養(yǎng)濾液等體積的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取 液，減壓蒸餾干燥，再用ImL乙腈溶解，轉移到新離心管中，再蒸餾干燥，在溫度-20°C下保存 待測。檢測時加入100LTMS衍生化試劑(TMSI:TMCS= 100:1)，混勻IOmin后加入ImL超純水， 震蕩分層，吸取上清液加到GC進樣瓶，用裝有電子捕獲監(jiān)測器的氣相色譜(GC-ECD)進行毒 素含量檢測。以Sigma的DON試劑為標樣，建立標準曲線，計算培養(yǎng)液中的DON含量，其中包括 DON、3AD0N和15AD0N。同時將濾出菌絲在溫度80 °C下烘至恒重，稱量菌絲干重。此外，在搖培 7天時取菌絲檢測毒素合成關鍵基因 Tri5的表達水平。
[0073]從表3列出的實驗結果可以發(fā)現，赤霉病菌的菌絲生長量隨著培養(yǎng)時間延長而增 加，但在含有不同劑量井閃霉素處理的培養(yǎng)基中搖培，菌絲生長量與空白對照沒有顯著變 化。說明井閃霉素對液體培養(yǎng)的赤霉病菌的生長沒有抑制作用，與在HM平板上的線性生長 速率測定結果一致。但是，首次發(fā)現單位菌絲重量合成DON毒素的量(yg D0N/g干重菌絲)則 隨井岡霉素處理劑量增加而顯著減少。而且井岡霉素對DON合成的抑制作用隨培養(yǎng)時間延 長而下降，尤其是低濃度處理下降幅度更大。說明井閃霉素隨著試驗時間的延長可能發(fā)生 降解，從而降低了對毒素生物合成的抑制作用。
[0074]根據處理7天時的毒素合成基因表達水平分析，發(fā)現井閃霉素在離體條件下雖然 對鐮刀菌的生長及菌絲形態(tài)沒有不良影響，但在很低處理劑量下能夠強烈抑制DON毒素合 成關鍵基因 tri5表達，降低菌體毒素生物合成能力，減少DON生物合成，其試驗結果列于表4 中。
[0075]表3:井岡霉素抑制鐮刀菌DON毒素合成能力的作用
[0077] 表4:井岡霉素對鐮刀菌DON合成基因 Tri5基因表達的影響
[0079] III.丙硫菌唑對井岡霉素抑制鐮刀菌DON毒素生物合成能力的增效作用 [0080] 丙硫菌唑處理能夠破壞赤霉病菌的細胞膜透性，抑制菌絲生長。丙硫菌唑與井岡 霉素組合物處理時，能夠增加病菌對井閃霉素的吸收利用。在研究內容II測定井閃霉素抑 制鐮刀菌DON毒素生物合成的同時，測定了井岡霉素在存在0.125/mL丙硫菌唑的情況下，培 養(yǎng)7天和14天時對Fusarium asiaticum的DON毒素生物合成能力的抑制作用，分析丙硫菌挫 對井岡霉素抑制DON毒素生物合成的增效作用。DON檢測方法與研究內容II相同。
[0081 ]由研究內容I和II知道，0.125/ml丙硫菌唑單獨處理，對赤霉病菌的菌絲生長的抑 制率接近50%。從表5結果可以看出，0.125/ml丙硫菌唑處理7天和14天時對鐮刀菌毒素的 生物合成能力與空白對照的毒素合成能力沒有顯著的抑制作用，說明丙硫菌唑只有菌絲生 長抑制活性，沒有毒素合成能力的抑制作用。但井閃霉素各處理濃度在0.125/ml丙硫菌唑 存在時，對DON毒素生物合成能力的抑制作用大幅度提高。而且隨著培養(yǎng)時間延長，井岡霉 素對毒素合成能力的抑制作用下降速度顯著低于沒有丙硫菌唑的對照處理，尤其對低濃度 井岡霉素處理的增效及延長作用時間更加明顯。基于同時實驗的表3結果，計算存在丙硫菌 唑0.125/mL劑量情況下，對井閃霉素處理7天和14天時抑制鐮刀菌毒素生物合成的增效作 用，結果列于表5中。這些結果說明：（1)井閃霉素具有強烈降低鐮刀菌DON毒素生物合成能 力的作用，丙硫菌唑則沒有這種作用；（2)丙硫菌唑對井閃霉素抑制鐮刀菌毒素生物合成具 有明顯的增效作用，并隨井閃霉素處理劑量降低，增效作用增強；（3)丙硫菌唑能夠延長井 岡霉素對鐮刀菌毒素合成的抑制作用時間，增效作用隨處理時間延長而增強。
[0082]表5:0.125g/mL丙硫菌唑對井閃霉素抑制小麥赤霉病菌DON毒素合成的增效作用
[0084] *增效系數計算方法:在0.125/ml丙硫菌唑存在下，井岡霉素對毒素合成的抑制率 除以井閃霉素單獨處理相應劑量的毒素合成抑制率(表3)，乘以100。
[0085] IV.井閃霉素與丙硫菌唑組合物懸浮劑種子處理防治小麥苗期赤霉病和其他病害 的效果及增效作用
[0086] 按照井岡霉素與丙硫菌唑的重量比1:1.5、10:1.5、100 :1.5、1:1、10:1、100:1、2: 1、20:1、200:1、5:1、50:1和500:1，分別制備含量為3%(1:1.5、1:1、2:1、）、5%(10:1.5、10: 1、5:1、）、10%(50:1、100:1、20:1、）、20%(100:1.5、200:1、500:1、）的組合物懸浮劑樣品。 樣品制備方法是丙硫菌唑和井閃霉素原藥按照上述重量比混合，加入含以重量計40%水、 8%乙二醇和丙二醇混合溶劑(體積比1:1)、1.0%NN0-1和1.5%NN0-7分散劑(新沂市飛皇 化工有限公司生產）、0.5 %黃原膠粘著劑、1 %聚乙二醇和0.2 %有機硅消泡劑的溶液中，最 后用水補充至1 〇〇 %，經砂磨機粉碎至90 %的藥劑顆粒直徑S 5m。
[0087] 按每IOOkg種子處理用混劑中的單劑用量，設計相應劑量的井岡霉素和丙硫菌唑 單劑用量(見表6)，在播種前分別按100公斤種子用藥液5升將樣品兌水稀釋后拌種處理感 染小麥赤霉病菌的小麥種子。每直徑20cm盆缽播種25粒種子，各處理重復10盆，置于溫室培 養(yǎng)。出苗后10天檢查出苗率和死苗率，計算對赤霉病菌引起芽腐和苗枯的防治效果。同時保 留長勢一致的10株苗，并在基質中接種含有小麥紋枯病菌(Rhizoctonia cerealis)的麥麩 培養(yǎng)基，和對葉片接種白粉病菌和葉銹菌孢子，接種后14天各處理調查100株麥苗，計算紋 枯病、白粉病和銹病的株發(fā)病率和防治效果。同時根據單劑對赤霉病菌引起的芽腐和苗枯 防效，按Abbo tt (1925)方法計算組合物的理論防效〔E = X+ (I OO-X) Y/100，其中E為理論防 效，X為井岡霉素單劑防效，Y為丙硫菌唑單劑防效〕及增效系數(組合物應用的實際防效除 以理論防效100)，其結果見表6。
[0088] 表6:井閃霉素與丙硫菌唑農用殺菌劑懸浮劑種子處理防治小麥病害的效果及增 效作用
[0091] *Abbott認為組合物實際防效與理論防效之比大于1(或增效系數大于100)即為增 效(下同）。
[0092] 表6試驗結果表明，井閃霉素與丙硫菌唑組合物拌種處理罹赤霉病的小麥種子，不 僅可以有效防治赤霉病菌引起的芽腐和苗枯，而且在試驗劑量處理的范圍內（10~1000 g ai井岡霉素與2~15g ai丙硫菌唑/IOOkg種子)均對防治赤霉病菌引起的苗枯有極好的增 效作用，增效系數遠遠大于1〇〇,增效作用極為顯著。雖然井閃霉素單劑對紋枯病有一定的 防效，但對白粉病和銹病基本無效;丙硫菌唑單劑除了對苗期銹病和白粉病具有較好防效 外，對苗期赤霉病和紋枯病只有中等防效，但與井閃霉素混用對上述病害的防效均表現明 顯的增效作用。
[0093] V.井閃霉素與丙硫菌唑農用殺菌劑懸浮劑防治小麥赤霉病的增效作用及降低毒 素作用
[0094] 按照井岡霉素與丙硫菌唑的重量比1:50、1:20、1 :3、1:2、1:1.5、1:1、2:1、5 :1、5: 1.5、50:3、10:1、10:1.5、50:2.5、50:1.5、和50:1，分別制備含量以重量計20%(1:50、1:20、 1:3、1:2、1:1.5、1:1、2:1、5:1、5:1.5)和40%(10:1、10:1.5、50:3、50:2.5、50:1.5、50:1)的 農用殺菌劑懸浮劑實驗用樣品。樣品制備方法是丙硫菌唑和井閃霉素原藥按照上述重量比 混合后，加入含以重量計5%乙二醇和丙二醇混合溶劑(體積比1:1 )、2%甘油、1.0%NN0-1 分散劑、3 %十二烷基硫酸鈉、0.3 %有機硅消泡劑和少量水的溶液中，最后用水補充至 100 %，經砂磨機粉碎至90 %的藥劑顆粒直徑S 5m。
[0095] 設計每畝使用井閃霉素和丙硫菌唑組合物的不同劑量，同時根據使用混劑中的單 劑用量設計了相應的單劑處理。2013年4月在江蘇省白馬湖農場進行田間防治赤霉病的試 驗篩選，小麥品種為淮麥22,在小麥揚花初期各藥劑樣品對水噴施處理，間隔5天噴施第二 次藥，每畝噴水量50公斤。各處理重復3個小區(qū)，每小區(qū)面積50平方米。同時設50%多菌靈可 濕性粉劑每畝用80克處理作為對照藥劑。按照農業(yè)部頒發(fā)的殺菌劑田間藥效試驗準則行業(yè) 標準規(guī)定的相應方法，在乳熟期調查小麥赤霉病發(fā)生情況，根據各處理防治赤霉病的實際 效果，計算組合物的增效作用。按Abbott (1925)方法計算組合物的理論防效〔E = X+( 100-X) Y/100,其中E為理論防效，X為井閃霉素單劑防效，Y為丙硫菌唑單劑防效〕及增效系數(組合 物應用的實際防效除以理論防效100)。
[0096]毒素測定方法:在蠟熟期各處理5點取樣200麥穗，室內脫粒，烘干后隨機取樣30克 麥粒粉碎。按Goswami和Kistler方法，取5克面粉置于離心管中，加入20mL的乙腈：水(84: 16)提取液，禍旋機混勾后搖床上震蕩24小時，5000rpm離心10min，取上清2mL于Eppendorf 離心管中N氣吹干-20°C保藏。檢測時加入100LTMS衍生化試劑(TMSI:TMCS=100:1)，混勻 IOmin后加入ImL超純水，震蕩分層后吸取上清液加到GC進樣瓶，用裝有電子捕獲監(jiān)測器的 氣相色譜(GC-E⑶)進行毒素含量檢測。
[0097]麥粒感染菌量測定方法:取用于毒素檢測的面粉2g置于50mL離心管中，加入20% CTAB病菌DNA抽提緩沖液，再加入50L蛋白酶K和30LRNA酶，充分混勻，65 °C孵化3小時后， 1000 Orpm離心10min，20mL上清全部轉至50mL離心管中，再加入等體積苯酸:氯仿：異戊醇 (25:24:1)劇烈震蕩，1000 OrpmL離心5min，取上清IOmL加入冷的1/10體積的31110IL- 1的醋酸 鈉和2倍體積的無水乙醇，_20°C沉淀24小時，1000 Orpm離心10min，沉淀物用20mL70%的乙 醇洗脫2次，晾干后加入500LTE溶液溶解，-20°C保存該DNA模板。根據DON合成關鍵基因 Tri5 設計引物，采用實時定量PCR擴增樣品中的DNA，并計算每克小麥樣品中Tr i 5DNA含量(μ gDNA/g小麥），計算組合物各處理對菌體毒素合成能力的抑制作用。結果見表7。
[0098]表7:井閃霉素與丙硫菌唑農用殺菌劑懸浮劑防治小麥赤霉病的增效作用及減少 DON毒素污染的作用
[0101] 本發(fā)明防治麥類赤霉病的組合物增效作用配比的田間篩選及試驗結果表明，井岡 霉素與丙硫菌唑組合物在小麥揚花初期至灌漿期噴施，在每畝使用井閃霉素有效成分1~ 150g和丙硫菌唑有效成分2~20g的混劑時，不僅均對赤霉病的防治具有顯著增效作用（增 效系數大于120)。而且井閃霉素與丙硫菌唑組合物應用后，對