丹娜, 繆劍華, 王曉峰, 韋瑩, 王一諾
【申請人】廣西壯族自治區(qū)藥用植物園
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2015年8月21日