光培養(yǎng)的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，由于培養(yǎng)總時(shí)間的變化，褐化率與萌芽率均發(fā)生變 化。
[0041 ]所述暗培養(yǎng)條件:溫度22-25°C;所述光培養(yǎng)條件為:溫度22-25°C，光照強(qiáng)度1500-200化X，光照時(shí)間12h/d，固體培養(yǎng)基暗培養(yǎng)12d，暗培養(yǎng)與光培養(yǎng)培養(yǎng)總時(shí)間15d，褐化率為 63.8%，萌芽率達(dá)到38.2%。
[0042] 實(shí)施例10到16
[0043] 根據(jù)暗培養(yǎng)與光培養(yǎng)總時(shí)間的變化，得到W下數(shù)據(jù)。
[0044]
[0045] 由上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得知，在暗培養(yǎng)條件:溫度22-25°C;光培養(yǎng)條件為:溫度22-25°C， 光照強(qiáng)度1500-200化X，光照時(shí)間12h/d，固體培養(yǎng)基暗培養(yǎng)時(shí)間為12d，暗培養(yǎng)與光培養(yǎng)培 養(yǎng)總時(shí)間在20-30d的情況下，效果相對較好，萌芽率較高。
[0046] 實(shí)施例17
[0047] 與常規(guī)方法進(jìn)行比較試驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：
[004引1、取生長健壯的嫩綠色茶樹幼葉為外植體；
[0049] 2、將茶樹幼葉用70%的酒精消毒10s，無菌水沖洗1遍；用10%次氯酸鋼消毒 15m i n，無菌水沖洗4遍；
[0050] 3、將消毒完的外植體去掉葉柄，剪下葉片，用解剖刀切成0.TmmXO.7mm小塊。
[0051] 將處理步驟2的外植體接種在含瓊脂的固體培養(yǎng)基上，每個瓶子接種6個小塊，接 種后放入培養(yǎng)室中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。
[0052] ^培養(yǎng)基為:15+4111旨/16-84+1.〇111旨/1184+薦糖30旨+瓊脂粉7旨，9巧直調(diào)至5.8，配 制好的培養(yǎng)基分裝在250mL的培養(yǎng)瓶中，高溫滅菌25min。
[0053] 將所述外植體接種于液體培養(yǎng)基暗培養(yǎng)3d后轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基暗培養(yǎng)，培養(yǎng)條件 為：溫度22°C，光照強(qiáng)度1500LX，光照時(shí)間12h/d，培養(yǎng)總時(shí)間20d，處理步驟2褐化率達(dá)到 75.4%，萌芽率僅為24.6%。
[0054] 本發(fā)明通過將外植體在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時(shí)間后，再將其轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基培 養(yǎng)，進(jìn)行液固共培養(yǎng)有3方面的優(yōu)勢：
[0055] 1、液體培養(yǎng)基稀釋了外植體內(nèi)部酪類物質(zhì)，使酪類物質(zhì)抑制出芽和產(chǎn)生褐變的不 利影響降至最低；
[0056] 2、液體培養(yǎng)基與外植體上下表面充分接觸、營養(yǎng)物質(zhì)更易吸收、生長調(diào)節(jié)劑更易 發(fā)揮作用；
[0057] 3、液體培養(yǎng)基流動性強(qiáng)、內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)能夠達(dá)到一個動態(tài)平衡。
[0058] 植物組織培養(yǎng)采用暗培養(yǎng)的原因：愈傷組織的培養(yǎng)分為兩個階段，一是脫分化培 養(yǎng)階段，二是再分化培養(yǎng)階段。脫分化培養(yǎng)階段：由于光會阻礙組織的脫分化，所W脫分化 培養(yǎng)階段應(yīng)避光培養(yǎng)，在無光的條件下愈傷組織長得更快。脫分化培養(yǎng)階段一般為2周，然 后必須更換培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，因?yàn)?周后培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分已接近耗盡。
[0059] 脫分化培養(yǎng)階段植物細(xì)胞在光照條件下會自發(fā)進(jìn)行光合作用，同時(shí)還要完成自身 修復(fù)，愈傷組織光合作用的結(jié)果是生成糖類，但光合作用過程中必然需要分流出一部分物 質(zhì)和能量參與進(jìn)去，從而完成修復(fù)過程的物質(zhì)和能量的總量減少，因而愈傷組織分化和生 長變慢;愈傷組織在脫分化培養(yǎng)階段，有光容易導(dǎo)致細(xì)胞再分化，不能達(dá)到形成大量愈傷組 織及在短期時(shí)間內(nèi)獲得大量幼苗的目的，但形成愈傷組織后需要光是為了形成葉綠體，葉 綠體進(jìn)行光合作用為愈傷組織分化成芽乃至小苗提供營養(yǎng)。因此本方法避光培養(yǎng)15d，有利 于愈傷組織的形成和后期芽的分化。
[0060] 綜上所述，本發(fā)明將茶樹幼葉外植體消毒后將茶樹幼葉接種于不含瓊脂的液體培 養(yǎng)基上，每瓶接種6個沿垂直葉脈方向橫切5-8刀的茶樹幼葉，并且在切割葉子時(shí)葉緣0.5-Icm處不切斷，將所述外植體接種于液體培養(yǎng)基暗培養(yǎng)3d后轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基上暗培養(yǎng) 12d，茶樹幼葉沿垂直葉脈方向橫切5-8刀的外植體褐化率為32%，萌芽率高達(dá)68% ;本發(fā)明 利用液固共培養(yǎng)和暗培養(yǎng)相結(jié)合的辦法，明顯降低茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體褐化率，顯 著提高萌芽率和效率。
[0061] 最后應(yīng)說明的是：W上實(shí)施例僅用W說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制;盡管 參照前述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解:其依然可 W對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換； 而運(yùn)些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的精神和 范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種茶樹幼葉組織培養(yǎng)的方法，其特征在于:包括如下步驟： (1) 取生長健壯的嫩綠色茶樹幼葉為外植體； (2) 將所述外植體依次用酒精消毒和次氯酸鈉消毒； (3) 將消毒后的外植體沿垂直于葉脈的方向橫切數(shù)刀且不切斷； (4) 將所述外植體接種于經(jīng)過滅菌后的液體培養(yǎng)基，再放入培養(yǎng)室中進(jìn)行暗培養(yǎng)，最后 轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基進(jìn)行暗培養(yǎng);所述液體培養(yǎng)基的pH值為5.4-5.8，具體組成為:MS+4. Omg/ L 6-BA+l.Omg/L IBA+鹿糖30g。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶樹幼葉組織培養(yǎng)的方法，其特征在于：步驟(2)中用酒精消 毒和次氯酸鈉消毒后，分別以無菌水進(jìn)行沖洗。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的茶樹幼葉組織培養(yǎng)的方法，其特征在于:將所述消毒后的外植 體沿垂直葉脈方向橫切5-8刀。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的茶樹幼葉組織培養(yǎng)的方法，其特征在于:所述外植體接種于裝 有50ml培養(yǎng)基的250mL培養(yǎng)瓶中，每瓶接種5~6片所述外植體。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的茶樹幼葉組織培養(yǎng)的方法，其特征在于:步驟(4)中所述培 養(yǎng)具體為:將所述外植體接種于液體培養(yǎng)基暗培養(yǎng)3d后轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基暗培養(yǎng)ll-13d。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的茶樹幼葉組織培養(yǎng)的方法，其特征在于:所述固體培養(yǎng)基為MS +4.0mg/L 6-BA+1.0mg/L IBA+鹿糖30g+瓊脂粉7g。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的茶樹幼葉組織培養(yǎng)的方法，其特征在于：暗培養(yǎng)后進(jìn)行光培 養(yǎng)。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的茶樹幼葉組織培養(yǎng)的方法，其特征在于:所述暗培養(yǎng)條件:溫 度 22-25。。。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的茶樹幼葉組織培養(yǎng)的方法，其特征在于:所述光培養(yǎng)條件為： 溫度22-25°C，光照強(qiáng)度1500-2000LX，光照時(shí)間12h/d，所述暗培養(yǎng)與光培養(yǎng)培養(yǎng)總時(shí)間20-30d〇
【專利摘要】本發(fā)明屬于茶樹組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種茶樹組織培養(yǎng)的方法。本發(fā)明公開了一種茶樹幼葉組織培養(yǎng)的方法，其方法是將消毒后的茶樹幼葉外植體接種于不含瓊脂的液體培養(yǎng)基上，所述外植體在切割時(shí)，葉緣0.5-1cm處不切斷，再將所述外植體接種于液體培養(yǎng)基暗培養(yǎng)3d后轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)11-13d，通過這種方法處理過的外植體褐化率為32％，萌芽率高達(dá)68％；本發(fā)明利用液固共培養(yǎng)和暗培養(yǎng)相結(jié)合的辦法，明顯降低茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體褐化率，顯著提高萌芽率和效率。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105494107
【申請?zhí)枴緾N201610104404
【發(fā)明人】田麗麗, 黃建安, 劉仲華, 李娟 , 林海燕
【申請人】湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2016年2月25日