一種枸杞花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基及花培育種方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種枸杞花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基及花培育種方法，屬于枸杞的組織培養(yǎng)領(lǐng)域。本發(fā)明所篩選的枸杞花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有大量元素、微量元素、鐵鹽及絡(luò)合劑、有機成分、無機添加物、植物生長調(diào)節(jié)劑、生理活性物質(zhì)、碳源、凝固劑及其它添加物等。本發(fā)明的枸杞花培育種方法步驟包括：花蕾取材與低溫處理、培養(yǎng)基的配制、花藥接種、變溫誘導(dǎo)培養(yǎng)、分化與生根、馴化與移栽等。采用本發(fā)明對枸杞花藥進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，可以有效提高花藥愈傷誘導(dǎo)率，所獲得的枸杞花藥愈傷質(zhì)量高，可以在短期內(nèi)形成大量優(yōu)良的試管苗，大大加快了枸杞育種進程。本發(fā)明不僅可以用于枸杞花培育種，還可以應(yīng)用于枸杞離體快繁、種質(zhì)保存等領(lǐng)域。
【專利說明】
一種枸杞花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基及花培育種方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種枸杞花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基及花培育種方法，具體涉及一種可以有效提 高枸杞花藥愈傷組織誘導(dǎo)率、花培質(zhì)量好的枸杞花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基及花培育種方法，屬于枸 杞的組織培養(yǎng)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 枸杞(Lycium Barbarum. L)，為前科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium)植物，全世界 約有80個種，廣泛分布于南北美洲、歐亞大陸、非洲和太平洋諸島。我國枸杞屬植物記錄有7 個種和2個變種，即枸杞及其變種北方枸杞、寧夏枸杞及其變種黃果枸杞、新疆枸杞、黑果枸 杞、截萼枸杞、云南枸杞、柱筒枸杞。枸杞屬植物主要分布在西北和華北的三個地區(qū)，一是甘 肅的張掖一帶，產(chǎn)品稱"甘枸杞"；二是寧夏中衛(wèi)、中寧等地，產(chǎn)品稱"西枸杞"；三是天津地 區(qū)，產(chǎn)品稱"津枸杞"。其中，寧夏枸杞品質(zhì)為最佳，只有寧夏枸杞被《中國藥典》收錄作為藥 用枸杞的基原植物。目前，生產(chǎn)上主栽枸杞品種主要是以寧夏枸杞為育種材料培育的系列 品種，種植規(guī)模較大的地區(qū)主要有寧夏、甘肅、青海、新疆、內(nèi)蒙古等地。
[0003] 枸杞是我國一味傳統(tǒng)常用中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，謂之："久服堅 筋骨，輕身不老，耐寒暑"。枸杞果實亦是一種"藥食同源"的功能保健性食品，也是一味常用 的補肝益腎中藥，其色鮮紅，味酸甜。枸杞子味甘、性平、歸肝、腎經(jīng)，具有滋補肝腎、益精明 目、潤肺止咳、延緩衰老等功效。近年來，隨著人們對養(yǎng)生保健的重視，枸杞加工的研究越來 越深入。傳統(tǒng)枸杞產(chǎn)品，如枸杞汁、枸杞醋和枸杞酒的工藝逐漸改進;枸杞多糖、黃酮和籽油 提取產(chǎn)品，枸杞干制品和枸杞復(fù)合產(chǎn)品開發(fā)已成為枸杞加工業(yè)研究的熱點。
[0004] 隨著枸杞藥用保健價值的進一步開發(fā)，枸杞的栽培面積不斷擴大，逐漸成為西北 地區(qū)主要經(jīng)濟樹種之一。常規(guī)育種方法已不能滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)對枸杞品種改良的需求，而培 育枸杞新品種的新方法很少。目前，單倍體育種方法中的通過采用花藥培養(yǎng)得到單倍體植 株后經(jīng)加倍產(chǎn)生純合二倍體的花培育種具有極早穩(wěn)定分離后代、縮短育種年限、簡化選育 程序等優(yōu)點，對枸杞品種創(chuàng)新具有極其重要的意義。
[0005] 在枸杞花培育種研究上，波蘭學(xué)者Zenkteler最早采用分布于東南歐的濱藜葉枸 杞誘導(dǎo)出了花粉植株。我國枸杞單倍體育種始于20世紀(jì)80年代，中科院植物研究所顧淑榮 研究員首次獲得寧夏枸杞花粉植株，樊映漢等通過胚狀體途徑獲得兩種枸杞植物花藥單倍 體，曹有龍等通過枸杞花藥愈傷組織細胞懸浮培養(yǎng)獲得了再生植株，這些研究為枸杞花藥 培養(yǎng)影響因素的發(fā)現(xiàn)、純合花培育種材料和突變株的獲得奠定了基礎(chǔ)。
[0006] 目前，雖然枸杞花藥培養(yǎng)取得了不小的進展，但總體而言，枸杞花藥培養(yǎng)技術(shù)尚存 在胚狀體誘導(dǎo)率偏低、花培技術(shù)尚不完善的缺陷，限制了枸杞花藥培養(yǎng)在遺傳和育種中的 應(yīng)用和發(fā)展。但是隨著研究的不斷深入和培養(yǎng)基的不斷調(diào)整，枸杞花藥培養(yǎng)應(yīng)該向著更能 克服各種限制因素的方向發(fā)展。深入研究枸杞花藥培養(yǎng)的影響因素(基本培養(yǎng)基、激素、活 性碳、溫度、甘露醇預(yù)處理），優(yōu)化枸杞花藥培養(yǎng)的條件，建立一套適合枸杞花藥培養(yǎng)的技術(shù) 體系，對提高枸杞育種效率和推動我國枸杞產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是針對當(dāng)前枸杞花培育種存在的花培愈傷組織誘導(dǎo)率偏低、花培技 術(shù)不完善的缺陷，提供了一種可以有效提高枸杞花藥愈傷組織誘導(dǎo)率、花培質(zhì)量好的枸杞 花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基及花培育種方法。
[0008] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下： 一種枸杞花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于按每升蒸餾水中由以下物質(zhì)配制而成：KN03 900~1100mg/L，NH4N〇3 900~1100mg/L，KH2P〇4 270~330mg/L，Ca(N〇3)2_4H20 330~ 360mg/L，KC160~70mg/L，Na2-EDTA.2H20 70~80mg/L，F(xiàn)eS04.7H20 50~60mg/L，MnS04. 4H2〇4.0~5.0mg/L，ZnS〇4.7H2〇2.1~2.3mg/L，H3B〇3 2.3~2.7mg/L，KIl.l~1.3mg/L， CuS〇4.5H20 0.02~0.03mg/L，CoC1.6H2〇 0.02~0.03mg/L，NaMo〇4.2H2〇 0.2~0.3mg/L， AgN03 23~27mg/L，肌醇 90~110mg/L，維生素 B1 0.09~0.11mg/L，維生素 B6 0.09~ 0.11mg/L，煙酸 0.45~0.55mg/L，維生素 C 28~32_ol/L，胰島素 2.3~2.7mg/L，葉酸 0.18~0.22mg/L，甘氨酸 1.8~2.2mg/L，脯氨酸 0.3~0.4mg/L，天冬氨酸 0.35~0.45g/ L，N-甲基-亞硝基脲30~36mg/L，麥芽糖25~30g/L，果糖15~20g/L，瓊脂6.5~7.5g/ L; 2，4-D 0 ? 5~0 ? 7mg/L，復(fù)酞核酸0 ? 2~0 ? 3mg/L，比久0 ? 5~0 ? 6mg/L，甘露醇25~35g/L，水 解蛋白0.25~0.35g/L，活性炭0.35~0.45g/L，枸杞根提取液35~45g/L。
[0009] 按每升蒸餾水中含有以下物質(zhì)配制的最佳含量為：KN〇3 1000mg/L，NH4N03 1000mg/L，KH2P〇4 300mg/L，Ca(N〇3)2.4H20 345mg/L，KCl 65mg/L，Na2-EDTA.2H2〇 75mg/L， FeS〇4.7H20 55mg/L，MnS〇4.4H20 4.5mg/L，ZnS〇4.7H20 2.2mg/L，H3B03 2.5mg/L，KI 1.2mg/ L，CuS〇4_5H20 0.025mg/L，CoCl_6H20 0.025mg/L，NaMo〇4_2H20 0.25mg/L，AgN03 25mg/L，肌 醇 100mg/L，維生素B1 0.1mg/L，維生素B6 0.1mg/L，煙酸 0.5mg/L，維生素C 30iimol/L，胰 島素2.5mg/L，葉酸0.2mg/L，甘氨酸2.0mg/L，脯氨酸0.35mg/L，天冬氨酸0.4g/L，N-甲 基-亞硝基脲33mg/L，麥芽糖27.5g/L，果糖17.5g/L，瓊脂7g/L;2,4-D 0.6mg/L，復(fù)酞核 酸0 ? 25mg/L，比久0 ? 55mg/L，甘露醇30g/L，水解蛋白0 ? 3g/L，活性炭0 ? 4g/L，枸杞根提取 液 40g/L。
[0010] 所述的枸杞根提取液的獲取方法為：將枸杞根洗凈后稱取30g，切成碎片，加入 100ml蒸餾水，煮沸30min，用4~6層紗布過濾靜置，待沉淀后將取上清液。
[0011] 所述的無機添加物N-甲基-亞硝基脲的添加方法為:配制好N-甲基-亞硝基脲溶液 后，用滅菌的0.22mi的微孔濾膜過濾滅菌，待培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌后冷凝到45~55°C時，取 出置于超凈工作臺中，無菌操作，加入N-甲基-亞硝基脲溶液，搖勻冷凝，48h內(nèi)接種。
[0012] 所述的培養(yǎng)基配方的配制PH值為:5.6~6.0，最佳配制pH值為5.8。
[0013] -種枸杞花培育種方法，其特征在于按如下步驟操作： (1) 花蕾取材與低溫處理 在大田常規(guī)栽培的枸杞處于初花期或盛花期時，上午9點~11點采集生長健壯、無病蟲 害的植株上取發(fā)育時期處于單核中晚期的花蕾為試材，將采集的花蕾用濕紗布包裹后再用 自封塑料袋套起，置于4°C冰箱低溫處理2~7d; (2) 培養(yǎng)基的配制 將權(quán)利要求1、2、3、4和5所述的培養(yǎng)基配制好后分裝于200ml的三角瓶中，每瓶盛40ml ~60ml的培養(yǎng)基，密封后置于溫度為121°C、壓力為15kPa高壓蒸汽條件下滅菌20min，冷凝 到45~55°C時，取出置于超凈工作臺中，無菌操作，加入N-甲基-亞硝基脲溶液，搖勻冷凝， 48h內(nèi)備用； (3) 花藥接種 取出低溫處理后的花蕾，先用流水沖洗1~2 min，用鑷子剝?nèi)セū?，?0%酒精中浸泡 l〇s，用無菌水沖洗2~3次，再用0.1%升汞+2滴吐溫-80溶液浸泡lOmin，無菌水沖洗4~6次 后將花蕾放入覆有濾紙的滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，在無菌條件下用消過毒的鑷子剝?nèi)』ㄋ帲臃N于 步驟2配制好的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每瓶接種4~6個花蕾的花藥； (4) 變溫誘導(dǎo)培養(yǎng) 將接種花藥后的培養(yǎng)基置于溫度25~27°C的環(huán)境下暗培養(yǎng)1.5~2.5d，然后轉(zhuǎn)入37~ 39°C高溫、黑暗條件下熱激處理2~3d，然后轉(zhuǎn)入溫度為27~29°C、濕度為75%~80%黑暗條 件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)出花藥愈傷； (5) 分化與生根 待愈傷長至直徑2cm后，挑選淡黃色松散型的愈傷組織轉(zhuǎn)接入分化培養(yǎng)基上進行分化 培養(yǎng)，愈傷逐漸分化出綠苗，將苗長高于2.5cm的綠苗帶根切下，轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基上生根 壯苗； (6) 馴化與移栽 待試管苗長到3~5葉齡時，將封口膜打開馴化煉苗，7~10d后將試管苗取出，將根部清 洗干凈，移栽入含有草炭土的營養(yǎng)缽中，經(jīng)常澆水，保持濕度，小苗長大后，移栽到大田，常 規(guī)栽培。
[0014] 所述步驟(5)分化與生根的培養(yǎng)條件為:溫度24~26°C、濕度為70%~80%、光照強 度1800~23001ux、光周期12h光/12h暗。
[0015]所述步驟(5)中生根培養(yǎng)基的配方為:MS基本培養(yǎng)基+0.5g/L活性炭+1.0mg/L多效 唑。
[0016] 本發(fā)明提供的枸杞花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基及花培育種方法特異性針對了枸杞花藥培養(yǎng) 的要求。采用本發(fā)明對枸杞花藥進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，可以有效提高花藥愈傷誘導(dǎo)率，所獲得的枸 杞花藥愈傷質(zhì)量高，可以在短期內(nèi)形成大量優(yōu)良的試管苗，大大加快了枸杞育種進程。本發(fā) 明不僅可以用于枸杞花培育種，還可以應(yīng)用于枸杞離體快繁、種質(zhì)保存等領(lǐng)域。
【具體實施方式】
[0017] 下面結(jié)合實施案例對本發(fā)明作進一步說明，而非限制本發(fā)明。
[0018] 實施例 配制本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基： 2014年選取枸杞品種寧杞3號和黃果枸杞作為花藥培養(yǎng)花藥供體，配制本發(fā)明所述枸 杞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，采用本發(fā)明的花培育種方法進行花藥培養(yǎng)，具體步驟如下： (1)花蕾取材與低溫處理 在大田常規(guī)栽培的寧杞3號和黃果枸杞處于初花期或盛花期時，上午9點~11點采集生 長健壯、無病蟲害的植株上取發(fā)育時期處于單核中晚期的花蕾為試材，將采集的花蕾用濕 紗布包裹后再用自封塑料袋套起，置于4°C冰箱低溫處理2~7d; (2) 培養(yǎng)基的配制 按照最佳配方：KN〇3 1000mg/L，NH4N03 1000mg/L，KH2P〇4 300mg/L，Ca(N〇3)2.4H20 345mg/L，KCl 65mg/L，Na2-EDTA.2H2〇 75mg/L，F(xiàn)eS〇4.7H20 55mg/L，MnS〇4.4H20 4.5mg/L， ZnS〇4.7H20 2.2mg/L，H3B03 2.5mg/L，KI 1.2mg/L，CuS〇4.5H20 0.025mg/L，CoC1.6H2〇 0.025mg/L，NaMo〇4.2H2〇 0.25mg/L，AgN03 25mg/L，肌醇 100mg/L，維生素B1 O.lmg/L，維生 素B6 O.lmg/L，煙酸 0.5mg/L，維生素C 30wiiol/L，胰島素 2.5mg/L，葉酸 0.2mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，脯氨酸0.35mg/L，天冬氨酸0.4g/L，N-甲基-亞硝基脲33mg/L，麥芽糖27.5g/ L，果糖 17.5g/L，瓊脂 7g/L;2,4-D 0.6mg/L，復(fù)酞核酸0.25mg/L，比久0.55mg/L，甘露醇 30g/L，水解蛋白0.3g/L，活性炭0.4g/L，枸杞根提取液40g/L(枸杞根提取液的獲取方法 為:將枸杞根洗凈后稱取30g，切成碎片，加入100ml蒸餾水，煮沸30min，用4~6層紗布過濾 靜置，待沉淀后將取上清液）；按此配方配制枸杞花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基，pH值控制為5.8。將培養(yǎng) 基配制好后分裝于200ml的三角瓶中，每瓶盛40ml~60ml的培養(yǎng)基，密封后置于溫度為121 °C、壓力為15kPa高壓蒸汽條件下滅菌20min，冷凝到45~55°C時，取出置于超凈工作臺中， 無菌操作，加入N-甲基-亞硝基脲溶液，搖勻冷凝，48h內(nèi)備用； (3) 花藥接種 取出低溫處理后的花蕾，先用流水沖洗1~2 min，用鑷子剝?nèi)セū?0%酒精中浸泡 l〇s，用無菌水沖洗2~3次，再用0.1%升汞+2滴吐溫-80溶液浸泡lOmin，無菌水沖洗4~6次 后將花蕾放入覆有濾紙的滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，在無菌條件下用消過毒的鑷子剝?nèi)』ㄋ?，接種于 步驟2配制好的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每瓶接種4~6個花蕾的花藥； (4) 變溫誘導(dǎo)培養(yǎng) 將接種花藥后的培養(yǎng)基置于溫度25~27°C的環(huán)境下暗培養(yǎng)1.5~2.5d，然后轉(zhuǎn)入37~ 39°C高溫、黑暗條件下熱激處理2~3d，然后轉(zhuǎn)入溫度為27~29°C、濕度為75%~80%黑暗條 件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)出花藥愈傷，統(tǒng)計花藥愈傷組織誘導(dǎo)率； (5) 分化與生根 待愈傷長至直徑2cm后，挑選淡黃色松散型的愈傷組織轉(zhuǎn)接入分化培養(yǎng)基上進行分化 培養(yǎng)，愈傷逐漸分化出綠苗，此時統(tǒng)計花藥愈傷組織綠苗分化率;將苗長高于2.5cm的綠苗 帶根切下，轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基上生根壯苗(生根培養(yǎng)基的配方為:MS基本培養(yǎng)基+0.5g/L活 性炭+1.0mg/L多效唑），培養(yǎng)條件控制為:溫度24~26°C、濕度為70%~80%、光照強度1800~ 23001ux、光周期 12h 光/12h 暗； (6) 馴化與移栽 待試管苗長到3~5葉齡時，將封口膜打開馴化煉苗，7~10d后將試管苗取出，將根部清 洗干凈，移栽入含有草炭土的營養(yǎng)缽中，經(jīng)常澆水，保持濕度，小苗長大后，移栽到大田，常 規(guī)栽培，一個月后統(tǒng)計移栽成活率。
[0019]枸杞品種寧杞3號和黃果枸杞花藥愈傷組織誘導(dǎo)率、綠苗分化率和移栽成活率統(tǒng) 計結(jié)果如下表所示。
[0020]由上表可以發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供的枸杞花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基及花培育種方法對枸杞品種 寧杞3號和黃果枸杞的花藥愈傷組織誘導(dǎo)率均值高達20.9%，花藥愈傷綠苗分化率均值高達 49.5%，移栽成活率達到97.7%，可以發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的枸杞花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基及花培育種方法非 常適合枸杞花藥培養(yǎng)的要求，我們的研究結(jié)果填補了有產(chǎn)業(yè)應(yīng)用價值的枸杞花藥培養(yǎng)育種 技術(shù)的空白，而且本發(fā)明不僅可以用于枸杞花培育種，還可以應(yīng)用于枸杞離體快繁、種質(zhì)保 存等領(lǐng)域。
[0021]本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容和所掌握的本領(lǐng)域技術(shù)對本發(fā)明內(nèi) 容作出替換或變型，但是這些替換或變型都不應(yīng)視為脫離本發(fā)明構(gòu)思的，這些替換或變型 均在本發(fā)明要求保護的權(quán)利范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種枸杞花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于按每升蒸餾水中由以下物質(zhì)配制而成:kn〇3 900~1100mg/L，NH4N0 3 900~1100mg/L，KH2P〇4 270~330mg/L，Ca(N〇3)2_4H20 330~ 360mg/L，KC160~70mg/L，Na2-EDTA.2H20 70~80mg/L，F(xiàn)eS04.7H20 50~60mg/L，MnS04· 4H2〇4.0~5.0mg/L，ZnS〇4.7H2〇2.1~2.3mg/L，H3B〇3 2.3~2.7mg/L，KIl.l~1.3mg/L， CuS〇4.5H20 0.02~0.03mg/L，CoC1.6H2〇 0.02~0.03mg/L，NaMo〇4.2H2〇 0.2~0.3mg/L， AgN03 23~27mg/L，肌醇 90~110mg/L，維生素B1 0.09~0.11mg/L，維生素B6 0.09~ 0.11mg/L，煙酸 0.45~0.55mg/L，維生素C 28~32ymol/L，胰島素 2.3~2.7mg/L，葉酸 0.18~0.22mg/L，甘氨酸 1.8~2.2mg/L，脯氨酸 0.3~0.4mg/L，天冬氨酸 0.35~0.45g/ L，N-甲基-亞硝基脲30~36mg/L，麥芽糖25~30g/L，果糖15~20g/L，瓊脂6.5~7.5g/ L; 2，4-D 0 · 5~0 · 7mg/L，復(fù)酞核酸0 · 2~0 · 3mg/L，比久0 · 5~0 · 6mg/L，甘露醇25~35g/L，水 解蛋白0.25~0.35g/L，活性炭0.35~0.45g/L，枸杞根提取液35~45g/L。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的枸杞花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于按每升蒸餾水中含有以 下物質(zhì)配制的最佳含量為：KN〇3 1000mg/L，NH4N03 1000mg/L，KH2P〇4 300mg/L，Ca(N03)2· 4H20 345mg/L，KCl 65mg/L，Na2-EDTA_2H2〇 75mg/L，F(xiàn)eS〇4_7H20 55mg/L，MnS〇4_4H20 4.5mg/L，ZnS〇4.7H20 2.2mg/L，H3B03 2.5mg/L，KI 1.2mg/L，CuS〇4.5H20 0.025mg/L，CoCl· 6H2O 0.025mg/L，NaMo〇4.2H20 0.25mg/L，AgN03 25mg/L，肌醇 100mg/L，維生素B1 O.lmg/ L，維生素B6 0.1mg/L，煙酸 0.5mg/L，維生素C 30ymol/L，胰島素 2.5mg/L，葉酸 0.2mg/L， 甘氨酸2.0mg/L，脯氨酸0.35mg/L，天冬氨酸0.4g/L，N-甲基-亞硝基脲33mg/L，麥芽糖 27.5g/L，果糖 17.5g/L，瓊脂 7g/L;2,4-D 0.6mg/L，復(fù)酞核酸0.25mg/L，比久0.55mg/L，甘 露醇30g/L，水解蛋白0.3g/L，活性炭0.4g/L，枸杞根提取液40g/L。3. 根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的枸杞花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于:所述的枸杞根提取 液的獲取方法為:將枸杞根洗凈后稱取30g，切成碎片，加入100ml蒸餾水，煮沸30min，用4~ 6層紗布過濾靜置，待沉淀后將取上清液。4. 根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的枸杞花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于:所述的無機添加物 N-甲基-亞硝基脲的添加方法為:配制好N-甲基-亞硝基脲溶液后，用滅菌的0.22μπι的微孔 濾膜過濾滅菌，待培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌后冷凝到45~55°C時，取出置于超凈工作臺中，無菌 操作，加入N-甲基-亞硝基脲溶液，搖勻冷凝，48h內(nèi)接種。5. 根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的枸杞花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于:所述的培養(yǎng)基配方 的配制pH值為:5.6~6.0，最佳配制pH值為5.8。6. -種枸杞花培育種方法，其特征在于按如下步驟操作： (1) 花蕾取材與低溫處理 在大田常規(guī)栽培的枸杞處于初花期或盛花期時，上午9點~11點采集生長健壯、無病蟲 害的植株上取發(fā)育時期處于單核中晚期的花蕾為試材，將采集的花蕾用濕紗布包裹后再用 自封塑料袋套起，置于4°C冰箱低溫處理2~7d; (2) 培養(yǎng)基的配制 將權(quán)利要求1、2、3、4和5所述的培養(yǎng)基配制好后分裝于200ml的三角瓶中，每瓶盛40ml ~60ml的培養(yǎng)基，密封后置于溫度為121°C、壓力為15kPa高壓蒸汽條件下滅菌20min，冷凝 到45~55°C時，取出置于超凈工作臺中，無菌操作，加入N-甲基-亞硝基脲溶液，搖勻冷凝， 48h內(nèi)備用； (3) 花藥接種 取出低溫處理后的花蕾，先用流水沖洗1~2 min，用鑷子剝?nèi)セū?0%酒精中浸泡 l〇s，用無菌水沖洗2~3次，再用0.1%升汞+2滴吐溫-80溶液浸泡lOmin，無菌水沖洗4~6次 后將花蕾放入覆有濾紙的滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，在無菌條件下用消過毒的鑷子剝?nèi)』ㄋ帲臃N于 步驟2配制好的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每瓶接種4~6個花蕾的花藥； (4) 變溫誘導(dǎo)培養(yǎng) 將接種花藥后的培養(yǎng)基置于溫度25~27°C的環(huán)境下暗培養(yǎng)1.5~2.5d，然后轉(zhuǎn)入37~ 39°C高溫、黑暗條件下熱激處理2~3d，然后轉(zhuǎn)入溫度為27~29°C、濕度為75%~80%黑暗條 件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)出花藥愈傷； (5) 分化與生根 待愈傷長至直徑2cm后，挑選淡黃色松散型的愈傷組織轉(zhuǎn)接入分化培養(yǎng)基上進行分化 培養(yǎng)，愈傷逐漸分化出綠苗，將苗長高于2.5cm的綠苗帶根切下，轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基上生根 壯苗； (6) 馴化與移栽 待試管苗長到3~5葉齡時，將封口膜打開馴化煉苗，7~10d后將試管苗取出，將根部清 洗干凈，移栽入含有草炭土的營養(yǎng)缽中，經(jīng)常澆水，保持濕度，小苗長大后，移栽到大田，常 規(guī)栽培。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的枸杞花培育種方法，其特征在于:所述步驟(5)分化與生根的 培養(yǎng)條件為：溫度24~26°C、濕度為70%~80%、光照強度1800~23001ux、光周期12h光/12h 暗。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的枸杞花培育種方法，其特征在于:所述步驟(5)中生根培養(yǎng)基 的配方為:MS基本培養(yǎng)基+0.5g/L活性炭+1. Omg/L多效唑。
【文檔編號】A01H4/00GK105850745SQ201610314204
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月13日
【發(fā)明人】張瑞明, 宋曉燕, 潭江
【申請人】連云港秀景園林綠化工程有限公司