一種Ogura型蘿卜雄性不育細(xì)胞質(zhì)及其選育方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及作物育種技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種Ogura型蘿卜雄性不育細(xì)胞質(zhì)及其選育方法。該Ogura型蘿卜雄性不育細(xì)胞質(zhì)，其特征在于：具有所述不育細(xì)胞質(zhì)的雄性不育系雄蕊退化徹底，不能形成具有正常功能的花粉，而雌蕊發(fā)育正常，低溫下花蕾不黃化，其育性的保持與恢復(fù)與原Ogura型雄性不育系有差異。本發(fā)明雄性不育細(xì)胞質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，既可以作為正常的雄性不育材料進(jìn)行作物雜交育種，拓寬了保持系的選擇范圍，又可利用它進(jìn)一步揭示orf138不育基因的作用機(jī)理，對(duì)蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育的深層次研究具有十分重要的意義。CCTCC NO：P20152020151120
【專利說(shuō)明】一種Ogura型蘿K隹性不育細(xì)胞質(zhì)及其選育方法
[0001] ( - )技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明涉及作物育種技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種Ogura型蘿卜雄性不育細(xì)胞質(zhì)及其選育方法。
[0002] (二)【背景技術(shù)】 植物雄性不育是指植物在花器發(fā)育上，雌蕊發(fā)育正常，能夠正常的接受花粉，形成胚， 最后發(fā)育成種子;而雄蕊的花粉、花粉囊等由于受基因型、環(huán)境條件等因素的影響，不能產(chǎn) 生具有功能作用的花粉的現(xiàn)象。
[0003] 由基因型造成的雄性不育，又分為兩種類型：一種核基因控制的雄性不育，它又分 為顯性核雄性不育和隱性核雄性不育，核基因控制的雄性不育系所選出的保持系，只有50% 的保持率，在其后代中有一半可育株和一半不育株，在生產(chǎn)中不結(jié)合其它措施很難直接應(yīng) 用。另一種是細(xì)胞質(zhì)基因控制的雄性不育，又稱細(xì)胞質(zhì)雄性不育，其本質(zhì)是細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì) 基因互作形成的雄性不育，就是雄性不育株必須帶有具有雄性不育基因的細(xì)胞質(zhì)，同時(shí)，在 核基因中不能含有該不育基因的恢復(fù)基因。這里所說(shuō)的"恢復(fù)基因"是指能夠恢復(fù)不育系育 性的基因，當(dāng)雄性不育株含有該恢復(fù)基因后，不育株的雄性育性就恢復(fù)正常。當(dāng)一個(gè)同類的 個(gè)體在細(xì)胞質(zhì)中既不含有不育基因，在細(xì)胞核中又不含有恢復(fù)基因，該個(gè)體就是這個(gè)不育 系的保持系，它的保持率是100%。在作物的雄性不育系育種中絕大多數(shù)都利用細(xì)胞質(zhì)雄性 不育的這個(gè)特性來(lái)進(jìn)行品種選育的。如水稻、玉米、蘿卜、甘藍(lán)、油菜、菜花、洋蔥等。
[0004] 蘿卜雄性不育同樣表現(xiàn)為花藥退化，或不能形成具有正常功能的花粉，而雌蕊發(fā)育 正常。生產(chǎn)上使用的蘿卜雄性不育系是由細(xì)胞質(zhì)基因和細(xì)胞核基因共同互作，形成的一種雄 性不育現(xiàn)象。蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因存在于線粒體DNA上，主要是由于線粒體基因組分子 內(nèi)或分子間頻繁重組所形成的異常嵌合基因造成的。研究發(fā)現(xiàn)，蘿卜雄性不育的主控基因?yàn)? 〇rf!38與線粒體基因組中具有正常功能的基因共轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生異常轉(zhuǎn)錄本和翻譯產(chǎn)物，從而 在花藥發(fā)育的某個(gè)時(shí)期干擾線粒體的正常功能發(fā)揮，最終導(dǎo)致雄性不育現(xiàn)象的發(fā)生。線粒 體基因組的轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物雖然只占整個(gè)細(xì)胞質(zhì)基因組產(chǎn)物的很少部分，但其轉(zhuǎn)錄和翻譯 情況比較復(fù)雜。
[0005] 至今為止，在蘿卜雄性不育基因類型中，Ogura雄性不育是導(dǎo)入率和穩(wěn)定性最佳的 不育材料，也是目前研究最為深入的一種雄性不育材料，日本學(xué)者Yamagishi通過(guò)對(duì)野生 種、栽培種等不育材料的〇rf!38基因進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)Ogura雄性不育基因 〇rf!38可以分 為九個(gè)變異類型（如下表），已經(jīng)明確導(dǎo)致雄性不育的有A、B、D、F、H型，A型通稱為Ogura型，F(xiàn) 型稱為Kosena型，有人研究，A型和F型的保持和恢復(fù)關(guān)系是一致的。其它類型之間的育性恢 復(fù)和保持關(guān)系尚不確定，不同類型間除〇rf!38基因以外線粒體DNA變異對(duì)細(xì)胞質(zhì)雄性不育 的影響也不明確。
[0006] Ogura雄性不育基因 orf 138的九個(gè)類型一覽表
注:表中Δ a欄的"+"為基因中缺失39個(gè)堿基對(duì)。Orfl38類型中A為最早發(fā)現(xiàn)的測(cè)序的序 列。其它欄中為與A型沒(méi)有變化。
[0007] 目前蘿卜育種和生產(chǎn)中普遍使用的是Ogura型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，由于有的材料因 含有純合恢復(fù)基因選不出保持系，限制了不育系的使用，在蘿卜育種和生產(chǎn)上迫切需要多種 類型的不育材料，拓展保持系的選擇范圍，提高雄性不育育種的成功率。
[0008] (三)
【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種Ogura型蘿卜雄性不育細(xì)胞質(zhì)及其選育方法。
[0009] 本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的： 一種Ogura型蘿卜雄性不育細(xì)胞質(zhì)，其特征在于:具有所述不育細(xì)胞質(zhì)的雄性不育系雄 蕊退化徹底，不能形成具有正常功能的花粉，而雌蕊發(fā)育正常，低溫下花蕾不黃化，其育性 的保持與恢復(fù)與原Ogura型雄性不育系有差異;其保藏號(hào)為CCTCC No:P201520，分類命名 為:蘿卜雄性不育系R64A Raphanus sativus L.;保藏單位是中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地 址湖北省武漢市武漢大學(xué)校內(nèi)，保藏日期為20151120。
[0010]本發(fā)明所述的Ogura型蘿卜雄性不育細(xì)胞質(zhì)的選育方法，包括如下步驟： (1) 選擇檢測(cè)后的具有Ogura A型雄性不育細(xì)胞質(zhì)的可育純合植株作為父本，以其他非 Ogura A型細(xì)胞質(zhì)的雄性不育材料作母本，進(jìn)行雜交篩選； (2) 在雜交后代中表現(xiàn)為全部不育的，即表示該不育材料與Ogura A型細(xì)胞質(zhì)雄性不育 存在育性的差別，經(jīng)多代雜交驗(yàn)證之后，明確兩者確實(shí)存在育性保持與恢復(fù)上的差異； (3) 將獲得的具有新型蘿卜雄性不育細(xì)胞質(zhì)的材料進(jìn)行orfl38基因的PCR分子標(biāo)記與片 段測(cè)序，比較兩者之間在〇rfl38基因上的序列差異； (4) 對(duì)新型不育系細(xì)胞質(zhì)線粒體DNA進(jìn)行測(cè)序、組裝； (5) 比較新的不育細(xì)胞質(zhì)與Ogura A型不育細(xì)胞質(zhì)在線粒體DNA上的差異。
[0011]本發(fā)明的更優(yōu)技術(shù)方案為： 步驟（1)中，用Ogura特異引物：0RF-F 5 ' -TTCAAATCCTGTCCCCGCACC-3 ' 和0RF-R 5 ' - GCCTTACACCATTGGGATACTTC-3 '，對(duì)新型蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料及可育純合植株進(jìn)行PCR分 子標(biāo)記。
[0012] 本發(fā)明由于采用以上技術(shù)方案，具有以下優(yōu)點(diǎn)： (1) 拓寬了Ogura型蘿卜雄性不育保持系的選育范圍，原來(lái)只是從具有非Ogura細(xì)胞質(zhì)類 型的材料中選育保持系，通過(guò)該方法，同樣可以從具有Ogura細(xì)胞質(zhì)類型的材料中選育保持 系，有效解決了一些性狀優(yōu)良的具有Ogura細(xì)胞質(zhì)材料的三系利用問(wèn)題;特別是隨著雄性不 育系制種的不斷增加，該類型材料將會(huì)越來(lái)越多； (2) 本發(fā)明涉及的一種新型Ogura雄性不育細(xì)胞質(zhì)，對(duì)進(jìn)一步研究Ogura細(xì)胞質(zhì)雄性不 育機(jī)理提供一個(gè)十分重要的材料； (3) 本發(fā)明涉及的雄性不育細(xì)胞質(zhì)同樣具有一般雄性不育系的功能，能夠進(jìn)行雜交種 的配制與選育。
[0013] 本發(fā)明打破了傳統(tǒng)保持系的選育范圍和方法，以新發(fā)現(xiàn)的雄性不育系為不育材 料，從具有〇gura-A細(xì)胞質(zhì)類型的可育蘿卜植株中選育出了雄性不育系的保持系。通過(guò)對(duì)兩 個(gè)材料細(xì)胞質(zhì)線粒體進(jìn)行測(cè)序、組裝，兩者的線粒體DNA除在orfl38基因中的第165574和 165613處有兩個(gè)堿基上的差異外，在整個(gè)線粒體DNA中還有53個(gè)堿基的變異和插入與缺失。 兩者雖然同為Ogura細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，但它們的育性有著明顯的差別，證明本發(fā)明所采用 的新雄性不育系與傳統(tǒng)的Ogura-A型雄性不育系有所不同，是一個(gè)新的不育材料，具有新的 不育型細(xì)胞質(zhì)。
[0014] 該雄性不育細(xì)胞質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，既可以作為正常的雄性不育進(jìn)行作物雜交育種，拓寬 了保持系的選擇范圍，又可利用它進(jìn)一步揭示〇rf!38不育基因的作用機(jī)理，對(duì)蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄 性不育的深層次研究具有十分重要的意義。
[0015] (四）【附圖說(shuō)明】 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0016]圖1為本發(fā)明的選育技術(shù)路線圖； 圖2為對(duì)不育系和保持系各選取5株，用Ogura特異引物進(jìn)行PCR分子標(biāo)記，在1000bp處 出現(xiàn)一條一致的明亮條帶，標(biāo)明兩者都含有〇rf!38基因的示意圖；注：1，2,3，，4,5SR64A， 6,7,8,9，l〇SHF17-5-1-l;]\C%marker ; 圖3為不育系R64A與保持系HF17-5-1-1測(cè)序結(jié)果比較示意圖； 圖4為R64A與日本測(cè)序的Ogura-Α型雄性不育材料線粒體DNA Blast比對(duì)結(jié)果示意圖。 [0017](五)【具體實(shí)施方式】 下面結(jié)合附圖和實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0018] 首先選擇雄性不育材料和具有Ogura型雄性不育細(xì)胞質(zhì)的純合可育材料，本發(fā)明 選用的雄性不育材料有5個(gè)，5個(gè)不育材料均來(lái)自國(guó)內(nèi)地方品種，具有Ogura型雄性不育細(xì)胞 質(zhì)的純合可育材料為山東地方品種棗莊大紅袍，棗莊大紅袍為紅皮白心蘿卜。
[0019] 先對(duì)純合可育材料進(jìn)行純合性檢測(cè)，將純合可育材料進(jìn)行自交，獲得F1代種子，取 300粒F1代種子，用35 °C的溫水浸泡3小時(shí)，然后放入紙基培養(yǎng)皿中，待種子萌動(dòng)后，放入2-4 °(：的冰箱中進(jìn)行春化處理25天(該過(guò)程稱為種子春化處理），通過(guò)春化處理后的種子播種于 隔離網(wǎng)室中，待開花后，對(duì)雜交后代的育性情況進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)。如果全部為可育株，說(shuō)明該 材料是純合的，如果出現(xiàn)一定比例的不育株，該可育材料則為雜合體，不能用于對(duì)不育材料 的篩選。
[0020] 以檢測(cè)后的純合可育材料為父本，分別與雄性不育材料進(jìn)行雜交，取每個(gè)雜交組 合的F1代種子各100粒，進(jìn)行春化處理，將通過(guò)春化處理的種子播種于隔離網(wǎng)室中，待開花 后，對(duì)雜交后代的育性情況進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)。在5個(gè)不育材料的后代中，發(fā)現(xiàn)3號(hào)材料(R64A)后 代全部為不育，證明該可育材料能夠保持R64A的不育性，即為R64A的保持系，同時(shí)也說(shuō)明該 雄性不育材料與Ogura A型雄性不育存在育性上的差別。
[0021] 對(duì)R64A和Ogura A型純合可育株進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)類型的PCR分子標(biāo)記與片段測(cè)序。用 Ogura 特異弓| 物：0RF-F 5 ' - T T C A A A T C C T G T C C C CG C A C C - 3 ' 和 0 RF - R 5 '-GCCTTACACCATTGGGATACTTC-3 '，對(duì)不育材料R64A及純合可育材料進(jìn)行PCR分子標(biāo)記，為防止 出現(xiàn)取樣錯(cuò)誤，每份材料取5株，1、2、3、4、5為不育材料R64A，6、7、8、9、10為純合可育材料 HF17-5-1-l，PCR標(biāo)記結(jié)果如圖2，10個(gè)樣本都在大約100(^?處出現(xiàn)了一條明亮、清晰的條 帶，說(shuō)明兩者皆為Ogura細(xì)胞質(zhì)類型。對(duì)圖2中的4、5、6、7四份樣品，通過(guò)對(duì)PCR瓊脂糖凝膠割 膠回收，進(jìn)行分子測(cè)序。
[0023] 不育材料R64A和純合可育材料HF17-5-1-1在orfl38區(qū)段的第61和第99個(gè)堿基上 出現(xiàn)差異（圖3)，不育材料R64A在第61個(gè)堿基由A變?yōu)镃(A-C)，第99個(gè)堿基由A變?yōu)镚(A- G)〇
[0024] 進(jìn)一步對(duì)不育材料R64A進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)線粒體DNA序列測(cè)序、組裝。
[0025]將R64A種植于課題組試驗(yàn)田，田間管理按常規(guī)方法進(jìn)行，待植株發(fā)育至10片葉時(shí)， 取健康單株的頂部嫩葉l〇〇g。按5mL/g(鮮重)加入勻漿緩沖液，用預(yù)冷的高速組織搗碎器在 4°C下?lián)v碎組織，四層紗布過(guò)濾，收集濾液。濾液經(jīng)2000g離心15min后，取上清，17000g離心 lOmin，取沉淀，后兩步重復(fù)兩次，即為粗提線粒體和葉綠體。
[0026] 利用蔗糖襯墊法純化線粒體和葉綠體，將粗提線粒體和葉綠體懸液小心鋪在裝 有Shelf緩沖液的離心管中，經(jīng)17000g，離心15min，棄上清，此法重復(fù)兩次，所得沉淀即為純 化的線粒體葉綠體。
[0027] 在純化后的線粒體和葉綠體沉淀中加入裂解緩沖液，混勻沉淀，再加入蛋白酶K 和10%的SDS溶液，37°C保溫2h以上。裂解液經(jīng)等體積酚-氯仿-異戊醇、氯仿各抽提1次后， 12000g離心取上清，再加入乙酸鈉和等體積的預(yù)冷異丙醇，-20°C沉淀0.5h以上，12000g離 心lOmin，收集沉淀，70%乙醇洗滌1-2次，溶于適當(dāng)體積的TE緩沖液中，于-20°C保存?zhèn)溆谩?[0028] 測(cè)序采用11 lumina二代高通量測(cè)序，讀長(zhǎng)90bp，測(cè)序得到400M的讀段數(shù)據(jù)。
[0029] 原始數(shù)據(jù)經(jīng)去除測(cè)序重復(fù)，由Trimmomatic 3.0進(jìn)行Clean處理后，用Fastqc對(duì)讀 段進(jìn)行質(zhì)控檢測(cè)、過(guò)濾。
[0030]對(duì)過(guò)濾的數(shù)據(jù)分別進(jìn)行Kmer分析，確定適合組裝的mer值，并預(yù)測(cè)測(cè)序深度及目標(biāo) 基因組的大小。基因組大小的估測(cè)方法根據(jù)Marai的方法。
[0031]用Velvet軟件對(duì)過(guò)濾后的各樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，選擇mer值為21，Insert Size為 320,標(biāo)準(zhǔn)誤sd為10,截止覆蓋度參數(shù)則根據(jù)預(yù)計(jì)覆蓋度進(jìn)行設(shè)置。
[0032]根據(jù)組裝得到的Contigs序列設(shè)計(jì)引物，以提取的DNA樣品為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并 對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物用Sanger法測(cè)序。
[0033] 根據(jù)Velvet組裝得到的每個(gè)樣品Contigs序列及擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Sanger測(cè)序后得到的 序列進(jìn)行疊加，從而得到線粒體和葉綠體完整的全長(zhǎng)基因組序列并用Mitofy軟件進(jìn)行基因 注釋。
[0034] 將R64A線粒體DNA序列與日本公布的Ogura-Α型DNA序列（GeneBank AB694744.1) 進(jìn)行Blast比較（見(jiàn)圖4)，R64A的DNA全長(zhǎng)為258462個(gè)堿基，AB694744.1為258426個(gè)堿基。兩 者的一致性（Identities)為 258414/258471 (99%);插入與缺失（Gaps)為 54/258471。說(shuō)明兩 者除在orfl38基因內(nèi)的兩個(gè)堿基的差異外，在整個(gè)DNA序列中還存在其它的差異(見(jiàn)下表）， 在DNA水平和育性上兩者都有明顯差異的，R64A所具有的雄性不育細(xì)胞質(zhì)是一個(gè)新的不育 類型。
[0035] R64A與Ogura-Α在線粒體DNA上的差異
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種Ogura型蘿卜雄性不育細(xì)胞質(zhì)，其特征在于:具有所述不育細(xì)胞質(zhì)的雄性不育系 雄蕊退化徹底，不能形成具有正常功能的花粉，而雌蕊發(fā)育正常，低溫下花蕾不黃化，其育 性的保持與恢復(fù)與原Ogura型雄性不育系有差異；其保藏號(hào)為CCTCC P201520，保藏單位是 中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址湖北省武漢市武漢大學(xué)校內(nèi)，保藏日期為20151120。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的Ogura型蘿卜雄性不育細(xì)胞質(zhì)的選育方法，其特征為，包括如下 步驟：（1)選擇檢測(cè)后的具有Ogura A型雄性不育細(xì)胞質(zhì)的可育純合植株作為父本，以其他 非Ogura A型細(xì)胞質(zhì)的雄性不育材料作母本，進(jìn)行雜交篩選；（2)在雜交后代中表現(xiàn)為全部 不育的，即表示該不育材料與Ogura A型細(xì)胞質(zhì)雄性不育存在育性的差別，經(jīng)多代雜交驗(yàn)證 之后，明確兩者確實(shí)存在育性保持與恢復(fù)上的差異；（3)將獲得的新型蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育 材料進(jìn)行〇rfl38基因的PCR分子標(biāo)記與片段測(cè)序，比較兩者之間在orfl38基因上的序列差 異；（4)對(duì)新型不育系細(xì)胞質(zhì)線粒體DNA進(jìn)行測(cè)序、組裝；（5 )比較新的不育細(xì)胞質(zhì)與Ogura A 型不育細(xì)胞質(zhì)線粒體DNA序列的差異。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的Ogura型蘿卜雄性不育細(xì)胞質(zhì)的選育方法，其特征在于：步驟 (1)中，用Ogura特異引物：0RF-F 5'-TTCAAATCCTGTCCCCGCACC-3'和0RF-R 5'-GCCTTACACCATTGGGATACTTC-3 '，對(duì)新型蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料及可育純合植株進(jìn)行PCR分 子標(biāo)記。
【文檔編號(hào)】A01H1/02GK105830906SQ201510934624
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2015年12月15日
【發(fā)明人】王效睦, 白靜, 段乃彬, 王俊峰, 謝坤
【申請(qǐng)人】山東省農(nóng)作物種質(zhì)資源中心