一種細(xì)胞凍存液及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種細(xì)胞凍存液及其制備方法和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem Cell,NSC)是存在于胚胎或成體腦、脊髓等組織中的一 種干細(xì)胞，是一類具有分裂潛能和自我更新能力的母細(xì)胞.可通過(guò)不對(duì)等的分裂方式分化 成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等神經(jīng)組織的各類細(xì)胞，也可轉(zhuǎn)分化成血細(xì)胞和骨 骼肌細(xì)胞。在腦、脊髓等所有神經(jīng)組織中，不同的神經(jīng)干細(xì)胞類型產(chǎn)生的子代細(xì)胞種類不 同，分布也不同。雖然該細(xì)胞利用廣泛，但要廣泛地應(yīng)用于臨床治療領(lǐng)域，其來(lái)源和數(shù)量仍 遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需求。因此神經(jīng)干細(xì)胞的體外大規(guī)模擴(kuò)增，W及將擴(kuò)增后的細(xì)胞進(jìn)行冷凍保 存，是本領(lǐng)域技術(shù)人員迫切的需求。
[0003] 細(xì)胞凍存的過(guò)程會(huì)顯著改變細(xì)胞的熱力學(xué)、化學(xué)和物理環(huán)境，同時(shí)伴隨生物性損 傷的危險(xiǎn)。影響凍存效率的因素主要有:細(xì)胞濃度、冷凍速率W及凍存液。目前，神經(jīng)干細(xì)胞 凍存使用的凍存液有含血清和無(wú)血清的兩類，由于血清具有成分復(fù)雜、質(zhì)量不穩(wěn)定、價(jià)格昂 貴等缺點(diǎn)，無(wú)血清凍存和復(fù)蘇技術(shù)成為發(fā)展趨勢(shì)。低溫保存干細(xì)胞主要依靠抗凍液二甲基 亞諷(DMS0)和血清的保護(hù)。常用到的細(xì)胞保護(hù)劑還有徑乙基淀粉0ES)、聚乙二醇(PEG)等。 但是，DMS0會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，對(duì)凍存的干細(xì)胞造成不可逆的損傷。為獲得來(lái)源方便的 神經(jīng)干細(xì)胞，開(kāi)展有效的神經(jīng)干細(xì)胞凍存方法是本領(lǐng)域迫切的需求，建立一種長(zhǎng)期低溫保 存神經(jīng)干細(xì)胞的方法對(duì)于促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的研巧和應(yīng)用具有重大意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種細(xì)胞冷凍保存液W及相應(yīng)的制備方法及使 用方法。
[000引本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0006] -種細(xì)胞冷凍保存液，其特征在于由如下各組分組成:其特征是冷凍存液中含有： 二甲基亞諷8%w/v，淫羊蕾總黃酬30ng/ml，多膚1 %w/v，bFGFl %w/v，維生素 E1 %w/v，最后 用DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，所述多膚的序列如SEQ ID NO: 1或2 所示。
[0007] 抗氧化抗凍膚沈Q ID N0:1:孤PAFVDKPPI犯化EHA;
[000引 抗氧化抗凍膚沈Q ID N0:2:NADRinTQFNSGPPLGP。
[0009] 在本發(fā)明的細(xì)胞的凍存液中，黃酬類物質(zhì)W及維生素 E和多膚具有明確的抗氧化、 可W抵御自由基對(duì)細(xì)胞的損傷，特別是多膚，還具有保護(hù)細(xì)胞免受凍存時(shí)冰結(jié)晶對(duì)細(xì)胞的 損傷。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種細(xì)胞的凍存液的制備方法，即將所述各組分混合搖勻即成。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種神經(jīng)細(xì)胞凍存方法，包括W下步驟：
[0012] A.凍存液制備：制備所述的細(xì)胞凍存液，將各組分按照常規(guī)的操作方法將各組分 按照相應(yīng)的比例混合即可獲得；
[0013] B.細(xì)胞懸液制備:培養(yǎng)生長(zhǎng)成單層的神經(jīng)細(xì)胞一瓶，0.20 %膜蛋白酶液消化4分 鐘，棄膜酶液，加入DMEM培養(yǎng)液15ml，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，離屯、4000轉(zhuǎn)/分，棄上清， 加入步驟A凍存液2ml，混均，置入無(wú)菌的凍存管內(nèi)；
[0014] C.冷凍:先將凍存管在4°C下凍存30min，然后放入-30°c凍存化，再放入-80°c凍存 3h，最后移入液氮中保存；
[001引D.細(xì)胞復(fù)蘇:取出凍存管快速置于37°C水浴，震蕩直至細(xì)胞懸液完全融化，然后用 5倍DMEM液稀釋，10(K)r/min離屯、5min，離屯、去除上清液，再重復(fù)3次所述細(xì)胞懸浮濃度為108 細(xì)胞/na-i0w細(xì)胞/ml。
[0016] 本發(fā)明的有益效果：
[0017] 本發(fā)明的細(xì)胞凍存液，復(fù)蘇細(xì)胞存活率可達(dá)99% W上，較使用常規(guī)細(xì)胞凍存液的 復(fù)蘇存活率有了顯著提高，基本上沒(méi)有細(xì)胞的損耗。
[0018] 本發(fā)明的干細(xì)胞凍存液可W長(zhǎng)期保存干細(xì)胞，細(xì)胞活性不發(fā)生變化，保證了細(xì)胞 生物學(xué)活性。
[0019] 本發(fā)明神經(jīng)細(xì)胞凍存方法，操作簡(jiǎn)單可行，價(jià)格適宜，具有較好的實(shí)用價(jià)值
【具體實(shí)施方式】
[0020] 實(shí)施例1細(xì)胞凍存液的制備
[0021 ] 將二甲基亞諷8 %w/v，淫羊蕾總黃酬30ng/ml，多膚1 %w/v，bFGFl %w/v，維生素 El %w/v，用DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例溶解，定容至100ml，即得到所述的細(xì)胞 凍存液，其中所述多膚的序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0022] 實(shí)施例2干細(xì)胞凍存液的制備
[0023] 將二甲基亞諷8 %w/v，淫羊蕾總黃酬30ng/ml，多膚1 %w/v，bFGFl %w/v，維生素 El %w/v，用DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例溶解，定容至100ml，即得到所述的細(xì)胞 凍存液，其中所述多膚的序列如SEQ ID N0:2所示。
[0024] 實(shí)施例3干細(xì)胞凍存液的制備
[0025] 將二甲基亞諷8 %w/v，淫羊蕾總黃酬30ng/ml，多膚1 %w/v，bFGFl %w/v，維生素 El %w/v，用DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例溶解，定容至100ml，即得到所述的細(xì)胞 凍存液，其中所述多膚的序列如SEQ ID NO: 1和2所示，二者等比例混合得到。
[0026] 比較例I
[0027] 分別量取70ml的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液、20ml的小牛血清、lOml的二甲基亞諷，混合制得 常規(guī)細(xì)胞凍存液。
[0028] 實(shí)施例4凍存液的效果驗(yàn)證
[0029] W上實(shí)施例1-3及比較例I所制備的細(xì)胞凍存液，分別按照下述方法進(jìn)行細(xì)胞凍存 和復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)。
[0030] 細(xì)胞凍存過(guò)程：
[0031] 培養(yǎng)生長(zhǎng)成單層的VER0、KMB17和神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞各9瓶，其細(xì)胞密度約6X 109個(gè)/ ml，加入抑7.0的PBS洗細(xì)胞表面一次。
[0032] 將細(xì)胞用0.20 %膜蛋白酶液消化4分鐘，棄膜酶液，加入DMM培養(yǎng)液15ml，用吸管 輕輕吹打使細(xì)胞均勻，離屯、4000轉(zhuǎn)/分，棄上清，加入實(shí)施例1-3和比較例1所制備的凍存液 2ml，混均，置入無(wú)菌的凍存管內(nèi)；
[0033] 冷凍：先將凍存管在4°C下凍存30min，然后放入30°C凍存化，再放入80°C凍存化， 最后移入液氮中保存;分別凍存1月，6個(gè)月，2年。沒(méi)組3個(gè)重復(fù)。
[0034] 細(xì)胞復(fù)蘇:取出凍存管快速置于37°C水浴，震蕩直至細(xì)胞懸液完全融化，然后用5 倍DMEM液稀釋，100化/min離屯、5min，離屯、去除上清液，再重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞存活率。結(jié)果如 下：
[0035]
[0037]取6個(gè)月的凍存細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞分化培養(yǎng)，其中所述的神經(jīng)細(xì)胞能夠正常進(jìn)行分 化，分化效率達(dá)到90.7%，而比較例取出的細(xì)胞其分化率只能達(dá)到60.2%，說(shuō)明細(xì)胞活性收 到很大的影響。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種細(xì)胞凍存液，其特征在于，其特征在于由如下各組分組成:其特征是冷凍存液中 含有:二甲基亞砜8%w/v，淫羊藿總黃酮30ng/ml，多肽l%w/v，bFGFl%w/v，維生素E1% w/v，最后用DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml。2. 權(quán)利要求1所述的細(xì)胞凍存液的制備方法，其特征在于，包括混合所述配方比例的組 分，得到所述的凍存液。3. 權(quán)利要求1所述的細(xì)胞凍存液在提高凍存細(xì)胞復(fù)蘇后存活率中的應(yīng)用。4. 一種神經(jīng)細(xì)胞凍存方法，其特征在于，包括以下步驟： A. 凍存液制備:制備權(quán)利要求1所述的細(xì)胞凍存液，將各組分按照常規(guī)的操作方法將各 組分按照相應(yīng)的比例混合； B. 細(xì)胞懸液制備:培養(yǎng)生長(zhǎng)成單層的神經(jīng)細(xì)胞一瓶，0.20 %胰蛋白酶液消化4分鐘，棄 胰酶液，加入DMEM培養(yǎng)液15ml，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，離心4000轉(zhuǎn)/分，棄上清，加入 步驟A凍存液2ml，混均，置入無(wú)菌的凍存管內(nèi)： C. 冷凍:先將凍存管在4°C下凍存30min，然后放入-30°C凍存lh，再放入-80°C凍存3h， 最后移入液氮中保存； D. 細(xì)胞復(fù)蘇：取出凍存管快速置于37°C水浴，震蕩直至細(xì)胞懸液完全融化，然后用5倍 DMEM液稀釋，1000r/min離心5min，離心去除上清液，再重復(fù)3次。所述細(xì)胞懸浮濃度為108細(xì) 胞細(xì)胞/ml。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種細(xì)胞凍存液及其制備方法。該細(xì)胞凍存液包括，二甲基亞砜8％w/v，淫羊藿總黃酮30ng/ml，多肽1％w/v，bFGF？1％w/v，維生素E？1％w/v。本發(fā)明提供的細(xì)胞凍存液用于凍存培養(yǎng)細(xì)胞，特別是提高了凍存細(xì)胞復(fù)蘇后的存活率。并且本發(fā)明的凍存液具有價(jià)格適宜操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)適宜廣泛利用。
【IPC分類】A01N1/02
【公開(kāi)號(hào)】CN105454222
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610068837
【發(fā)明人】張?jiān)茋?guó), 耿曉波, 朱學(xué)義, 趙明宇, 王小龍, 張雪梅
【申請(qǐng)人】河南省銀豐生物工程技術(shù)有限公司
【公開(kāi)日】2016年4月6日
【申請(qǐng)日】2016年2月2日