羊躑躅葉片再生植株的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種羊躑躅葉片再生植株的方法，以羊躑躅葉片為外植體，經(jīng)過暗培養(yǎng)、分化培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和煉苗移栽等步驟獲得羊躑躅再生植株，解決了羊躑躅葉片離體再生芽的困難，不僅為快速繁殖優(yōu)良羊躑躅提供了途徑，而且為以后通過基因工程技術(shù)改良羊躑躅的抗性、花型及花色等性狀，以及為羊躑躅遺傳體系的建立打下了堅實的基礎(chǔ)。本發(fā)明以羊躑躅葉片為外植體，可以在羊躑躅任意生長階段進行選材擴繁，短時間內(nèi)獲得大量再生植株，繁殖系數(shù)高，移栽生長良好，為工廠化育苗奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】
羊躑躅葉片再生植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種羊躑躅葉片再生植株的方法。屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]杜鵑花是中國十大傳統(tǒng)名貴花卉之一，其花色繁多，花期長，被廣泛用于地栽、城市道路、風景區(qū)以及住宅小區(qū)的綠化造景中，有“花木之王”的美名。我國是世界上擁有杜鵑花種群數(shù)量最多的國家，也是世界杜鵑花的發(fā)祥地和現(xiàn)代分布中心，全世界共有杜鵑花屬植物960余種，我國約有562種。
[0003]羊擲躅(Rhododendron molle(Blume)G.Don)又名鬧羊花、黃杜鵲、黃色映山紅、隸屬杜鵑花科杜鵑花屬羊躑躅亞屬，落葉灌木，是杜鵑花屬植物中極少數(shù)開黃色花的珍貴物種，具有較高的觀賞價值。然而羊躑躅的扦插困難，難生根，嚴重制約了羊躑躅在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。中國專利文獻CNl03651115A公開了一種杜鵑花金躑躅的組培快繁方法，該方法選用金躑躅的帶葉莖段作為外植體進行組培，初步解決金躑躅的快繁問題，但其誘導過程實質(zhì)是芽到芽的增殖，并沒有解決金躑躅愈傷組織再生植株的問題。關(guān)于木本植物通過葉片再生植株一直是林業(yè)研究工作中的一個難題，羊躑躅通過葉片直接誘導不定芽再生植株的有效方法迄今尚未報道，本發(fā)明主要以羊躑躅葉片為外植體，直接誘導不定芽，不僅為快速繁殖優(yōu)良羊躑躅植株提供了一條新的途徑，而且為以后通過基因工程技術(shù)利用葉盤法轉(zhuǎn)基因來改良羊躑躅的抗性、花型及花色等性狀打下堅實的基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種羊躑躅葉片再生植株的方法。
[0005]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0006]—種羊躑躅葉片再生植株的方法，其步驟包括:
[0007](I)暗培養(yǎng):將羊躑躅無菌苗葉片，用無菌解剖刀在葉片上劃刻幾刀，接種到預(yù)培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)3-7天，其中預(yù)培養(yǎng)基為:1/2WPM+1.0?5.0mg/L ΖΤ+0.02?1.0mg/L IBA+20?30g/L 蔗糖+4.0?7.0g/L 瓊脂，pH 為 5.2?5.6;
[0008](2)分化培養(yǎng):將步驟(I)葉片接種到分化培養(yǎng)基中進行愈傷組織及芽誘導，其中分化培養(yǎng)基為:木本植物常用培養(yǎng)基(WPM)+1.0?5.0mg/L玉米素(ZT)+0.02?1.0mg/L卩引噪丁酸(IBA)+20 ?30g/L 蔗糖+4.0?7.0g/L 瓊脂，pH 為 5.2?5.6;
[0009](3)繼代培養(yǎng):將步驟(2)葉片接種到繼代培養(yǎng)基中繼續(xù)進行愈傷組織及芽誘導，其中繼代培養(yǎng)基為:WPM+1.0?5.0mg/L ΖΤ+0.02?I.0mg/L IBA+20?30g/L蔗糖+4.0?
7.(^/1瓊脂，？!1為5.2?5.6;
[0010](4)增殖培養(yǎng)基:將步驟(3)誘導分化的帶芽愈傷組織接種到增殖培養(yǎng)上進行增殖培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)基為:WPM+0.1 ?2.0mg/L ΖΤ+0.02?1.0mg/L IBA+20?30g/L蔗糖+4.0?
7.(^/1瓊脂，？!1為5.2?5.6;
[0011 ] (5)生根培養(yǎng):將步驟(4)增殖的不定芽接種到生根培養(yǎng)基中，接種后光照培養(yǎng)；[0012 ] (6)煉苗移栽:從步驟(5)獲得的組培苗中選取根系健壯的進行煉苗移栽。
[0013]優(yōu)選的，所述步驟(I)中暗培養(yǎng)條件為溫度20?25°C，濕度40?50%。
[0014]優(yōu)選的，所述步驟(2)中培養(yǎng)條件為:光照12?14h/天，光照強度3000?5000Ix，溫度23?25°C，濕度40?50%，培養(yǎng)至葉片切口處卷曲加劇，開始出現(xiàn)顆粒狀的愈傷組織。
[0015]優(yōu)選的，所述步驟(3)中培養(yǎng)條件為:光照12?14h/天，光照強度3000?5000Ix，溫度23?25°C，濕度40?50%，培養(yǎng)至葉片切口處愈傷組織長出不定芽。
[0016]優(yōu)選的，所述步驟(4)中培養(yǎng)條件為:光照12?14h/天，光照強度3000?50001x，溫度23?25°C，濕度40?50%，培養(yǎng)至帶有不定芽的愈傷組織長出叢生芽。
[0017]優(yōu)選的，所述步驟(5)中生根培養(yǎng)基為:1/3￥?1+0.5?4.011^/1 IBA+20?30g//L蔗糖+6.0g/L瓊脂+2g//L活性碳，pH為5.2?5.6，培養(yǎng)至不定芽株高達到3cm以上且生長出須根。
[0018]優(yōu)選的，所述步驟(6)具體為:選擇根系健壯且株高達到3.0cm的組培苗，敞開培養(yǎng)瓶瓶蓋，煉苗10天，洗凈組培苗根部的瓊脂，之后將其移栽到淋濕的珍珠巖基質(zhì)中，向小苗進行噴霧，覆蓋塑料薄膜進行保溫保濕，隨后幾天逐步撤去薄膜進行通風透光，20?30天后，將其移栽至草炭土:珍珠巖=3:1組成的混合基質(zhì)中，移栽操作在溫度20?25°C下進行，栽植后澆透水，日常養(yǎng)護注意保證基質(zhì)濕潤。
[0019]本發(fā)明以羊躑躅葉片為外植體，經(jīng)過暗培養(yǎng)、分化培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和煉苗移栽等步驟獲得羊躑躅再生植株，解決了羊躑躅葉片離體再生芽的困難，不僅為快速繁殖優(yōu)良羊躑躅提供了途徑，而且為以后通過基因工程技術(shù)改良羊躑躅的抗性、花型及花色等性狀，以及為羊躑躅遺傳體系的建立打下了堅實的基礎(chǔ)。本發(fā)明以羊躑躅葉片為外植體，可以在羊躑躅任意生長階段進行選材擴繁，短時間內(nèi)獲得大量再生植株，繁殖系數(shù)高，移栽生長良好，為工廠化育苗奠定了基礎(chǔ)。
【具體實施方式】
[0020]實施例1
[0021]本羊躑躅葉片再生植株的方法，其步驟包括:
[0022](I)暗培養(yǎng):將羊躑躅無菌苗葉片，用無菌解剖刀在葉片上劃刻幾刀，接種到預(yù)培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)7天，溫度23°C，濕度40 %，經(jīng)過暗培養(yǎng)，葉片切口處開始卷曲，預(yù)培養(yǎng)基為:1/2WPM+2.0mg/L ZT+0.02mg/L 18八+258/1蔗糖+4.(^/1瓊脂4!1為5.4。
[0023](2)分化培養(yǎng):將步驟(I)葉片接種于分化培養(yǎng)基中，進行愈傷組織及芽誘導，接種后置于光照14h/天，光照強度30001x，溫度23°C，濕度40%，誘導15天后，葉片切口處開始卷曲，有少量顆粒狀的愈傷組織。所述分化培養(yǎng)基為:WPM+2.0mg/L ZT+0.02mg/L IBA+20g/L鹿糖+5.0g/L瓊脂，pH為5.4。
[0024](3)繼代培養(yǎng):步驟(2)葉片培養(yǎng)20天后，將其接種到繼代培養(yǎng)基中進行芽誘導，接種后置于光照1處/天，光照強度300011，溫度23°(:，濕度40%，15天后，從顆粒狀的愈傷組織中有芽點突起，逐漸長成綠色嫩芽，30天后統(tǒng)計不定芽分化率為90.56%。所述的繼代培養(yǎng)基為:WPM+1.0mg/L ZT+0.02mg/L 四4+258/1蔗糖+4.(^/1瓊脂，？!1為5.4。
[0025](4)增殖培養(yǎng)基:將步驟(3)誘導分化的帶芽愈傷組織接種到增殖培養(yǎng)上進行增殖培養(yǎng)，接種后光照14h/天，光照強度30001x，溫度23 °C，濕度40 %。30天后統(tǒng)計不定芽增殖系數(shù)為5.3 ο 所述增殖培養(yǎng)基:WPM+2.0mg/L ZT+1.0mg/L IBA+30g/L蔗糖+5.0g/L瓊脂，pH為5.4。
[0026](5)生根培養(yǎng):將步驟(4)增殖的不定芽接種到生根培養(yǎng)基中，接種后光照16h/天，光照強度60001x，溫度23°C，濕度45%。40天后統(tǒng)計生根率為85%。所述的生根培養(yǎng)基:I/3WPM+1.0mg/L IBA+20g/L蔗糖+6.08/1瓊脂+28/1活性碳，？!1為5.6。
[0027](6)煉苗移栽:選擇步驟(5)誘導的根系健壯且株高達到3.0cm的組培苗，敞開培養(yǎng)瓶瓶蓋，煉苗10天，再洗凈組培苗根部的瓊脂，之后將其移栽到淋濕的珍珠巖基質(zhì)中，向小苗進行噴霧，覆蓋塑料薄膜進行保溫保濕，之后幾天逐步撤去薄膜進行通風透光，20天后，將其移栽至草炭土:珍珠巖=3:1組成的混合基質(zhì)中，栽植后澆透水，日常養(yǎng)護注意保證基質(zhì)濕潤。30天后統(tǒng)計羊躑躅成活率為90%。
[0028]實施例2
[0029]本羊躑躅葉片再生植株的方法，其步驟包括:
[0030](I)暗培養(yǎng):將羊躑躅無菌苗葉片，用無菌解剖刀在葉片上劃刻幾刀，接種到預(yù)培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)5天，溫度250C，濕度50 %，預(yù)培養(yǎng)基為:1/2WPM+1.0mg/L ZT+0.5mg/L IBA+20g/L 蔗糖+5.0g/L 瓊脂，pH 為 5.2。
[0031](2)分化培養(yǎng):將步驟(I)葉片接種于分化培養(yǎng)基中，進行愈傷組織及芽誘導，接種后置于光照13h/天，光照強度50001x，溫度25°C，濕度50%，誘導15天后，葉片切口處開始卷曲，有少量顆粒狀的愈傷組織。所述分化培養(yǎng)基為:WPM+1.0mg/L ZT+0.5mg/L IBA+30g/L蔗糖+7.0g/L 瓊脂，pH 為 5.6。
[0032](3)繼代培養(yǎng):步驟(2)葉片培養(yǎng)20天后，將其接種到繼代培養(yǎng)基中進行芽誘導，接種后置于光照1311/天，光照強度500011，溫度25°(:，濕度50%，15天后，從顆粒狀的愈傷組織中有芽點突起，逐漸長成綠色嫩芽，30天后統(tǒng)計不定芽分化率為87.85%。所述的繼代培養(yǎng)基為:WPM+5.0mg/L ZT+1.0mg/L IBA+30g/L蔗糖+6.0g/L瓊脂，pH為5.6。
[0033](4)增殖培養(yǎng)基:將步驟(3)誘導分化的帶芽愈傷組織接種到增殖培養(yǎng)上進行增殖培養(yǎng)，接種后光照13h/天，光照強度50001x，溫度25 °C，濕度50 %。30天后統(tǒng)計不定芽增殖系數(shù)為4.7 ο 所述增殖培養(yǎng)基:WPM+1.0mg/L ZT+0.5mg/L IBA+25g/L蔗糖+4.0g/L瓊脂，pH為
5.6ο
[0034](5)生根培養(yǎng):將步驟(4)增殖的不定芽接種到生根培養(yǎng)基中，接種后光照15h/天，光照強度50001x，溫度25°C，濕度50%。40天后統(tǒng)計生根率為89%。所述的生根培養(yǎng)基:I/3WPM+4.0mg/L IBA+30g/L蔗糖+4.0g/L瓊脂+2g/L活性碳，pH為5.4。
[0035](6)煉苗移栽:選擇步驟(5)誘導的根系健壯且株高達到3.0cm的組培苗，敞開培養(yǎng)瓶瓶蓋，煉苗10天，再洗凈組培苗根部的瓊脂，之后將其移栽到淋濕的珍珠巖基質(zhì)中，向小苗進行噴霧，覆蓋塑料薄膜進行保溫保濕，之后幾天逐步撤去薄膜進行通風透光，20天后，將其移栽至草炭土:珍珠巖=3:1組成的混合基質(zhì)中，栽植后澆透水，日常養(yǎng)護注意保證基質(zhì)濕潤。30天后統(tǒng)計羊躑躅成活率為92%。
[0036]實施例3
[0037]本羊躑躅葉片再生植株的方法，其步驟包括:
[0038](I)暗培養(yǎng):將羊躑躅無菌苗葉片，用無菌解剖刀在葉片上劃刻幾刀，接種到預(yù)培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)3天，溫度24°C，濕度45 %，預(yù)培養(yǎng)基為:1/2WPM+5.0mg/L ZT+1.0mg/L IBA+30g/L 鹿糖+7.0g/L 瓊脂，pH 為5.6。
[0039](2)分化培養(yǎng):將步驟(I)葉片接種于分化培養(yǎng)基中，進行愈傷組織及芽誘導，接種后置于光照12h/天，光照強度40001x，溫度25°C，濕度50%，誘導15天后，葉片切口處開始卷曲，有少量顆粒狀的愈傷組織。所述分化培養(yǎng)基為:WPM+5.0mg/L ZT+1.0mg/L IBA+25g/L蔗糖+4.0g/L 瓊脂，pH 為 5.2。
[0040](3)繼代培養(yǎng):步驟(2)葉片培養(yǎng)20天后，將其接種到繼代培養(yǎng)基中進行芽誘導，接種后置于光照1211/天，光照強度40001^溫度25°(:，濕度50%，15天后，從顆粒狀的愈傷組織中有芽點突起，逐漸長成綠色嫩芽，30天后統(tǒng)計不定芽分化率為93.26%。所述的繼代培養(yǎng)基為:WPM+3.0mg/L ZT+0.5mg/L IBA+20g/L蔗糖+7.0g/L瓊脂，pH為5.2。
[0041](4)增殖培養(yǎng)基:將步驟(3)誘導分化的帶芽愈傷組織接種到增殖培養(yǎng)上進行增殖培養(yǎng)，接種后光照12h/天，光照強度40001x，溫度25 °C，濕度50 %。30天后統(tǒng)計不定芽增殖系數(shù)為3.2。所述增殖培養(yǎng)基:WPM+0.lmg/L ZT+0.02mg/L IBA+20g/L蔗糖+7.0g/L瓊脂，pH為
5.2ο
[0042](5)生根培養(yǎng):將步驟(4)增殖的不定芽接種到生根培養(yǎng)基中，接種后光照14h/天，光照強度40001x，溫度25°C，濕度50%。40天后統(tǒng)計生根率為82%。所述的生根培養(yǎng)基:I/3WPM+0.5mg/L IBA+25g/L蔗糖+7.0g/L瓊脂+2g/L活性碳，pH為5.2。
[0043](6)煉苗移栽:選擇步驟(5)誘導的根系健壯且株高達到3.0cm的組培苗，敞開培養(yǎng)瓶瓶蓋，煉苗10天，再洗凈組培苗根部的瓊脂，之后將其移栽到淋濕的珍珠巖基質(zhì)中，向小苗進行噴霧，覆蓋塑料薄膜進行保溫保濕，之后幾天逐步撤去薄膜進行通風透光，20天后，將其移栽至草炭土:珍珠巖=3:1組成的混合基質(zhì)中，栽植后澆透水，日常養(yǎng)護注意保證基質(zhì)濕潤。30天后統(tǒng)計羊躑躅成活率為87%。
【主權(quán)項】
1.一種羊躑躅葉片再生植株的方法，其步驟包括: (1)暗培養(yǎng):將羊躑躅無菌苗葉片，用無菌解剖刀在葉片上劃刻幾刀，接種到預(yù)培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)3-7天，其中預(yù)培養(yǎng)基為:1/2WPM+1.0?5.0mg/L ΖΤ+0.02?I.0mg/L IBA+20?30g/L 蔗糖+4.0?7.0g/L 瓊脂，pH 為 5.2?5.6; (2)分化培養(yǎng):將步驟(I)葉片接種到分化培養(yǎng)基中進行愈傷組織及芽誘導，其中分化培養(yǎng)基為:WPM+1.0?5.0mg/L ΖΤ+0.02?I.0mg/L IBA+20?30g/L蔗糖+4.0?7.0g/L瓊脂，pH為5.2?5.6; (3)繼代培養(yǎng):將步驟(2)葉片接種到繼代培養(yǎng)基中繼續(xù)進行愈傷組織及芽誘導，其中繼代培養(yǎng)基為:WPM+1.0?5.0mg/L ΖΤ+0.02?I.0mg/L IBA+20?30g/L蔗糖+4.0?7.0g/L瓊脂，pH為5.2?5.6; (4)增殖培養(yǎng)基:將步驟(3)誘導分化的帶芽愈傷組織接種到增殖培養(yǎng)上進行增殖培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)基為:WPM+0.1 ?2.0mg/L ΖΤ+0.02?I.0mg/L IBA+20?30g/L 蔗糖+4.0?7.(^/1瓊脂，？!1為5.2?5.6; (5)生根培養(yǎng):將步驟(4)增殖的不定芽接種到生根培養(yǎng)基中，接種后光照培養(yǎng)； (6)煉苗移栽:從步驟(5)獲得的組培苗中選取根系健壯的植株進行煉苗移栽。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羊躑躅葉片再生植株的方法，其特征在于:所述步驟(I)中暗培養(yǎng)條件為溫度20?25 °C，濕度40?50%。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的羊躑躅葉片再生植株的方法，其特征在于:所述步驟(2)中培養(yǎng)條件為:光照12?14h/天，光照強度3000?50001x，溫度23?25°C，濕度40?50%，培養(yǎng)至葉片切口處卷曲加劇，開始出現(xiàn)顆粒狀的愈傷組織。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的羊躑躅葉片再生植株的方法，其特征在于:所述步驟(3)中培養(yǎng)條件為:光照12?14h/天，光照強度3000?50001x，溫度23?25°C，濕度40?50%，培養(yǎng)至葉片切口處愈傷組織長出不定芽。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的羊躑躅葉片再生植株的方法，其特征在于:所述步驟(4)中培養(yǎng)條件為:光照12?14h/天，光照強度3000?50001x，溫度23?25°C，濕度40?50%，培養(yǎng)至帶有不定芽的愈傷組織長出叢生芽。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的羊躑躅葉片再生植株的方法，其特征在于:所述步驟(5)中生根培養(yǎng)基為:1/3WPM+0.5?4.0mg/L IBA+20?30g//L蔗糖+4.0?7.0g/L瓊脂+2g/L活性碳，pH為5.2?5.6，培養(yǎng)至不定芽株高達到3cm以上且生長出須根。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的羊躑躅葉片再生植株的方法，其特征在于:所述步驟(6)具體為:選擇根系健壯且株高達到3.0cm的組培苗，敞開培養(yǎng)瓶瓶蓋，煉苗10天，洗凈組培苗根部的瓊脂，之后將其移栽到淋濕的珍珠巖基質(zhì)中，向小苗進行噴霧，覆蓋塑料薄膜進行保溫保濕，隨后幾天逐步撤去薄膜進行通風透光，20?30天后，將其移栽至草炭土:珍珠巖=3:1組成的混合基質(zhì)中，移栽操作在溫度20?25°C下進行，栽植后澆透水，日常養(yǎng)護注意保證基質(zhì)濕潤。
【文檔編號】A01H4/00GK105830917SQ201610173982
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月24日
【發(fā)明人】肖政, 蘇家樂, 孫曉波, 劉曉青, 李暢
【申請人】江蘇省農(nóng)業(yè)科學院