一種用于梨同源轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證材料的篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于梨同源轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證材料的篩選方法，其包括以下步驟：(一)梨再生最適個(gè)體篩選：通過對田間性狀表現(xiàn)優(yōu)良的多株梨進(jìn)行單株采果取種、單株播種以及多輪再生培養(yǎng)方式篩選不定芽再生效果最好的單株作為梨再生最適個(gè)體；(二)梨轉(zhuǎn)基因植株獲得：在篩選到梨再生最適個(gè)體基礎(chǔ)上進(jìn)一步建立高效再生、生根及轉(zhuǎn)基因體系，并通過抗生素篩選獲得轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的方法操作簡單，取材方便，成本較低，適用于所有梨屬材料?？梢岳矛F(xiàn)有的通用再生培養(yǎng)基進(jìn)一步篩選最適的轉(zhuǎn)基因材料并建立高效再生、生根及轉(zhuǎn)基因體系，為梨遺傳轉(zhuǎn)化提供技術(shù)支持。
【專利說明】
一種用于梨同源轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證材料的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及高效遺傳轉(zhuǎn)化體系領(lǐng)域，尤其涉及一種用于梨同源轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證材 料的篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 梨是主要以嫁接繁殖的果樹，合理的梨砧木可以在一定程度上改善植株的非生物 脅迫耐性、果實(shí)品質(zhì)、豐產(chǎn)性、成熟期等，如何獲得性狀更加優(yōu)良的梨砧木一直是育種家們 努力的目標(biāo)。在梨砧木育種中，一般通過傳統(tǒng)雜交育種方式獲得性狀優(yōu)良的梨砧木優(yōu)系。但 傳統(tǒng)雜交手段用時(shí)長，目標(biāo)性狀不宜被鎖定，工作量大。因此，在生物技術(shù)快速發(fā)展的大背 景下，通過基因工程獲得目標(biāo)性狀明顯的轉(zhuǎn)基因梨砧木新材料成為研究熱點(diǎn)。同時(shí)，基因的 同源轉(zhuǎn)化也是對梨中控制特殊性狀基因進(jìn)行功能驗(yàn)證的必要手段，通常建立離體培養(yǎng)的高 效再生體系是果樹植物基因工程的基礎(chǔ)，但亞洲梨再生率低，且存在較強(qiáng)的基因型依賴性， 在一定程度上限制了通過轉(zhuǎn)基因方法進(jìn)行同源基因的功能驗(yàn)證，影響了這類植物相關(guān)基因 功能解析的可信度，也影響了通過基因工程獲得新材料的可行性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種用于梨同源轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn) 證材料的篩選方法，以通過同源轉(zhuǎn)化進(jìn)行基因功能驗(yàn)證，建立具有優(yōu)良再生能力的遺傳轉(zhuǎn) 化體系。
[0004] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明方案包括：
[0005] -種用于梨同源轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證材料的篩選方法，其包括以下步驟：
[0006] (1)秋子梨再生最適個(gè)體篩選
[0007] A、選擇田間性狀表現(xiàn)優(yōu)良的多株秋子梨單株，分別于果實(shí)成熟時(shí)期采果取種，并 對種子進(jìn)行層積處理；
[0008] B、將完成層積處理的種子，流水洗凈，用2%的次氯酸鈉溶液消毒處理10分鐘，無 菌水沖洗干凈后將種子播種于MS+蔗糖30g/L+瓊脂6.0-7.0g/L，PH5.8-6.0的培養(yǎng)基上；
[0009] C、待種子萌發(fā)至長出6-8片真葉后，分別將每株實(shí)生苗的真葉剪下，剪成5mm X 5mm外植體，并于葉脈處橫切2-4個(gè)傷口，將葉片正面朝上接種于誘導(dǎo)梨屬植物不定芽的通 用再生培養(yǎng)基上，在25 ±2 °C條件下暗培養(yǎng)2周，通用再生培養(yǎng)基為麗69+噻苯?。═DZ) 2 ? 0mg/L+吲哚丁酸（IBA)O ? 3mg/L+蔗糖 40g/L+瓊脂 6 ? Og/L，PH5 ? 8;
[0010] D、在步驟C的暗培養(yǎng)結(jié)束后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)，在光下培養(yǎng)過程中觀察每株實(shí)生苗的 外植體愈傷組織和不定芽產(chǎn)生情況，將不定芽產(chǎn)生速度快、數(shù)量多、狀態(tài)好的外植體對應(yīng)單 株作為秋子梨再生的初選材料；
[0011] E、將步驟D中初選材料誘導(dǎo)出的不定芽接種于增殖培養(yǎng)基上，使芽盡快長成健壯 的嫩梢，并進(jìn)行適當(dāng)增殖；
[0012] F、對已經(jīng)進(jìn)行芽增殖培養(yǎng)的初選材料，再次分別取嫩梢幼葉按照步驟C、步驟D的 操作進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，然后將不定芽產(chǎn)生速度最快、數(shù)量最多、狀態(tài)最好的外植體作為遺傳 轉(zhuǎn)化的候選材料;將候選材料誘導(dǎo)出的不定芽按照步驟E的操作進(jìn)行芽增殖培養(yǎng)，獲得大量 用于遺傳轉(zhuǎn)化的試管苗；
[0013] (2)秋子梨轉(zhuǎn)基因植株獲得
[0014] G、最適再生培養(yǎng)基篩選:在通用培養(yǎng)基基礎(chǔ)上調(diào)整激素配比，篩選出最適于秋子 梨候選單株材料的再生培養(yǎng)基；
[0015] H、預(yù)培養(yǎng):選擇生長一致的用于遺傳轉(zhuǎn)化的試管苗幼葉作為外植體，用無菌刀片 垂直于葉片中脈橫切2~4個(gè)傷口，葉片正面朝上接種于不定芽誘導(dǎo)的再生培養(yǎng)基上，暗環(huán) 境下預(yù)培養(yǎng)5天；
[0016] I、侵染:將預(yù)培養(yǎng)的外植體葉片浸入含轉(zhuǎn)化載體的農(nóng)桿菌侵染液中10-30分鐘，其 中農(nóng)桿菌菌液〇D6qq = 0.6~0.8 ；
[0017] J、共培養(yǎng):將吸干水分的外植體葉片繼續(xù)接種到再生培養(yǎng)基上，黑暗條件下共培 養(yǎng)2天；
[0018] K、脫菌篩選培養(yǎng):將外植體葉片轉(zhuǎn)接到含10mg/L卡那霉素篩選劑與200mg/L頭孢 霉素脫菌劑的再生培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性苗篩選，暗培養(yǎng)7天后，轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25 ±2°C，將在含卡那霉素的再生培養(yǎng)基上能夠正常生長的植株初步確定為轉(zhuǎn)基因抗性植株；
[0019] L、生根培養(yǎng):待轉(zhuǎn)基因抗性植株長到2.5-3.5cm時(shí)，將其轉(zhuǎn)接到含5mg/L卡那霉素 篩選劑的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，將能夠在含卡那霉素培養(yǎng)基上生根的植株確定為轉(zhuǎn) 基因陽性植株，生根培養(yǎng)基為1 /2MS+吲哚丁酸（IBA) 0 ? 5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6 ? Og/L，pH值 為 5.8〇
[0020] 所述的篩選方法，其中，上述步驟（1)中通過單株采果取種、單株播種以及多輪再 生培養(yǎng)方式篩選秋子梨再生最適個(gè)體。。
[0021] 所述的篩選方法，其中，上述步驟（1)與步驟G中先利用梨屬植物通用再生培養(yǎng)基 篩選秋子梨再生最適個(gè)體作為候選材料，再利用候選材料在通用培養(yǎng)基基礎(chǔ)上篩選再生效 率最高的再生培養(yǎng)基。
[0022]所述的篩選方法，其中，所述步驟E中增殖培養(yǎng)基為MS+6-芐氨基嘌呤（6-BA) 1 ? 0mg/L+吲哚丁酸（IBA) 0 ? lmg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂 6 ? 0-7 ? Og/L，培養(yǎng)基 pH 值為 5 ? 8-6 ? 0。 [0023] 所述的篩選方法，其中，所述步驟G、H、J和K中再生培養(yǎng)基為NN69+噻苯隆（TDZ) 3 ? 0mg/L+吲哚丁酸（IBA) 0 ? 3mg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂 6 ? Og/L，PH5 ? 8。
[0024]所述的篩選方法，其中，所述步驟K和L中篩選劑卡那霉素濃度分別為10mg/L和 5mg/L〇
[0025]所述的篩選方法，其中，所述步驟L中生根培養(yǎng)基為1/2MS+吲哚丁酸（IBA)0.5mg/L +蔗糖 30g/L+瓊脂 6 ? 0g/L，PH5 ? 8。
[0026]本發(fā)明提供的一種用于梨同源轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證材料的篩選方法，通過種子獲得實(shí) 生苗，在實(shí)生苗中篩選再生效果最好的植物材料，進(jìn)而篩選出具有優(yōu)良再生能力的秋子梨 材料，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步建立高效再生、生根及遺傳轉(zhuǎn)化體系，將為應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué) 手段培育性狀更加優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因梨砧木新品種（系），或通過同源轉(zhuǎn)化進(jìn)行基因功能驗(yàn)證， 進(jìn)一步深入開展相關(guān)基因?qū)δ承┥镄誀钫{(diào)控機(jī)理研究奠定技術(shù)支持。
【具體實(shí)施方式】
[0027]本發(fā)明提供了一種用于梨同源轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證材料的篩選方法，為使本發(fā)明的目 的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述 的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0028]本發(fā)明提供了一種用于梨同源轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證材料的篩選方法，以秋子梨為例， 選擇秋子梨性狀典型的材料，以葉片為外植體，在秋子梨實(shí)生種子后代中選擇具有最優(yōu)良 再生能力的秋子梨單株材料，并利用這一候選材料建立高效再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得轉(zhuǎn) 基因抗性植株。其具體的步驟包括：
[0029] 步驟一，選擇田間性狀表現(xiàn)優(yōu)良的多株秋子梨單株，分別于果實(shí)成熟時(shí)期采果取 種，并對種子進(jìn)行層積處理；
[0030] 步驟二，將完成層積處理的種子，流水洗凈，用2%的次氯酸鈉溶液消毒處理10分 鐘，無菌水沖洗干凈后將種子播種于MS+蔗糖30g/L+瓊脂6.0-7. Og/L，PH5.8-6.0的培養(yǎng)基 上；
[0031] 步驟三，待種子萌發(fā)至長出6-8片真葉后，分別將每株實(shí)生苗的真葉剪下，剪成5mm X 5mm外植體，并于葉脈處橫切2-4個(gè)傷口，將葉片正面朝上接種于誘導(dǎo)梨屬植物不定芽的 通用再生培養(yǎng)基上，在25±2°C條件下暗培養(yǎng)2周，通用再生培養(yǎng)基為NN69+噻苯隆（TDZ) 2 ? 0mg/L+吲哚丁酸（IBA)O ? 3mg/L+蔗糖 40g/L+瓊脂 6 ? Og/L，PH5 ? 8;
[0032] 步驟四，在步驟三的暗培養(yǎng)結(jié)束后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)，在光下培養(yǎng)過程中觀察每株實(shí) 生苗的外植體愈傷組織和不定芽產(chǎn)生情況，將不定芽產(chǎn)生速度快、數(shù)量多、狀態(tài)好的外植體 對應(yīng)單株作為秋子梨再生的初選材料；
[0033] 步驟五，將步驟四中初選材料誘導(dǎo)出的不定芽接種于增殖培養(yǎng)基上，使芽盡快長 成健壯的嫩梢，并進(jìn)行適當(dāng)增殖；
[0034]步驟六，對已經(jīng)進(jìn)行芽增殖培養(yǎng)的初選材料，再次分別取嫩梢幼葉按照步驟三、步 驟四的操作進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，然后將不定芽產(chǎn)生速度最快、數(shù)量最多、狀態(tài)最好的外植體作 為遺傳轉(zhuǎn)化的候選材料;將候選材料誘導(dǎo)出的不定芽按照步驟E的操作進(jìn)行芽增殖培養(yǎng)，獲 得大量試管苗；
[0035] 步驟七，在通用培養(yǎng)基基礎(chǔ)上調(diào)整激素配比，篩選出最適于秋子梨候選單株材料 的再生培養(yǎng)基。其中，不同激素配比及濃度對不定芽誘導(dǎo)的影響如表1，表2所示；
[0036] 表1

[0041 ] 如表1所示，在秋子梨再生培養(yǎng)基中，添加3.0mg/L TDZ和0.3mg/L IBA能得到最高 的再生效率，且每個(gè)外植體上的不定芽數(shù)量最多，可以達(dá)到8.48個(gè)。
[0042] 步驟八，選擇生長一致的用于遺傳轉(zhuǎn)化的試管苗幼葉作為外植體，用無菌刀片垂 直于葉片中脈橫切2~4個(gè)傷口，葉片正面朝上接種于不定芽誘導(dǎo)的再生培養(yǎng)基上，暗環(huán)境 下預(yù)培養(yǎng)5天；
[0043] 步驟九，將預(yù)培養(yǎng)的外植體葉片浸入含轉(zhuǎn)化載體的農(nóng)桿菌侵染液中10-30分鐘，其 中農(nóng)桿菌菌液0D6Q() = 0.6-0.8，將吸干水分的外植體葉片繼續(xù)接種到再生培養(yǎng)基上，黑暗條 件下共培養(yǎng)2天后，將外植體葉片轉(zhuǎn)接到含10mg/L卡那霉素篩選劑與200mg/L頭孢霉素脫菌 劑的再生培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性苗篩選，暗環(huán)境培養(yǎng)7天后，轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25 ± 2 °C，將在含卡那霉素的再生培養(yǎng)基上能夠正常生長的植株初步確定為轉(zhuǎn)基因抗性植株。其 中，不同預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)時(shí)間對轉(zhuǎn)化效率的影響如表3所示。
[0044] 表 3
[0046]由表3可得出，預(yù)培養(yǎng)5天，共培養(yǎng)2天的培養(yǎng)條件能夠獲得最多的抗性植株，而經(jīng) 檢測，雖有假陽性植株存在，但轉(zhuǎn)化效率較高，為11.93%。
[0047]步驟十，待轉(zhuǎn)基因抗性植株長到2.5-3.5cm時(shí)，將其轉(zhuǎn)接到含5mg/L卡那霉素篩選 劑的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，將能夠在含卡那霉素培養(yǎng)基上生根的植株確定為轉(zhuǎn)基因 陽性植株，生根培養(yǎng)基為1/2MS+吲哚丁酸（IBA)0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.0g/L，pH值為 5.8。其中，不同濃度生長素對不定根的誘導(dǎo)情況如表4所示。
[0048]表 4
[0050]如表4所示的，為不同濃度生長素對不定根的誘導(dǎo)情況，在IBA含量為0.5mg/L時(shí)， 秋子梨生根誘導(dǎo)率最高，為45.5%。
[0051]當(dāng)然，以上說明僅僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，本發(fā)明并不限于列舉上述實(shí)施例，應(yīng) 當(dāng)說明的是，任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本說明書的教導(dǎo)下，所做出的所有等同替代、明 顯變形形式，均落在本說明書的實(shí)質(zhì)范圍之內(nèi)，理應(yīng)受到本發(fā)明的保護(hù)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于梨同源轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證材料的篩選方法，其包括以下步驟： (1) 秋子梨再生最適個(gè)體篩選方法 A、 選擇田間性狀表現(xiàn)優(yōu)良的多株秋子梨單株，分別于果實(shí)成熟時(shí)期采果取種，并對種 子進(jìn)行層積處理； B、 將完成層積處理的種子，流水洗凈，用2%的次氯酸鈉溶液消毒處理10分鐘，無菌水 沖洗干凈后將種子播種于MS+蔗糖30g/L+瓊脂6.0-7.0g/L，PH5.8-6.0的培養(yǎng)基上； C、 待種子萌發(fā)至長出6-8片真葉后，分別將每株實(shí)生苗的真葉剪下，剪成5mmX5mm外植 體，并于葉脈處橫切2-4個(gè)傷口，將葉片正面朝上接種于誘導(dǎo)梨屬植物不定芽的通用再生培 養(yǎng)基上，在25 ± 2°C條件下暗培養(yǎng)2周，通用再生培養(yǎng)基為NN69+噻苯?。═DZ)3.0mg/L+吲噪 丁酸（IBA) 0 · 3mg/L+蔗糖 40g/L+瓊脂 6 · Og/L，PH5 · 8; D、 在步驟C的暗培養(yǎng)結(jié)束后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)，在光下培養(yǎng)過程中觀察每株實(shí)生苗的外植 體愈傷組織和不定芽產(chǎn)生情況，將不定芽產(chǎn)生速度快、數(shù)量多、狀態(tài)好的外植體對應(yīng)單株作 為秋子梨再生的初選單株材料； E、 將步驟D中初選材料誘導(dǎo)出的不定芽接種于增殖培養(yǎng)基上，使芽盡快長成健壯的嫩 梢，并進(jìn)行適當(dāng)增殖； F、 對已經(jīng)進(jìn)行芽增殖培養(yǎng)的初選材料，再次分別取嫩梢幼葉按照步驟C、步驟D的操作 進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，然后將不定芽產(chǎn)生速度最快、數(shù)量最多、狀態(tài)最好的外植體作為遺傳轉(zhuǎn)化 的候選單株材料;將候選材料誘導(dǎo)出的不定芽按照步驟E的操作進(jìn)行芽增殖培養(yǎng)，獲得大量 候選材料試管苗； (2) 秋子梨轉(zhuǎn)基因植株獲得方法 G、 最適再生培養(yǎng)基的篩選:在通用培養(yǎng)基基礎(chǔ)上調(diào)整激素配比，篩選出最適于秋子梨 候選單株材料的再生培養(yǎng)基； H、 預(yù)培養(yǎng):選擇生長一致的用于遺傳轉(zhuǎn)化的試管苗幼葉作為外植體，用無菌刀片垂直 于葉片中脈橫切2~4個(gè)傷口，葉片正面朝上接種于不定芽誘導(dǎo)的再生培養(yǎng)基上，暗環(huán)境下 預(yù)培養(yǎng)5天； I、 侵染:將預(yù)培養(yǎng)的外植體葉片浸入含轉(zhuǎn)化載體的農(nóng)桿菌侵染液中10-30分鐘，其中農(nóng) 桿菌菌液OD6〇〇 = 0.6~0.8 ； J、 共培養(yǎng)：將吸干水分的外植體葉片繼續(xù)接種到再生培養(yǎng)基上，黑暗條件下共培養(yǎng)2 天； K、 脫菌篩選培養(yǎng):將外植體葉片轉(zhuǎn)接到含10mg/L卡那霉素篩選劑與200mg//L頭孢霉素 脫菌劑的再生培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性苗篩選，暗培養(yǎng)7天后，轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25±2 °C，將在含卡那霉素的再生培養(yǎng)基上能夠正常生長的植株初步確定為轉(zhuǎn)基因抗性植株； L、 生根培養(yǎng):待轉(zhuǎn)基因抗性植株長到2.5-3.5cm時(shí)，將其轉(zhuǎn)接到含5mg//L卡那霉素篩選 劑的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，將能夠在含卡那霉素培養(yǎng)基上生根的植株確定為轉(zhuǎn)基因 陽性植株，生根培養(yǎng)基為1/2MS+吲哚丁酸（IBA)0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.0g/L，pH值為 5 · 8〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，上述步驟（1)中通過單株采果取種、單 株播種以及多輪再生培養(yǎng)方式篩選秋子梨再生最適個(gè)體。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，上述步驟（1)與步驟G中先利用梨屬植 物通用再生培養(yǎng)基篩選秋子梨再生最適個(gè)體作為候選材料，再利用候選材料在通用培養(yǎng)基 基礎(chǔ)上篩選再生效率最高的再生培養(yǎng)基。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，上述步驟E中增殖培養(yǎng)基為MS+6-芐氨 基嘌呤(6-BA) 1 ·Omg/L+吲哚丁酸（IBA)O· lmg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6·0-7·Og/L，培養(yǎng)基pH值 為5.8-6.0。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述步驟G、H、J和K中再生培養(yǎng)基為 NN69+噻苯?。═DZ) 3 · 0mg/L+吲哚丁酸（IBA) 0 · 3mg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂 6 · Og/L，PH5 · 8。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述步驟K和L中篩選劑卡那霉素濃度 分別為l〇mg/L和5mg/L。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述步驟L中生根培養(yǎng)基為1/2MS+吲 哚丁酸（IBA) 0 · 5mg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂 6 · Og/L，PH5 · 8。
【文檔編號】A01H4/00GK105850740SQ201610242856
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月19日
【發(fā)明人】王然, 楊英杰, 李鼎立, 張梅, 李健楠
【申請人】青島農(nóng)業(yè)大學(xué)