芍藥葉片組織培養(yǎng)直接成芽的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物的組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種芍藥葉片組織培養(yǎng)直接成芽的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]茍藥(Paeonia lactiflora Pal1.)是我國的傳統(tǒng)名花，位列“花相”，僅次于“花王”牡丹，在我國已有4000多年的栽培歷史。芍藥的花朵碩大，花色艷麗，花型美觀，花香馥郁，深受廣大人民群眾的喜愛，而一些具有新奇性狀的品種，市場前景尤為廣闊。如普通的3?5年生芍藥栽培品種售價(jià)一般為20?30元，而較為新奇的品種如‘黃金輪’售價(jià)約為普通品種的10倍，并需求量巨大。而如何快速、高效地將這些新奇品種進(jìn)行擴(kuò)繁，是擺在種植者面前迫切需要解決的難題。
[0003]當(dāng)前芍藥最常用的繁殖方法是分株繁殖與播種繁殖，前者雖然能保持原品種的性狀，但需要植株生長3?5年才能分一次，并且周期較長、繁殖系數(shù)較低，分株后的母株翌年觀賞價(jià)值明顯下降；后者既不能保持原品種的性狀，又需要經(jīng)過4?5的童期才能開花，因此，兩者均不適宜進(jìn)行大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)。植物組織培養(yǎng)是植物快速繁殖的一種最為有效的方法，與傳統(tǒng)繁殖方法相比，組織培養(yǎng)既能保持原有品種和優(yōu)良性狀，擴(kuò)大其繁殖系數(shù)，又不受季節(jié)的影響，可以周年運(yùn)轉(zhuǎn)，大幅度地提高了繁殖的效率。CN102428872B公開了一種通過種胚培養(yǎng)獲得完整芍藥植株的方法，但由于種胚并不能完全保持母本的性狀，因此不能用于優(yōu)良品種的擴(kuò)繁。吳紅娟等人發(fā)表的論文‘觀賞芍藥‘大富貴’叢生芽誘導(dǎo)及生根技術(shù)’(吳紅娟，沈苗苗，于曉南.觀賞芍藥‘大富貴’叢生芽誘導(dǎo)及生根技術(shù).東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，39(9):20-22.)、‘芍藥不同品種啟動(dòng)培養(yǎng)比較及‘朱砂判’叢生芽誘導(dǎo)的研究’(吳紅娟，于曉南.芍藥不同品種啟動(dòng)培養(yǎng)比較及‘朱砂判’叢生芽誘導(dǎo)的研究.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010, 31 (4): 29-33.)報(bào)道了以地下休眠芽為外植體誘導(dǎo)叢生芽的方法，該方法對于優(yōu)良品種的擴(kuò)繁存在3點(diǎn)不足:①一個(gè)植株所包含的地下休眠芽數(shù)量有限，以其為外植體的繁殖效率不高每株組培苗只能產(chǎn)生3?5個(gè)叢生芽，繁殖系數(shù)不高；③整個(gè)過程必須經(jīng)歷一個(gè)地下芽啟動(dòng)培養(yǎng)的過程，耗費(fèi)大量的人力、物力，提高成本。胡映泉等人發(fā)表的論文‘芍藥不定芽的誘導(dǎo)技術(shù)’(胡映泉，馮海華，時(shí)寶凌.芍藥不定芽的誘導(dǎo)技術(shù)，山西林業(yè)科技，2003，增刊:23-24，33.)對芍藥嫩莖進(jìn)行組織培養(yǎng)，在M S+BA 3.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L培養(yǎng)基上可一步成芽，縮短了成芽時(shí)間，但該論文數(shù)據(jù)較為含糊，統(tǒng)計(jì)的時(shí)間也未作交代，最終芽的誘導(dǎo)率最高只有74%。王吉鳳等人發(fā)表的論文‘5個(gè)芍藥品種愈傷組織誘導(dǎo)及分化研究’(王吉鳳，李青，孟會(huì).5個(gè)芍藥品種愈傷組織誘導(dǎo)及分化研究.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011, 32(3):213-216.)中成功誘導(dǎo)出愈傷組織，并分化出不定芽，但其愈傷褐化嚴(yán)重、玻璃化、易碎，芽分化率低，僅有7.95%。孫曉梅等人發(fā)表的論文‘芍藥愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化的研究’(孫曉梅，程婉，劉萍，周文強(qiáng)，王丹，楊宏光.芍藥愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化的研究.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014-02，45(1):24-27.)對芍藥子葉、莖、葉片進(jìn)行培養(yǎng)，以基部莖為最優(yōu)的不定芽分化外植體，但分化率只有35%，且需經(jīng)過愈傷誘導(dǎo)階段。綜上所述，在芍藥組織培養(yǎng)過程中，前人均成功分化出不定芽，但是他們多以種胚、地下休眠芽、莖段等為外植體，不僅分化率低，而且繼代次數(shù)多(分兩步實(shí)施)，實(shí)驗(yàn)過程繁瑣，周期較長，并不能獲得理想的效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明為了解決芍藥組培過程中的關(guān)鍵技術(shù)問題，提供了一種以芍藥葉片為外植體一步成芽的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法，為芍藥優(yōu)良品種快繁提供技術(shù)支撐。
[0005]本發(fā)明采用的芍藥葉片組織培養(yǎng)直接成芽的培養(yǎng)基，其特征在于，改良MS基本培養(yǎng)基，添加TDZ 0.1?3.0mg-L '+椰汁5?15%，附加蔗糖30g-L \水解酪蛋白600mg-L1,瓊脂 6.4g.L SpH 為 5.8。
[0006]本發(fā)明還公開了一種芍藥葉片組織培養(yǎng)直接成芽的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟:3月下旬選取幼嫩的芍藥葉片；滅菌后接種于培養(yǎng)基上溫度25±2°C，暗培養(yǎng)2個(gè)月，獲得不定芽；所述培養(yǎng)基是改良MS基本培養(yǎng)基，添加TDZ 0.1?3.0mg-L1+椰汁5?15%，附加蔗糖30g.L \水解酪蛋白600mg.L \瓊脂6.4g.L \ pH為5.8。
[0007]所述葉片滅菌處理采用酒精與升汞相結(jié)合的滅菌方法采用酒精與升汞相結(jié)合的滅菌方法，具體步驟如下:
[0008]①先將幼嫩葉片在流水中沖洗lOmin，去除外部泥土，再用洗潔精清洗一下，流水沖洗干凈；
[0009]②將幼嫩葉片置于超凈工作臺(tái)上，放置于燒杯中，用75%酒精消毒30s，無菌水反復(fù)沖洗5?6次；
[0010]③再用0.1 %升汞消毒3min，無菌水反復(fù)沖洗5?6次；
[0011]④外植體置于無菌濾紙上吸干水分，切去葉片的邊緣部分和主脈，切成IcmXlcm的大小接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，為避免交叉感染，每瓶接種3個(gè)葉片。
[0012]本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在:
[0013](I)本發(fā)明中芍藥葉片出芽率最高可達(dá)85%，克服了芍藥葉片經(jīng)過愈傷組織分化不定芽困難的技術(shù)障礙。
[0014](2)本發(fā)明中芍藥葉片組織培養(yǎng)不經(jīng)過愈傷組織階段直接一步成芽，避免了因多次繼代而耗費(fèi)人力、物力的問題，縮短了芍藥再生的時(shí)間，同時(shí)減少了轉(zhuǎn)接過程中的污染危害。
[0015](3)本發(fā)明中每張接種的葉片可以形成3-8個(gè)不定芽，提高了繁殖系數(shù)。
【附圖說明】
[0016]圖1是接種于培養(yǎng)基上的芍藥葉片。
[0017]圖2是不定芽形成過程。
【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施例1
[0019]以栽植于揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院芍藥種質(zhì)資源圃中的芍藥托桂型品種‘紫鳳羽’為試材來開展本研究工作:
[0020](I)取材時(shí)間:2014年3月28日；
[0021](2)選材:選取幼嫩的葉片；
[0022](3)葉片的滅菌及接種:
[0023]嫩葉采回來后，采用酒精與升汞相結(jié)合的滅菌方法，具體步驟如下:
[0024]①先將幼嫩葉片在流水中沖洗lOmin，去除外部泥土，再用洗潔精(上海和黃白貓有限公司)清洗一下，流水沖洗干凈；
[0025]②將幼嫩葉片置于超凈工作臺(tái)上，放置于燒杯中，用75%酒精消毒30s，無菌水反復(fù)沖洗5?6次；
[0026]③再用0.1%升汞(上海中西化工廠)消毒3min，無菌水反復(fù)沖洗5?6次；
[0027]④外植體置于無菌濾紙上吸干水分，切去葉片的邊緣部分和主脈，切成IcmXlcm的大小接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，為避免交叉感染，每瓶接種3個(gè)葉片，共接種200瓶。
[0028](4)培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)方法:
[0029]①培養(yǎng)基配方:改良MS基本培養(yǎng)基，添加TDZ 1.0mg.L1+椰汁5 %，附加蔗糖30g.L \水解絡(luò)蛋白600mg.L、瓊脂6.4g.L、pH為5.8。TDZ購于北京索萊寶科技有限公司、蔗糖購于上海實(shí)驗(yàn)試劑有限公司、水解酪蛋白購于生工生物工程(上海)股份有限公司、瓊脂購于北京索萊寶科技有限公司、椰汁購于上海嘉果食品有限公司。
[0030]本發(fā)明中改良MS基本培養(yǎng)基配方為:
[0031]大量元素
[0032]硝酸鉀KNO3 250mg/L
[0033]硝酸銨NH4NO3 500mg/L
[0034]磷酸二氫鉀KH2PO4 550mg/L
[0035]硫酸鎂MgSO4.7H20 250mg/L
[0036]硝酸鈣Ca (NO3) 2.4H20 500mg/L
[0037]微量元素
[0038]碘化鉀KI 0.83mg/L
[0039]硼酸H3BO3 6.2mg/L
[0040]硫酸錳MnSO4.4H20 22.3mg/L
[0041]硫酸鋅ZnSO4.7H20 8.6mg/L
[0042]鉬酸鈉Na2MoO4.2H20 0.25mg/L
[0043]硫酸銅CuSO4.5H20 0.025mg/L
[0044]氯化鈷CoCl2.6H20 0.025mg/L
[0045]鐵鹽
[0046]乙二胺四乙酸二鈉Na2.EDTA 37.3mg/L
[0047]硫酸亞鐵FeSO4.7H20 27.8mg/L
[0048]有機(jī)成分
[0049]肌醇100mg/L
[0050]甘氨酸2mg/L
[0051]鹽酸硫胺素VB10.lmg/L
[0052]鹽酸吡哆醇VB60.5mg/L
[0053]煙酸VB50.5mg/L
[0054]鹿糖30g/L
[0055]瓊脂6.4g/L。
[0056]②培養(yǎng)條件:溫度25 ± 2°C，暗培養(yǎng)2個(gè)月。
[0057](5)統(tǒng)計(jì)指標(biāo)及方法:外植體在組培室培養(yǎng)60d后開始統(tǒng)計(jì)長芽和褐化情況。
[0058]出芽率=出芽的組織數(shù)/接種葉片總數(shù)X 100 % ;
[0059]褐化率=褐化的組織數(shù)/接種葉片總數(shù)X 100%。
[0060](6)結(jié)果:將如圖1所示IcmX Icm大小的葉片接種于芽分化培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)，1.5?2個(gè)月可以觀察到如圖2所示形成的不定芽初，葉片出芽率可達(dá)84.60%，每張葉片可形成3-8個(gè)不定芽，褐化率僅為1.93%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種芍藥葉片組織培養(yǎng)直接成芽的培養(yǎng)基，其特征在于，改良MS基本培養(yǎng)基，添加TDZ 0.1?3.0mg.L '+椰汁5?15%，附加蔗糖30g.L \水解酪蛋白600mg.L 瓊脂6.4g.L \ pH 為 5.8。2.—種芍藥葉片組織培養(yǎng)直接成芽的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟:3月下旬選取幼嫩的芍藥葉片；滅菌后接種于培養(yǎng)基上溫度25±2°C，暗培養(yǎng)2個(gè)月，獲得不定芽；所述培養(yǎng)基是改良MS基本培養(yǎng)基，添加TDZ 0.1?3.0mg.L '+椰汁5?15%，附加蔗糖30g.L \ 水解酪蛋白 600mg.L \ 瓊脂 6.4g.L \ pH 為 5.8。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述葉片滅菌處理采用酒精與升汞相結(jié)合的滅菌方法，具體步驟如下: ①先將幼嫩葉片在流水中沖洗lOmin，去除外部泥土，再用洗潔精清洗一下，流水沖洗干凈; ②將幼嫩葉片置于超凈工作臺(tái)上，放置于燒杯中，用75%酒精消毒30s，無菌水反復(fù)沖洗5?6次； ③再用0.1 %升汞消毒3min，無菌水反復(fù)沖洗5?6次； ④外植體置于無菌濾紙上吸干水分，切去葉片的邊緣部分和主脈，切成IcmXIcm的大小接種于培養(yǎng)基上，為避免交叉感染，每瓶接種3個(gè)葉片。
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物的組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種芍藥葉片組織培養(yǎng)直接成芽的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。該方法是在3月下旬選取幼嫩的芍藥葉片；滅菌后接種于培養(yǎng)基上溫度25±2℃，暗培養(yǎng)2個(gè)月，獲得不定芽；所述培養(yǎng)基是改良MS基本培養(yǎng)基，添加TDZ？0.1～3.0mg·L-1+椰汁5～15％，附加蔗糖30g·L-1，水解酪蛋白600mg·L-1，瓊脂6.4g·L-1，pH為5.8。利用該方法可以使芍藥葉片出芽率最高可達(dá)85％，有效地解決了問題，節(jié)約了人力、物力，縮短了芍藥再生的時(shí)間，為芍藥優(yōu)良品種快繁提供技術(shù)支撐，市場前景廣闊。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號(hào)】CN105123517
【申請?zhí)枴緾N201510525936
【發(fā)明人】陶俊, 趙大球, 王靜, 史旻, 周春華
【申請人】揚(yáng)州大學(xué)
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年8月25日