一種人參娃兒藤兩步成苗組織培養(yǎng)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種植物兩步成苗組織培養(yǎng)的方法，特別一種人參娃兒藤兩步成苗組織培養(yǎng)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人參娃兒藤，中藥名。為蘿蘑科植物人參娃兒藤Tylophorakerrii Craib的根。生于海拔800m以下的草地、山谷、溪旁、密蔭灌木叢下，分布于中國、越南、泰國。產(chǎn)于貴州、云南、廣西、廣東和福建等省區(qū)。具有清肝明目，行氣止痛之功效，常用于兩目視物昏花、脘腹脹痛、牙痛、胃脘痛、肝硬化腹水、癌癥、毒蛇咬傷、跌打損傷、風(fēng)濕痹痛。
[0003]目前對娃兒藤屬植物的研究主要集中于其中所含的生物堿類成分。研究表明，從娃兒藤屬植物中分離得到的娃兒藤堿(Tylophorine )、異娃兒藤堿(Tylocrebrine )、娃兒藤寧堿(Ty 1phorinine)的抗癌活性相當(dāng)顯著;Ganguly等人研究發(fā)現(xiàn)娃兒藤生物堿具有抗炎、抗過敏、平喘等作用，是很好的藥物資源，具有很高的開發(fā)利用價值。
[0004]現(xiàn)有的人參娃兒藤藥用植物資源極少，而醫(yī)學(xué)上的需求日趨增多，人工繁殖成為開發(fā)利用人參娃兒藤的當(dāng)務(wù)之急。娃兒藤屬植物生物技術(shù)方面研究較少，尚未有人參娃兒藤組織培養(yǎng)相關(guān)報道。本發(fā)明通過對人參娃兒藤帶芽莖段進(jìn)行誘導(dǎo)、不定芽生根建立兩步成苗組織培養(yǎng)體系，為盡快解決娃兒藤屬藥用植物資源短缺提供快速繁殖的新方法和優(yōu)質(zhì)物種，對進(jìn)一步保護(hù)和開發(fā)娃兒藤屬植物資源具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種人參娃兒藤兩步成苗組織培養(yǎng)的方法，
[0006]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案達(dá)到上述目的:一種人參娃兒藤兩步成苗組織培養(yǎng)的方法，包括以下步驟:
[0007](I)外植體的消毒:取無病蟲害人參娃兒藤帶芽莖段為外植體，用軟紗布蘸洗潔精水溶液擦拭表面污垢，流水沖洗2min，在超凈工作臺內(nèi)用75v/v %的乙醇滅菌30s，無菌水沖洗I次，再用0.15v/v%HgCl2滅菌8min，無菌水浸泡2?3次，最后用無菌濾紙吸干外植體表面水分，獲得外植體，其中無菌水為經(jīng)高溫高壓滅菌的蒸餾水；
[0008](2)無菌芽的誘導(dǎo):將步驟(I)得到的外植體切去兩端，剪切成I?1.5cm的帶芽莖段，接種于MS不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23±2°C，光照強(qiáng)度20?30ymOl/m2.s，光照時間為12h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)7?18d開始萌發(fā)，隨后長出不定芽，所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS為基本培養(yǎng)基，還加入0.2?1.5mg//L的噻重氮苯基脲TDZ、0.3?1.0mg/L萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8;
[0009](4)不定芽的生根:待步驟(2)中得到的不定芽長至3?5cm時，將其剪成兩段帶芽莖段接種到1/2MS生根培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23±2°C，光照強(qiáng)度20?30ymOl/m2.s，光照時間為12h/d的條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)20?30d開始生根，所述生根培養(yǎng)基是以1/2MS為基本培養(yǎng)基，還加入O?0.5mg/L的吲哚乙酸ΙΑΑ、0?1.01^/1的吲哚丁酸184，0.5?1.58/1的活性炭，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8。
[0010]本發(fā)明的突出優(yōu)點在于:
[0011](I)本發(fā)明利用生物技術(shù)方法實現(xiàn)了一種人參娃兒藤兩步成苗組織培養(yǎng)的方法。該方法可篩選安全可供藥用的優(yōu)質(zhì)種苗，降低生產(chǎn)成本，為娃兒藤屬植物資源的可持續(xù)開發(fā)利用提供新途徑。
[0012](2)采用本發(fā)明所述的兩步成苗組織培養(yǎng)的方法，外植體消毒培養(yǎng)7d便開始長出不定芽，30d出芽率為87.5%,生根率為81.3%。
【具體實施方式】
[0013]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)一步說明。
[0014]實施例1
[0015](I)外植體的消毒:取無病蟲害人參娃兒藤帶芽莖段為外植體，用軟紗布蘸洗潔精水溶液擦拭表面污垢，流水沖洗2min，在超凈工作臺內(nèi)用75v/v %的乙醇滅菌30s，無菌水沖洗I次，再用0.15v/v%HgCl2滅菌8min，無菌水浸泡2?3次，最后用無菌濾紙吸干外植體表面水分，獲得外植體，其中無菌水為經(jīng)高溫高壓滅菌的蒸餾水。
[0016](2)無菌芽的誘導(dǎo):將步驟(I)得到的外植體切去兩端，剪切成I?1.5cm的帶芽莖段，接種于MS不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在培養(yǎng)溫度23 土2°C，光照強(qiáng)度20?30ymol/V.s，光照時間為12h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)18d開始萌發(fā)，隨后長出不定芽。所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS為基本培養(yǎng)基，還加入0.2mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、1.0mg/L萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8，培養(yǎng)30d，誘導(dǎo)率為68.8 %。
[0017](4)不定芽的生根:待步驟(2)中得到的不定芽長至3?5cm時，將其剪成兩段帶芽莖段接種到1/2MS生根培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23±2°C，光照強(qiáng)度20?30ymol/V.s，光照時間為12h/d的條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)30d開始生根。所述生根培養(yǎng)基是以1/2MS為基本培養(yǎng)基，還加入0.5mg/L的吲哚乙酸IAA、0.5g/L的活性炭，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8，培養(yǎng)30d，生根率為62.5 %。
[0018]實施例2
[0019](I)外植體的消毒:取無病蟲害人參娃兒藤帶芽莖段為外植體，用軟紗布蘸洗潔精水溶液擦拭表面污垢，流水沖洗2min，在超凈工作臺內(nèi)用75v/v %的乙醇滅菌30s，無菌水沖洗I次，再用0.15v/v%HgCl2滅菌8min，無菌水浸泡2?3次，最后用無菌濾紙吸干外植體表面水分，獲得外植體，其中無菌水為經(jīng)高溫高壓滅菌的蒸餾水。
[0020](2)無菌芽的誘導(dǎo):將步驟(I)得到的外植體切去兩端，剪切成I?1.5cm的帶芽莖段，接種于MS不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在培養(yǎng)溫度為23±2°C，光照強(qiáng)度20?30μπκ)1/ν.s，光照時間為12h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)7d開始萌發(fā)，隨后長出不定芽。所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS為基本培養(yǎng)基，還加入1.011^/1的噻重氮苯基脲了02、0.31^/1萘乙酸熟4，3(^/1蔗糖，58/1的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8，培養(yǎng)30d，誘導(dǎo)率為87.5 %。
[0021](4)不定芽的生根:待步驟(2)中得到的不定芽長至3?5cm時，將其剪成兩段帶芽莖段接種到1/2MS生根培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度23±2°C，光照強(qiáng)度20?30ymol/V.s，光照時間為12h/d的條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)22d開始生根。所述生根培養(yǎng)基是以1/2MS為基本培養(yǎng)基，還加入0.lmg/L的吲哚乙酸ΙΑΑ、0.5mg/L的吲哚丁酸IBA、1.5g/L的活性炭，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8，培養(yǎng)30d，生根率為81.3 %。
[0022]實施例3
[0023](I)外植體的消毒:取無病蟲害人參娃兒藤帶芽莖段為外植體，用軟紗布蘸洗潔精水溶液擦拭表面污垢，流水沖洗2min，在超凈工作臺內(nèi)用75v/v %的乙醇滅菌30s，無菌水沖洗I次，再用0.15v/v%HgCl2滅菌8min，無菌水浸泡2?3次，最后用無菌濾紙吸干外植體表面水分，獲得外植體，其中無菌水為經(jīng)高溫高壓滅菌的蒸餾水。
[0024](2)無菌芽的誘導(dǎo):將步驟(I)得到的外植體切去兩端，剪切成I?1.5cm的帶芽莖段，接種于MS不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在培養(yǎng)溫度23 土2°C，光照強(qiáng)度20?30ymol/V.s，光照時間為12h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)9d開始萌發(fā)，隨后長出不定芽。所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS為基本培養(yǎng)基，還加入1.5mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、0.8mg/L萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8，培養(yǎng)30d，誘導(dǎo)率為71.9 %。
[0025](4)不定芽的生根:待步驟(2)中得到的不定芽長至3?5cm時，將其剪成兩段帶芽莖段接種到1/2MS生根培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23±2°C，光照強(qiáng)度20?30ymol/V.s，光照時間為12h/d的條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)25d開始生根。所述生根培養(yǎng)基是以1/2MS為基本培養(yǎng)基，將接種材料置于直徑為25 X 200mm的試管中，還加入0.Smg/!的吲哚丁酸IBA、1.0g/L的活性炭，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8，培養(yǎng)30d，生根率為71.9 %。
[0026]實施例4
[0027](I)外植體的消毒:取無病蟲害人參娃兒藤帶芽莖段為外植體，用軟紗布蘸洗潔精水溶液擦拭表面污垢，流水沖洗2min，在超凈工作臺內(nèi)用75v/v %的乙醇滅菌30s，無菌水沖洗I次，再用0.15v/v%HgCl2滅菌8min，無菌水浸泡2?3次，最后用無菌濾紙吸干外植體表面水分，獲得外植體，其中無菌水為經(jīng)高溫高壓滅菌的蒸餾水。
[0028](2)無菌芽的誘導(dǎo):將步驟(I)得到的外植體切去兩端，剪切成I?1.5cm的帶芽莖段，接種于MS不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在培養(yǎng)溫度23 土2°C，光照強(qiáng)度20?30ymol/V.s，光照時間為12h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)12d開始萌發(fā)，隨后長出不定芽。所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS為基本培養(yǎng)基，還加入1.011^/1的噻重氮苯基脲了02、0.51^/1萘乙酸熟4，3(^/1蔗糖，58/1的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8，培養(yǎng)30d，誘導(dǎo)率為78.1 %。
[0029](4)不定芽的生根:待步驟(2)中得到的不定芽長至3?5cm時，將其剪成兩段帶芽莖段接種到1/2MS生根培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度23±2°C，光照強(qiáng)度20?30ymol/V.s，光照時間為12h/d的條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)28d開始生根。所述生根培養(yǎng)基是以1/2MS為基本培養(yǎng)基，還加入0.5mg/L的卩引噪乙酸IAA、1.0mg/L的卩引噪丁酸IBA、1.5g/L的活性炭，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的PH值為5.8，培養(yǎng)30d，生根率為75 %。
【主權(quán)項】
1.一種人參娃J L藤兩步成苗組織培養(yǎng)的方法，其特征在于:該方法包括以下步驟: (1)外植體的消毒:取無病蟲害人參娃兒藤帶芽莖段為外植體，用軟紗布蘸洗潔精水溶液擦拭表面污垢，流水沖洗2min，在超凈工作臺內(nèi)用75v/v%的乙醇滅菌30s，無菌水沖洗I次，再用0.15v/v%HgCl2滅菌8min，無菌水浸泡2?3次，最后用無菌濾紙吸干外植體表面水分，獲得外植體，其中無菌水為經(jīng)高溫高壓滅菌的蒸餾水； (2)無菌芽的誘導(dǎo):將步驟(I)得到的外植體切去兩端，剪切成I?1.5cm的帶芽莖段，接種于MS不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23±2°C，光照強(qiáng)度20?30ymol/V.s，光照時間為12h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)7?18d開始萌發(fā)，隨后長出不定芽，所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS為基本培養(yǎng)基，還加入0.2?1.5mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、0.3?1.0mg/L萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8; (4)不定芽的生根:待步驟(2)中得到的不定芽長至3?5cm時，將其剪成兩段帶芽莖段接種到1/2MS生根培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23±2°C，光照強(qiáng)度20?30ymol/V.s，光照時間為12h/d的條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)20?30d開始生根，所述生根培養(yǎng)基是以1/2MS為基本培養(yǎng)基，還加入O?0.5mg/L的卩引噪乙酸ΙΑΑ、0?1.0mg/L的卩引噪丁酸ΙΒΑ，0.5?1.5g/L的活性炭，5g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8。
【專利摘要】一種人參娃兒藤兩步成苗組織培養(yǎng)的方法，包括如下步驟：(1)以無病蟲害人參娃兒藤帶芽莖段作為外植體進(jìn)行消毒；(2)將消毒后的外植體置于MS基本培養(yǎng)中培養(yǎng)誘導(dǎo)出不定芽；(3)將不定芽置于添加不同生長素的MS基本培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，得到生根苗。利用本發(fā)明的方法，為盡快解決娃兒藤屬藥用植物資源短缺提供快速繁殖的新方法和優(yōu)質(zhì)物種，對進(jìn)一步保護(hù)和開發(fā)娃兒藤屬植物資源具有重要意義。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105532453
【申請?zhí)枴緾N201510908484
【發(fā)明人】韋瑩, 韋坤華, 黃雪彥, 黃寶優(yōu), 繆劍華, 白隆華, 李林軒
【申請人】廣西壯族自治區(qū)藥用植物園
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2015年12月9日