一種非酒精性脂肪肝小鼠模型的建立方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及非酒精性脂肪肝病動物模型的建立，具體為伴有肥胖、血脂異常和胰島素抵抗等特征的由高脂誘導的非酒精性脂肪肝病動物模型的建立。本發(fā)明選用C57BL/6小鼠，隨機分模型組和對照組，適應性喂養(yǎng)后，模型組給予高脂飼料，對照組給予對照飼料，期間每周測量體重一次，10周后取血處死，檢測常規(guī)血脂及肝功能；取鮮活肝測定組織內(nèi)膽固醇與甘油三酯含量；另取肝組織做進行H.E.和油紅O染色，判定NAFLD模型效果與質(zhì)量。本發(fā)明采用高脂高熱量飼料喂養(yǎng)，建立小鼠NAFLD模型，能展現(xiàn)出典型的NAFLD損害，并伴有肥胖，血脂異常和胰島素抵抗等典型特征，不僅為研究其發(fā)病機制提供了方便，還能控制條件排除各種干擾，免除對人體的傷害，以提高復制成功率和縮短病程。
【專利說明】
一種非酒精性脂肪肝小鼠模型的建立方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及非酒精性脂肪肝病(NAFLD)動物模型的建立，具體為伴有肥胖、血脂異 常和胰島素抵抗等特征的由高脂誘導的非酒精性脂肪肝病動物模型的建立。
【背景技術】
[0002] 21世紀以來，肥胖和與之相關的并發(fā)癥已經(jīng)成為醫(yī)學界最流行和最具挑戰(zhàn)性的疾 病之一。肥胖所引起的代謝綜合征，包括高脂血癥，高胰島素血癥，動脈粥樣硬化(AS)和脂 肪肝等，其中脂肪肝又是代謝障礙疾病的綜合表現(xiàn)。
[0003] 非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的主要特征是肝臟中的脂質(zhì)沉積，通常還會伴有肥胖、 胰島素抵抗、高血壓和血脂異常。流行病學觀察NAFLD在世界各地呈現(xiàn)出日益增多的趨勢， 在西方國家中被認為是最普遍的肝臟疾病，大約影響了四分之一人口的身體健康。而近年 來，隨著人們生活水平的提高，飲食結構的不合理，脂肪肝的發(fā)病率有逐年上升的趨勢。
[0004] NAFLD作為一類代謝功能障礙型疾病，其病情演變和發(fā)展時間漫長，這很大程度上 掣肘了人們得到具有合理解釋性的臨床數(shù)據(jù)。為了更全面了解NAFLD的發(fā)生過程，人們逐漸 將注意力轉至發(fā)展合適的動物模型方向來探明NAFLD形成過程。建立一個穩(wěn)定可靠、病理演 變過程符合的NAFLD動物模型，對研究NAFLD的發(fā)病機制及治療方法具有極其重要的意義。
[0005] 非酒精性脂肪肝動物模型大體上可分為兩大類：即影響肝內(nèi)脂肪酸代謝的基因敲 除、突變模型以及環(huán)境因素(飲食與藥物)造成肝內(nèi)脂肪酸合成和氧化不平衡引發(fā)的脂肪肝 模型。前者更側重于研究具有家族史性的肝脂代謝異常，而后者更突出后天獲得性的肝脂 病變?？傊?，一個理想的動物模型應是:①形成率高，死亡率低，重復性好;②造模方法簡便 易行;③與所研究人類疾病特征相似;④病變有一定發(fā)展過程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供一種利用C57BL/6小鼠建立經(jīng)高脂飼料誘導的同時伴有肥胖、血脂異 常和胰島素抵抗等特征的非酒精性脂肪肝病模型的方法。
[0007] 本發(fā)明選用SPF級雄性C57BL/6小鼠，所有小鼠用普通維持飼料適應性喂養(yǎng)1周后， 在分組上，模型組與對照組均采取正態(tài)分布分組方法，即以小鼠體重為依據(jù)，將小鼠劃分為 高、中、低三個體重區(qū)間，將每個區(qū)間隨機分配到模型組和對照組中，模型組和對照組，每組 8只，模型組喂食高脂飼料，對照組喂食對照飼料，在飼養(yǎng)方法上采取單只單籠飼養(yǎng)措施，飼 料定量定投，早晚各一次，維持20g/籠，保證較小的組內(nèi)差異，2-3天換墊料，給籠具消毒。墊 料為刨花木肩，里面含有小木塊(利于小鼠磨牙），要求高壓滅菌，期間每周測量體重一次。 10周后取血處死，檢測常規(guī)血脂(TC、TG、FFA)及肝功能(ALT和AST);取鮮活肝組織勻漿，測 定組織內(nèi)膽固醇與甘油三酯含量；另取肝組織做石蠟、冰凍切片，分別進行H.E.和油紅0染 色，判定NAFLD模型效果與質(zhì)量。
[0008] 本發(fā)明中使用單純性高脂高熱量飼料誘導誘導C57BL/6小鼠，建立非酒精性脂肪 肝模型，完全模擬由于飲食結構發(fā)生改變而導致的人類非酒精性脂肪病，對于探究人類 NAFLD發(fā)病機理及其應對方法有著重要的意義。同時C57BL/6小鼠為近交系小鼠，遺傳背景 高度相似，在一定程度上保證了模型的穩(wěn)定性。
[0009] 本發(fā)明中非酒精性脂肪肝小鼠模型的評價指標包括體重變化指標，葡萄糖耐受檢 測，血清肝功的檢測，肝臟脂質(zhì)水平的檢測，以及肝臟組織病理學的觀測等。
[0010] 本發(fā)明采用高脂高熱量飼料(HFD)喂養(yǎng)，建立小鼠NAFLD模型，這種模型能展現(xiàn)出 典型的NAFLD損害，并伴有肥胖，血脂異常和胰島素抵抗等典型特征，不僅為研究其發(fā)病機 制提供了方便，還能控制條件排除各種干擾，免除對人體的傷害，以提高復制成功率和縮短 病程。
【附圖說明】
[0011] 圖1模型組和對照組小鼠體重變化曲線圖，（Con:對照組;Mod:模型組）；
[0012] 圖2模型組和對照組小鼠造模10周后葡萄糖耐受實驗曲線圖，（Con:對照組;Mod: 模型組）；
[0013]圖3模型組小鼠肝臟病理切片圖(A: H. E.染色;B:油紅0染色）；
[0014]圖4對照組小鼠肝臟病理切片圖（a:H.E.染色;b:油紅0染色）。
【具體實施方式】
[0015] 實施例1本發(fā)明動物模型的制備。
[0016] 1、實驗動物：SPF級雄性C57BL/6小鼠，6~8周齡，體重（22 ± 2) g，購自北京維通利 華實驗動物技術有限公司【SCXK(京)2011-0011】。
[0017] 2、實驗動物均飼養(yǎng)于本部屏障環(huán)境內(nèi)，溫度22~25°C，濕度50%，12小時晝夜交 替。
[0018] 3、實驗動物經(jīng)適應性喂養(yǎng)1周后，在分組上模型組與對照組均采取正態(tài)分布分組 方法，即以小鼠體重為依據(jù)，將小鼠劃分為高、中、低三個體重區(qū)間，將每個區(qū)間隨機分配到 模型組和對照組中，模型組和對照組，每組8只，模型組喂食高脂飼料，對照組喂食對照飼 料，在飼養(yǎng)方法上采取單只單籠飼養(yǎng)措施，飼料定量定投，早晚各一次，維持20g/籠，保證較 小的組內(nèi)差異，2-3天換墊料，給籠具消毒。墊料為刨花木肩，里面含有小木塊(利于小鼠磨 牙），要求高壓滅菌，動物飼料為對照飼料(MD12031)和高脂飼料(MD12032)均購自江蘇美迪 森生物醫(yī)藥有限公司。造模10周，期間自由引水，水源為SPF級的滅菌水，每周稱量體重一 次。
[0019] 4、小鼠體重變化如圖1所示，可見模型組小鼠出現(xiàn)類似人類的肥胖癥狀。
[0020] 5、小鼠處死前一天，先禁食6小時，各組每只老鼠以2g/kg腹腔注射葡萄糖后，在 0min、30min、60min、90min、120min，定時從尾靜脈取血用歐姆龍血糖儀和試紙條測定血糖， 繪制藥物對血糖影響曲線。如圖2所示，模型組小鼠血糖在第30min是達到最高峰，且顯著大 于對照組小鼠，可以判斷模型組出現(xiàn)較大程度的胰島素耐受境況。
[0021] 6、各組同一時間全部處死，處死前禁食12小時。4%水合氯醛腹腔注射麻醉，摘眼 球法取血，過程應避免溶血的發(fā)生，全血37°C靜置1小時，2000g，離心5min取血清，-80 °C保 存，用于血清學指標的檢測。結果如表1所示。
[0022]表1血清生化指標的測定
[0024]注：*p〈0.05vs control，**p〈0.01vs control
[0025] 7、肝臟脂質(zhì)的檢測，具體方法以一只小鼠為例，分別各取lOOmg新鮮肝組織根據(jù)試 劑盒自帶裂解液各加lml進行勻漿，各自勻漿液一部分用來檢測甘油三酯(TG)和總膽固醇 (TC)的含量，另一部分分別測定其蛋白含量，最后必須用每毫克蛋白濃度來校正甘油三酯 (TG)和總膽固醇。甘油三酯（組織)酶法測定試劑盒(E1013)和總膽固醇（組織)含量測定試 劑盒(E1015)購自北京普利萊基因技術有限公司。結果如表2所示 [0026]表2肝臟脂質(zhì)變化表
[0028]注：*p〈0.05vs control，**p〈0.01vs control
[0029] 8、肝臟組織病理學的檢測，具體方法以一只小鼠為例，取肝臟同一部位，分兩份。
[0030] 8a、肝組織石蠟切片制作方法:肝組織-Bouin's固定液固定24h-70%酒精溶液 脫色3次(可長久保存)-依次經(jīng)濃度為80 %、90 %、95 %、100 %酒精梯度脫水-兩次二甲苯 脫酒精-二次石錯透明-包埋-組織塊凝固-切片機切片(4ym)。
[0031] 8b、石蠟切片進行常規(guī)H.E.染色。切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水(依次經(jīng)過如下溶液：二甲 苯X2,無水乙醇X2,95%乙醇X2,90%乙醇，80%乙醇，70%乙醇，50%乙醇，30%乙醇，蒸 餾水X 2，每組溶液浸泡2min);蘇木素染色15min，鹽酸-乙醇分色數(shù)秒，弱堿水返藍數(shù)秒，水 洗;再經(jīng)伊紅染色5min，流水沖洗5min X 2，常規(guī)脫水透明（與上述脫蠟步驟反序操作）。中性 樹膠封片，干燥過夜后，顯微鏡下觀察并記錄。
[0032] 8c、肝組織冰凍切片制作方法：肝組織-4%多聚甲醛固定液固定24h-依次經(jīng) 10 %、20 %、30 %蔗糖溶液(4 %多聚甲醛溶液配)沉底脫水-0. C. T.包埋-液氮速凍-脫模 -調(diào)節(jié)低溫恒冷切片機倉內(nèi)溫度至_22°C-切片（10M1)。
[0033] 8 d、冰凍切片油紅0染色方法：冰凍切片于4 °C P B S溶液中固定3 0 m i n，復性平衡。 60 %異丙醇媒浸2min，油紅染液60 °C染色20min，70 %乙醇分色數(shù)秒，PBS漂洗3次，蘇木精復 染細胞核，甘油明膠封片，干燥過夜后，顯微鏡下觀察并記錄。
[0034] H.E染色顯示，對照組肝組織形態(tài)完整，結構清晰，質(zhì)核飽滿（圖4a);模型組肝組織 形態(tài)全無，脂肪嚴重變性，脂滴大泡和小泡交錯，細胞核被擠到邊緣（圖3a)。油紅0顯示，對 照組脈管周圍有少量脂質(zhì)浸潤（圖4b)，這或許與對照飼料含有10%脂肪含量有關;模型組 視野被大片的紅色占據(jù)，有大量脂質(zhì)囤積，脂滴大而密（圖3b)驗證了 H.E的結果。
[0035]綜上所述，利用C57BL/6小鼠經(jīng)高脂誘導成功建立了伴有肥胖、血脂異常、胰島素 抵抗特征的非酒精性脂肪肝病動物模型。為研究NAFLD發(fā)病機理和治療提供了一個穩(wěn)定可 靠的動物模型。
【主權項】
1. 一種非酒精性脂肪肝小鼠模型的建立方法，其特征在于，建立模型的步驟為： 1) 、選取鼠種：SPF級雄性C57BL/6小鼠，6~8周齡，體重22±2g，飼養(yǎng)于本部屏障環(huán)境 內(nèi)，溫度22~25°C，濕度50%，12小時晝夜交替，適應性喂養(yǎng)1周； 2) 、分組與造模:適應性喂養(yǎng)1周后，在分組上模型組與對照組均采取正態(tài)分布分組方 法，即以小鼠體重為依據(jù)，將小鼠劃分為高、中、低三個體重區(qū)間，將每個區(qū)間隨機分配到模 型組和對照組中，模型組和對照組，每組8只，模型組喂食高脂飼料，對照組喂食對照飼料， 在飼養(yǎng)方法上采取單只單籠飼養(yǎng)措施，飼料定量定投，早晚各一次，維持20g/籠，保證較小 的組內(nèi)差異，2-3天換墊料，給籠具消毒，墊料為刨花木肩，里面含有小木塊，要求高壓滅菌， 造模10周，期間自由引水，水源為SPF級的滅菌水，每周稱量體重一次； 3) 、確定小鼠狀況:小鼠處死前一天，先禁食6小時，各組每只老鼠以2g/kg腹腔注射葡 萄糖后，在〇111；[11、3〇1]1；[11、6〇1]1；[11、9〇1]1；[11、12〇1]1；[11，定時從尾靜脈取血測定血糖，繪制藥物對血 糖影響曲線，模型組小鼠血糖在第30min是達到最高峰，且顯著大于對照組小鼠，可以判斷 模型組出現(xiàn)較大程度的胰島素耐受境況； 4) 、采血與檢測：各組同一時間全部處死，處死前禁食12小時，4%水合氯醛腹腔注射麻 醉，摘眼球法取血，過程應避免溶血的發(fā)生，全血37 °C靜置1小時，2000g，離心5min取血清，-80°C保存，用于血清學指標的檢測； 5) 、肝臟脂質(zhì)的檢測：各組以一只小鼠為例，分別各取100mg新鮮肝組織根據(jù)試劑盒自 帶裂解液各加lml進行勻漿，各自勻漿液一部分用來檢測甘油三酯TG和總膽固醇TC的含量， 另一部分分別測定其蛋白含量，最后必須用每毫克蛋白濃度來校正甘油三酯TG和總膽固醇 TC； 6) 、肝臟組織病理學的檢測：各組以一只小鼠為例，取肝臟同一部位，分兩份，一份進行 石蠟切片，并對其進行H. E.染色，另一份進行冰凍切片，并對其進行油紅0染色； 7) 、對步驟3)-步驟6)進行分析，確定利用C57BL/6小鼠經(jīng)高脂誘導成功建立了伴有肥 胖、血脂異常、胰島素抵抗特征的非酒精性脂肪肝病動物模型。
【文檔編號】A23K20/163GK105850867SQ201610188042
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年3月28日
【發(fā)明人】劉慶平, 路遙, 王仁軍
【申請人】大連大學